Влияние регуляторов роста на морфогенетическую активность экспланотов Dioscorea nipponica Makino и образование полифенолов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Влияние регуляторов роста на морфогенетическую активность экспланотов Dioscorea nipponica Makino и образование полифенолов

Калашникова Е.А.

Зайцева С.М.

Доан Тху Тхуи

Киракосян Р.Н.

Изучали влияние регуляторов роста на морфогенетическую активность различных эксплантов лекарственных растениях рода Диоскореи, а также образование растворимых фенольных соединений. Наилучшие результаты были показаны на питательной среде с ИУК (концентрация 5 мг/л). Интактные растения Dioscorea nipponica Makino и индуцированные на их основе микроклоны обладают высокой способностью к биосинтезу разнообразных фенольных соединений. Органоспецифичность к накоплению полифенолов, характерная для интактного растения, сохраняется и в условиях in vitro, но в менее выраженной степени.

Растения рода Dioscorеa являются ценным источником биологически активных веществ для фармацевтической промышленности. Препараты, изготовленные на основе растительных экстрактов диоскореи проявляют множественное терапевтическое действие, которое обусловлено их способностью к образованию богатого спектра вторичных метаболитов, особенно полифенолов [1]. Диоскорея обладает противоопухолевым, иммуномодулирующим и дерматотоническим действием, снижает содержание холестерина в крови, расширяет периферические сосуды, углубляет дыхание, улучшает проведение импульсов к сердцу по блуждающему нерву [2].

Широкое применение полифенолов в фармакологии основано на их способности к окислению с образованием хинных форм, что обуславливает их гепатопротекторные, нейрорегуляторные, капиляроукрепляющие, желчегонные и противоопухолевые свойства [3]. Однако данных об образовании фенольных соединений в растениях рода Dioscorea немного, а сложность физиолого-биохимических процессов, происходящих в растительных организмах, в том числе и в условиях in virto, остается еще недостаточно изученной.

Одним из перспективных и экономически оправданным методом быстрого размножения растений является клональное микроразмножение. Метод позволяет сохранять ценные виды растений, которые находятся на грани исчезновения или занесены в Красную книгу России. На основе технологий культивирования изолированных клеток, тканей и органов растений in vitro создают генетические банки растительных объектов, которые могут представлять интерес для селекционеров, растениеводов, фитопатологов, фармацевтов и др. Рядом исследователей показано, что коллекция клеток может состоять не только из дифференцированных тканей в виде растений-регенерантов, но и может быть представлена дедифференцированными клетками в виде суспензионных и каллусных культур. Такие коллекции имеют практическое применение для сохранения уникальных генотипов и источников ценных вторичных метаболитов, в частности и веществ фенольной природы [4], [5].

Процессами вторичного метаболизма можно управлять, за счет изменения условий культивирования растительных объектов in vitro, при модификациях гормонального и минерального состава питательной среды, интенсивности и доступности спектрального освещения, температурного режима и др., и тем самым добиваться биосинтеза целевого продукта или его модификаций [6].

Изучение фенольного метаболизма растений в условиях in vitro представляет определенный интерес для физиологов в связи с широким спектром участия этих веществ в таких важных процессах как фотосинтез, дыхание, трансдукция энергии, аллелопатия, защита клеток от патогенов и разных стрессовых факторов [7].

Что касается растений рода Dioscorea, то исследования по изучению фенольного метаболизма в микроклонах, полученных в разных условиях выращивания и дальнейшим сравнении с качественным и количественным составом в интактном растении являются актуальными. Кроме того, исследования данного направления ранее не были проведены с D. nipponica Makino.

Исходя и вышеизложенного целью нашего исследования являлось изучение влияния гормонального состава питательной среды на морфогенетический потенциал различных эксплантов и биосинтез полифенолов.

Исследования проводили на изолированных адвентивных почках, сегментах листовых пластинок и стебля, изолированных как с интактных растений Dioscorea nipponica Makino, так и с микроклонов, кроме того использовали семена и многолетние клубни растений in vivo. Источником первичных эксплантов служили растения, произрастающие на территории Главного ботанического сада РАН им. Н.В. Цицина (участок редких и исчезающих растений).

В работе придерживались общепринятых правил работы в лаборатории и методик, разработанных на кафедре биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева [8]. Культивирование первичных эксплантов осуществляли на питательной среде Мурасига и Скуга с заданными модификациями [8], содержащей 6-бензиламинопурин (БАП) 1 мг/л или 2-изопентиладенин (2 iР) 1 мг/л в сочетании с ауксинами различного происхождения: нафталилуксусная кислота ИУК (1-7 мг/л), индолилмаслянная кислота ИМК (1-7 мг/л). Для укоренения микропобегов применяли Ѕ нормы макросолей по прописи Мурасиге и Скуга, ИУК (1 мг/л), 20 г./л сахарозы, 7 г/л агара.

Первичные экспланты выращивали в условиях световой комнаты, где поддерживалась температура 24⁰С, 16-ти часовой фотопериод, интенсивность освещения 4 000 люк белыми люминсцентными лампами.

Для извлечения фенольных соединений применяли общепринятые методики [9]. Навеску растительного материала измельчали в ступке, а затем подвергали экстракции горячим 96%-ным этанолом. В экстрактах спектрофотометрическим методом определяли полифенолов с построением калибровочных кривых по (-) - эпикатехину и по рутину. В таблицах представлены средние арифметические значения из трех биологических параллельных и их стандартные отклонения. Исследования проводили в 3-х биологических и 3-х аналитических повторностях. На графиках представлены средние арифметические значения с доверительными интервалами на 5%-ом уровне значимости.

В настоящее время большое практическое значение приобретает технология по клональному микроразмножению диоскореи ниппонской. Это связано не только с целью сохранения ее исходных форм в природных условиях, но и возможностью их дальнейшего использования в качестве источников биологически активных веществ и лекарственных препаратов [10].

Процесс морфогенеза зависит от ряда взаимосвязанных факторов: гормональной и физиологической природы объекта, а также от типа первичного экспланта. В работе проведен сравнительный анализ морфогенетического потенциала изолированных листовых эксплантов с сегментами стебля.

Было установлено, что возможно осуществлять размножение in vitro диоскореи ниппонской двумя способами: 1) индукция образования адвентивных почек или микроклубней в базальной части побегов или пазухе листа, 2) образование микропобегов из существующих меристем пазушных почек (Рис. 1). Причем данные морфогенетические процессы зависели от гормонального состава питательной среды и типа первичного экспланта (Рис. 1а, б).

Рис. 1. Реализация морфогенентического потенциала: образование адвентивных микроклубней в базальной части побега (А), в пазухе листа (Б) и образование кореней в базальной части микропобега диоскореи ниппонской (В)

Выявлено, что морфогенетические процессы имеют отклик на гормональный состав питательной среды (рис. 2). Так, например, присутствие в питательной среде БАП в сочетании с НУК оказывало существенное влияние только на формирование в базальной части микропобегов корней (до 6 шт. на 1 эксплант) и не оказывало значительного эффекта на индукцию образования адвентивных почек по сравнению с питательной средой, в которой присутствовал 2ip. Среднее число полученных адвентивных побегов составило 5,5 и 2,7 шт., соответственно. Что касается таких показателей, как формирование микроклубней, то на этот процесс значительное влияние оказывает 2ip. При таких условиях культивирования микроклубни формировались как в базальной части микропобега, так и в пазухе листа (формировались воздушные микроклубни), а на питательной среде с добавлением БАП микроклубни образовывались только в основании микропобега.

Что касается изолированных листовых эксплантов, то не зависимо от гормонального состава среды наблюдалось образование адвентивных почек (2-3 шт.), непосредственно на экспланте или в новообразованной каллусной ткани. Причем частота органогенеза была не высокой и составляла всего 21 и 15% соответственно. Результаты, полученные нами в данной серии исследований, свидетельствуют о том, что листовые экспланты диоскореи ниппонской не целесообразно использовать в качестве первичного экспланта в технологии клонального микроразмножения.

В дальнейшем полученные микроклоны помещались на питательные среды для укоренения, где в качестве индуктора корнеобразования использовали такие ауксины как ИУК или ИМК в концентрации1-7 мг/л.

Рис. 2. Морфометрические показатели диоскореи ниппонской in vitro в зависимости от состава питательной среды

Нами была установлена обратная корреляция между концентрацией гормонов и ростом микропобегов: с увеличением концентрации ауксинов в питательной среде уменьшается рост микрорастений в высоту. (Рис. 3). Данная ответная морфометрическая реакция ярче выражалась на вариантах среды в которой присутствовала ИМК.

Рис. 3. Влияние различных концентраций ИУК и ИМК на формирование надземной части растений диоскореи ниппонской

Что касается интенсивности корнеобразования, то исследуемые ауксины оказали неоднозначное влияние на данный процесс (Рис. 4). Для индолилуксусной кислоты была установлена прямая корреляция: с увеличением концентрации гормона активизировался рост корней. Максимальная длина корневой системы (3,2 см) зарегистрирована в варианте с применением ИУК 5 мг/л. Что касается индолилмаслянной кислоты, то с увеличением ее концентрации рост корней замедляется. Максимальная длина корней (1,9 см) была отмечена в варианте 3 мг/л. Разницу в действии исследуемых ауксинов можно объяснить различным их происхождением. ИУК является природным гормоном, что повышает его доступность клеткам растений), а ИМК - его синтетическим аналог. Вероятно, эти и объясняются такие различия в их действии на наш объект. Кроме того, указанная тенденция была неоднократно отмечена в литературе и обусловлена функционированием различных рецепторных систем, в том числе, особенностью данного фитогормона (ИУК) влиять на биопроцессы проницаемости мембран, поступления воды в клетку, и активность ферментов [11].

диоскорея биосинтез фенольный

Рис. 4. Влияние различных концентраций ИУК и ИМК на длину корневой системы микрорастений диоскореи ниппонской

Известно, что все растения способны к биосинтезу полифенолов, причем некоторые соединения простого строения, такие как фенилпропаноиды, имеют практически всеобщее распространение [7]. Однако исследователями отмечается, что биосинтез полифенолов в растениях происходит с разной интенсивностью и зависит от ряда взаимосвязанных факторов, например, возраста исходного экспланта, типа первичного экспланта, условий выращивания интактного растения и др. В большинстве случаев показано, что наиболее интенсивно биосинтез фенольных соединений происходит в молодых активно вегетирующих органах [12].

Ранее мы установили биосинтетические особенности в различных органах интактных растений диоскореи в отношении накопления полифенолов, в частности, суммы растворимых фенольных соединений (ФС), флаванов (ФЛ) и флавонолов. Показано, что изолированные с интактных растений первичные экспланты (побеги, однолетние корневища, многолетние корневища), обладают очень высокой способностью к синтезу полифенолов, где наибольшее их содержание отмечалось в корневищах. Причем в долговегетирующих многолетних корневищах суммарное содержание ФС было почти вдвое выше по сравнению с содержанием таковых в молодых (Рис. 5).

Рис. 5. Содержание полифенолов в интактных растениях диоскореи ниппонской

Рис. 6. Содержание полифенолов в микроклонах диоскореи наппонской (гормональный состав питательной среды представлен 1,0 мг/л 2 ip+ 1,0 мг/л НУК)

Аналогичные биосинтетические тенденции характерны и для флаванов, одних из наиболее высокореакционных низкомолекулярных веществ, обладающих мощными антиоксидантными свойствами [13]. Относительно флавонолов, следует заметить, то что их содержание было отмечено только в побегах, то есть в зеленых надземных частях растений. Мы связываем это с тем, что в зеленых растительных тканях флаванолы, как правило, являются доминирующими полифенолами, так как их биосинтез приурочен к хлоропластам [14]. Полученные данные согласуются и с результатами других исследователей, а также с ранее полученными нашими данными по диоскорее кавказской (Dioscorea caucasia Lypsky) [15].

На заключительном этапе исследований необходимо определить содержание полифенолов в микроклонах и установить зависимость их содержания от типа исследуемой ткани. Для изучения содержания фенольных соединений в растениях-регенерантах диоскореи ниппонской были взяты микроклоны, инициированные на питательной среде, содержащей 2ip в концентрации 1 мг/л в сочетании с НУК 1 мг/л. Установлено, что наибольшее количество суммы растворимых фенольных соединений отмечалось в микролистьях и микроклубнях, сформированных в основании побегов, а в корнях учитываемый показатель был примерно в 4 раза меньше. Аналогичные результаты были получены и в отношении флаванов. Присутствие флаванолов отмечено только в микролистьях и микроклубнях. В микрокорнях диоскореи их присутствие не обнаружено (Рис. 6). Полученные данные полностью согласуются с результатами нашей работы с интактными растениями in vivo, а также с данными других исследователей [16]. Скорее всего наличие полифенолов в надземной части диокореи играет роль медиаторов в физиолого-биохимических реакциях, а также определяет защиту растений от механических воздействий и патогенов, а растворимые фенольные соединения, находящиеся в многолетних долговегетирующих корневищах, преимущественно являются запасными и регуляторными веществами [17].

Сравнивая результаты исследований по содержанию фенольных соединений в интактных растениях и микроклонах следует обратить внимание, что способность к синтезу вторичных соединений в микроклонах была ниже, чем у исходных интактных тканей.

Таким образом, показано влияние регуляторов роста на морфогенетическую активность различных экспланотов диоскореи, где для формирования надземной части наиболее благоприятным ауксином была ИМК в концентрации 1 мг/л, а для ризогенеза среда с добавлением 5 и 7 мг/л ИМК. Диоскорея ниппонская обладает высокой способностью к биосинтезу разнообразных фенольных соединений, что несомненно имеет важное практическое значение как потенциальный источник ценных биологически активных веществ для фарминдустрии. Выявленные нами различия в накоплении фенольных соединений в разных органах как интактных растений диоскореи ниппонской, так и в условиях in vitro еще раз подтверждают, что биосинтез продуктов вторичного метаболизма характеризуется органоспецифичностью, и указывает на их важную роль, в качестве запасных и физиологически активных веществ [18], [19].

Список литературы

1. Woo K.W. Phenolic derivatives from the rhizomes of Dioscorea nipponica and their anti-neuroinflammatory and neuroprotective activities / K.W. Woo, O.W. Kwon, S.Y. Kim, S.Z. Choi, M.W. Son, K.H. Kim, K.R. Lee // Journal Ethno pharmacology.2014 Sep 11; 155 (2):1164-70. doi: 10.1016/j.jep.2014.06.043. Epub 2014 Jun 25.

2. АлексееваГ.М. Фармакогнозия. Лекарственное сырье растительного и животного происхождения / Г.М. Алексеева, Г.А. Белодубровская, К.Ф. Блинова, М.Ю. Гончаров / под ред. Г.П. Яковлева. - Санкт-Петербург: СпецЛит, 2013.

3. Тюкавкина Н.А. Биофлавоноиды / Н.А. Тюкавкина. - М.: Издательский дом «Русский врач». 2002. - 56 с.

4. Bhaising S.R. Plant tissue culture - a potential source of medicinal compounds / S.R. Bhaising, V.L. Maheshwari // J. Scientific and Industrial research. - 1998. - V. 57. - P. 703-708.

5. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе / Р.Г. Бутенко. - М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.

6. Носов А.М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений / А.М Носов / под ред. Р.Г. Бутенко. - М. Наука. - 1991.

7. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растения / М.Н Запрометов. // LVI Тимирязевские чтения. - М.: Наука. 1996. - 45 с.

8. Калашникова Е.А. Лабораторный практикум по сельскохозяйственной биотехнологии / Е.А. Калашникова, О.Ю. Миронова, Н.В. Лаврова и др. - М.:РГАУ-МСХА, 2004, 134 с.

9. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и методы их исследования / М.Н. Запрометов // Биохимические методы в физиологии растений. Наука, 1971. С. 185-197

10. Si-hong Ou-yang Dioscorea nipponicaMakino: a systematic review on its ethnobotany, phytochemical and pharmacological profiles / Si-hong Ou-yang, Tao Jiang, Lin Zhu, Tao Yi //Chemistry Central Journalvolume 12, Article number: 57 (2018).

11. Ковалев В.М. Скрининг регуляторов роста с целью применения их в биотехнологии в культуре ткани картофеля./ В.М. Ковалев // Тезисы докл. VI Международная конференция «Регуляторы роста и развития в биотехнологиях». - Москва. - 2001. - C. 165

12. Santiago L. Compartmentation of phenolic compounds and phenylalanine ammonia-lyase in ltaves of Phyllanthus tenellus and their induction by copper sulphate / L. Santiago, R. Louro // Annals of botany. - 2000. - V. 86 - P. 1023-1032.

13. Giovanni F. Flavanoids as antioxidants: Localisation and functional significance / Giovanni Fgati, Elisa Azzarello, Susanna Polastri, Massimiliano Tattini // Plant Science 196 (2012) 67-76

14. Запрометов М.Н. Способность изолированных хлоропластов из листьев фасоли осуществлять биосинтез фенольных соединений / М.Н. Запрометов, Т.Н. Николаева // Физиология растений. 2003. - Т. 50. - №5. - С. 699-702.

15. Доан Тху Тхуи О способности микроклонов лекарственных растений на примере Dioscorеa caucasica Lipsky к образованию биофлаваноидов / Доан Тху Тхуи, Е.А. Калашникова, С.М. Зайцева, Р.Н Киракосян // Естественные и технические науки. - 2018. - №2 - С. 38

16. Qunfeng Zhang, Meiya Liu, Jianyun Rua Metabolomics analysis reveals the metabolic and functional roles of flavonoids in light-sensitive tea leaves // Plant Biology, 2017 March 8.

17. Grandmaison J. Characterization and localization of plant phenolics likely involved in the pathogen resistance expressed by endomycorrhizal roots / J Grandmaison, GM Olah, MR Van Calsteren, V Furlan // Mycorrhiza 1993 - V. 3:155-164

18. Eichholz I. UV-B-induced changes of volatile metabolites and phenolic compounds in blueberries (Vaccinium corymbosumL.) / I Eichholz, S. Huyskens-Keil, A. Keller, D. Ulrich, L.W. Kroh, S. Rohn // Food Chem., 2011. 126: 60-64.

19. Dixon R. Stress-indused phynylpropanoid metabolism / R. Dixon, N. Paiva // Plant cell, 1995, Vol. 7, P. 1085-1097.

Размещено на Allbest.ru