Оцінка патогенних властивостей бактерій-деструкторів важкоокиснювальних органічних сполук

Размещено на http://www.allbest.ru/

Оцінка патогенних властивостей бактерій-деструкторів важкоокиснювальних органічних сполук

О.Г. Горшкова Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова

Анотація

Мета. Оцінка потенційно патогенних властивостей бактерій-деструкторів органічних сполук на моделях культури клітин людини і тварин та на білих мишах. Методи. Оцінку патогенних властивостей за показниками інвазивності та цитотоксичності проводили in vitro на культурах клітин людини Нер-2 та тварин L20B, а також in vivo на лабораторних білих мишах. Результати. Експериментально підтверджено, що протягом 96 годин спостережень бактерії-деструктори не викликали морфологічних змін і деструкцію моношару перещеплюваних культур клітин людини Heр-2 і миші L20B. Бактерії не проникали в цитоплазму і не інфікували клітини, що свідчило про відсутність в них інвазивних і цитотоксичних властивостей.

У лабораторних білих мишей клінічних ознак токсикозу та загибелі тварин не відмічалося. Протягом всього періоду спостереження всі тварини зберігали життєздатність, добре поїдали корм, змін з боку хутряного покрову не помічено. Висновок. Результати досліджень свідчать про те, що штами бактерій-деструкторів Bacillus subtilis ONU551, Brevibacillus centrosporus Ф14, Pseudomonasfluorescens ONU328, Pseudomonas maltophilia ONU329 та Pseudomonas cepacia ONU327 не володіють інвазивними та цитотоксичними властивостями у культурах клітин людини Нер-2 і тварин L20B, а також вірулентністю для лабораторних білих мишей.

Ключові слова: бактерії-деструктори, патогенність, інвазивні та цитотоксичні властивості, культури клітин людини і тварин, лабораторні тварини.

Реферат

Цель. Оценка потенциально патогенных свойств бактерий-деструкторов органических соединений на моделях культур клеток человека и животных и на белых мышах. Методы. Оценку патогенных свойств по показателям инвазивности и цитотоксичности проводили in vitro на культуре клеток человека Нер-2 и животных L20B, а также in vivo на лабораторных животных белых мышах. Результаты. Экспериментально подтверждено, что на протяжении 96 часов наблюдений бактерии-деструкторы не вызывали морфологических изменений и деструкцию монослоя перевиваемых культур клеток человека Heр-2 и мыши L20B.

Бактерии не проникали в цитоплазму и не инфицировали клетки, что свидетельствовало об отсутствии у них инвазивных и цитотоксических свойств. У лабораторных белых мышей клинических признаков токсикоза и гибели животных не отмечалось. На протяжении всего периода наблюдений все животные сохраняли жизнеспособность, хорошо употребляли корм, изменений со стороны шерстяного покрова не отмечено. Вывод. Результаты исследований свидетельствуют о том, что штаммы бактерий-деструкторов Bacillus subtilis ONU 551, Brevibacillus centrosporus Ф14, Pseudomonas fluorescens ONU 328, Pseudomonas maltophilia ONU329, Pseudomonas cepacia ONU327 не обладают инвазивными и цитотоксическими свойствами в культуре клеток человека Нер-2 и животных L20B, а также вирулентностью для млекопитающих - лабораторных белых мышей.

Ключевые слова: бактерии-деструкторы, патогенность, инвазивные и цитотоксические свойства, культуры клеток человека и животных, лабораторные животные.

Summary

Aim. Assessment of potentially pathogenic properties of bacteria-destructors of organic compounds on the model of cell cultures of human and animal and on white mouses. Methods. Evaluation ofpathogenic properties by indicators of invasiveness and cytotoxicity was carried out in vitro in a culture of human cells Hep-2 and animals L20B, as well as in vivo on laboratory animals of white mouses. Results. Experimentally confirmed that for 96 hours observation bacteria-de- structors did not cause morphological changes and the destruction of the monolayer transplantable human cell cultures Heр-2and mouseL20B.

The bacteria did not penetrate the cytoplasm and did not infect the cells, which indicated of their lack of invasive and cytotoxic properties. In laboratory white mouses, clinical signs of toxicosis and animal death were not observed. For the whole experimental period all animals stayed viable, no eating disorders were observed, no changes on the side of wool cover. Conclusion. The obtaining results showed that strains of bacteria-destructors Bacillus subtilis ONU 551, Brevibacillus centrosporus Ф14, Pseudomonas fluorescens ONU 328 and Pseudomonas maltophilia ONU 329, Pseudomonas cepacia ONU 327did not have invasive and cytotoxic properties in the cellculture Hep-2 and L20B; and was not pathogenic for mammals - laboratory white mouse.

Key words: bacteria-destructors, pathogenicity, invasive and cytotoxicproperties, human and animal cell cultures, laboratory animals.

Бурхливий розвиток промисловості призвів до забруднення біосфери різноманітними важкоокиснювальними органічними полютантами, що володіють токсичними, мутагенними, тератогенними та канцерогенними властивостями [1, 14]. Особливу небезпеку становлять важкоокиснювальні сполуки - вуглеводні нафти, фенол, поліциклічні ароматичні вуглеводні (ПАВ), синтетичні поверхнево-активні речовини (ПАР), зокрема біологічно «жорсткі» ароматичної природи - алкілбензолсульфонати, оксиетильовані алкіл феноли та інш. [10, 15].

У зв'язку з цим особливо важливе значення мають дослідження, присвячені розробці методів детоксикації органічних сполук. Одним з перспективних напрямків стало використання біохімічної діяльності мікроорганізмів, що дозволило розробити ефективні методи очистки стічних вод, морської води, нафтозабрудненого ґрунту [3, 4, 12, 13]. Однак практичне застосування штамів бактерій-деструкторів можливе тільки за відсутності у них патогенних властивостей. Тому вивчення взаємодії бактерій-деструкторів з живими об'єктами у модельних системах, зокрема взаємовідносини між мікроорганізмами та макроорганізмами становить практичний інтерес.

У літературі є дані щодо використання клітинних культур для диференціації авірулентних штамів, визначення інвазивних та цитотоксичних властивостей бактерій, у тому числі потенційних біодеструкторів [2, 8, 11, 16, 17].

Метою роботи була оцінка потенційно патогенних властивостей бактерій-деструкторів важкоокиснювальних органічних сполук на моделях культур клітин людини і тварин та на білих мишах.

Матеріали та методи

Об'єктом досліджень були 5 штамів бактерій-деструкторів важкоокиснювальних органічних сполук, відібраних для використання у біотехнологіях очистки стічних вод, морської води та ґрунту з колекції культур мікроорганізмів Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова: деструктори фенолу - Bacillus subtilis ONU551 (Ф13) і Brevibacillus centrosporus Ф14, ізольовані зі фармацевтичних стічних вод; деструктори ПАР, фенолу та вуглеводнів нафти - Pseudomonas fluorescens ONU328 та штам Pseudomonas maltophilia ONU329, ізольований з морської води, та виділений з нафтозабрудненого ґрунту штам Pseudomonas cepacia ONU327; деструктор азотовмісних органічних барвників - Pseudomonas aeruginosa 2-9, ізольований з промислових стічних вод килимного комбінату [4, 15].

Бактерії зберігали на м'ясопептонному агарі в пробірках з гумовими корками, під шаром вазелінової олії.

Оцінку патогенних властивостей проводили на рівнях клітин та організмів: in vitro на культурах клітин людини Нер-2 та тварин L20B, а також in vivo на лабораторних білих мишах [4, 5, 6, 9].

Для вивчення цитотоксичних та інвазивних властивостей бактерій-деструкторів використовували перещеплювані культури клітин карциноми гортані людини Нер-2 та фібробластів мишей L20B. При культивуванні клітин застосовували середовище 199, що містило 10% сироватки великої рогатої худоби. Посівна доза складала 3-5*10⁴ клітин у 1 мл ростового середовища. Культивували клітини за температури 37 ^оС протягом 72 год до утворення моношару клітин.

Інокуляцію культури клітин здійснювали суспензією 18-годинної культури бактерій, яку вирощували на м'ясопептонному агарі за температури 30 ^оС. Посівна доза складала 1*10⁵ клітин бактерій у 1 мл ростового середовища 199.

Після інокуляції культур клітин бактеріями, через визначені інтервали часу (24, 48, 72, 96 год) здійснювали цитологічні дослідження нативних незабарвлених і постійних зафіксованих фіксатором Буена і забарвлених гематоксилін-еозином препаратів.

Патогенні властивості бактерій-деструкторів in vitro на культурі клітин оцінювали за 2-ма показниками:

- цитотоксичну дію через 24-96 год визначали візуально при мікроскопічному дослідженні постійних препаратів за морфологічними змінами окремих клітин і ступенем дегенерації моношару, яку враховували за кількістю нежиттєздатних клітин. Через 96 год знімали клітини з поверхні скла за допомогою скляного шпателя з гумовою насадкою, забарвлювали трепановим синім (у концентрації 0,01%), при цьому нежиттєздатні клітини забарвлювалися дифузно у синій колір, їх кількість виражали у відсотках (%). Критерієм цито- токсичності було збільшення кількості нежиттєздатних клітин у моношарі до 10% і більше у порівнянні з контролем;

- інвазивну активність оцінювали через 24-96 годин за кількістю інфікованих бактеріями клітин моношару у постійних забарвлених препаратах, виражали у відсотках (%). Критерій інвазивності - поява у моношарі клітин контамінованих мікроорганізмами [5].

Дослідження вірулентності бактерій-деструкторів здійснювали у гострих дослідах in vivo на моделі білих мишей. Використовували безпородних статевозрілих білих мишей вагою 18±2 г Тварини були адаптовані протягом 15 діб до умов утримання. Було сформовано 10 дослідних і одна контрольна група тварин по чотири особини одного віку в кожній. Суспензію добових культур бактерій концентрацією 4U0⁹ і 40U0⁹ КУО/мл готували на стерильному фізіологічному розчині. Досліджуваний матеріал вводили по 0,5 мл внутрішньочеревинно за допомогою ін'єкцій. Мишам контрольної групи вводили 0,5 мл фізіологічного розчину. Спостереження за зараженими тваринами вели протягом 14 діб. LD₅₀ визначали за методом Ріда і Менча. Критерієм авірулентності слугувала відсутність інфекційної патології та загибелі мишей протягом 14 діб. Контролювали поведінкові реакції та фізіологічний стан мишей [6, 9].

Експериментальні дослідження на культурах клітин проводили у п'ятикратному повторі, на лабораторних тваринах - у чотирьохкратному повторі. Математичне опрацювання результатів досліджень здійснювали з використанням комп'ютерної програми MSExcel [7].

Результати досліджень та їх обговорення

Результати дослідження патогенних властивостей бактерій-деструкторів органічних сполук in vitro та in vivo наведені у таблиці.

З наведених у таблиці даних видно, що протягом 96 год спостережень бактерії B. subtilis ONU 551, B. centrosporus Ф14, P. cepacia ONU 327, P fluorescens ONU 328 та P maltophilia ONU 329 не викликали морфологічних змін і деструкцію моношару перещеплюваних культур клітин людини Нер-2 і миші L20B, не проникали в цитоплазму і не інфікували клітини, тобто цитотоксичні та інвазивні властивості в них були відсутні.

Штам P aeruginosa 2-9 вже в першу добу спостережень викликав виражений цитопатичний ефект у моношарі перещеплюваних культур клітин людини Нер-2 та тварин L20B, який проявлявся у округленні клітин, вакуолізації та грануляції цитоплазми, деформації, зморщуванні та пікнозі ядер. Реєструвалася повна дегенерація клітин моношару перещеплюваних культур клітин Нер-2 та L20B, що свідчило про цитотоксичну активність штаму P aeruginosa

Таблиця 1 Результати оцінки патогенних властивостей бактерій-деструкторів органічних сполук in vitro та in vivo

Примітка:* експозиція 14 діб

2-9. Бактерії активно проникали до клітин, у цитоплазмі реєстрували їх скупчення біля ядра. Через 24 год експозиції майже половина клітин моношару була інфікована. Через 96 годин число інфікованих клітин сягало 100%, моношар був повністю зруйнований - кількість нежиттєздатних клітин сягала 97±12 - 100%, що свідчило про наявність у бактерій P aeruginosa 2-9 цитотоксичних і інвазивних властивостей.

В експериментах на білих лабораторних мишах встановлено, що бактерії-деструктори важкоокиснювальних органічних сполук B. subtilis ONU 551, B. centrosporus Ф14, P. fluorescens ONU 328, P maltophilia ONU 329 та P cepacia ONU 327 не володіють вірулентними властивостями. Протягом всього періоду спостереження після введення суспензії живих клітин бактерій внутрішньочеревинно всі тварини зберігали життєздатність, добре поїдали корм, змін з боку хутряного покрову не помічено. Миші були активними, фізіологічні відправлення у них не порушувалися, поведінкові реакції були звичайними. Клінічних ознак токсикозу не відмічено. Середні вірулентні дози не досягнули LDx кл/миш і перевищують рекомендовані порогові значення для IV-ого класу небезпеки штамів - “малонебезпечних, практично без алергенної та загальнотоксичної дії” [9].

Штам P. aeruginosa 2-9 - деструктор азотовмісних органічних барвників викликав загибель 75±8% мишей на 14 добу експозиції, що свідчить про його вірулентність.

В результаті експериментальних досліджень встановлено залежність між показниками патогенності бактерій-деструкторів органічних сполук на клітинному та організмовому рівнях - in vitro на культурах клітин людини Нер-2 та тварин L20B, та in vivo на лабораторних білих мишах.

Дані літератури свідчать про те, що для оцінки патогенних властивостей штамів бактерій-деструкторів, виробничих штамів, мікробних препаратів дослідники переважно використовують лабораторних тварин, що потребує економічних витрат на їх підтримання, харчування та інш. [6, 9, 17]. На підставі наших досліджень можемо рекомендувати використання методу культур клітин людини та тварин для первинного скринінгу патогенності бактерій-деструкторів ізольованих з різних джерел (стічних вод, ґрунту, водного середовища), а також колекційних штамів. Цей метод дозволяє у короткий термін (96 год) визначити цитотоксичність та інвазивність великої кількості штамів та відібрати серед них ті, що не володіють патогенними властивостями.

Таким чином, результати наших експериментальних досліджень свідчать про те, що штами бактерій-деструкторів органічних сполук B. subtilis ONU 551, B. centrosporus Ф14, P fluorescens ONU 328, P maltophilia ONU 329, P. cepacia ONU 327 не патогенні - не володіють інвазивними та цитотоксичними властивостями у культурі клітин людини Нер-2 і тварин L20B; та вірулентністю для ссавців - лабораторних білих мишей.

бактерія деструктор клітина інвазивність

Список використаної літератури

1. Баландина А.Г., Хангильдин Р.И., Ибрагимов И.Г., Мартяшева В.А. Анализ воздействия предприятий нефтехимического комплекса на гидросферу и пути минимизации их негативного влияния // Башкирский химический журнал. - 2015. -Т 22, № 1. - С. 115-126.

2. Дмитруха Н.Н. Культура клеток как in vitro модель в токсикологических исследованиях // MedixAnti-Aging. - 2013. - № 3. (33) - С. 50-55.

3. Гудзенко Т.В., Волювач О.В., Бєляєва Т.О., Пузирьова І.В., Лісютін Г.В., Горшкова О.Г., Іваниця В.О. Нафтоокиснювальна активність деяких штамів бактерій роду Pseudomonas // Мікробіологія і біотехнологія. - 2013. - № 4.. - С. 72-80.

4. Іваниця В.О., Гудзенко Т.В., Філіпова Т.О., Галкин Б.М., Іваниця Т.В., Горшкова О.Г., Чанішвілі Н. Оцінка цитотоксичних властивостей бактеріофага Clostridium perfringens in vitro на моделі перещеплюваної культури клітин людини HEP-2 // Мікробіологія і біотехнологія. - 2008. - С. 31-36.

5. Иваниця В.О., Гудзенко Т.В., Джахуди А.Г Изучение патогенных свойств скользящих бактерий на модели культуры клеток мантии мидий // Микробиологический журнал . - 1992. - Т 54. - № 5 . - С. 17-21.

6. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. - Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. - С. 100-111.

7. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel . - К.: Морион, 2001. - 260 с.

8. Маркина О.В., Алексеева Л.П., Монахова Е.В. Культуры клеток в изучении биологической активности токсинов Vibrio cholerae, продуцируемых рекомбинантными штаммами Escherichia coli // Пробл. комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». - 2006. - № 19.- С. 91-93.

9. Наказ МОЗ України від 26 жовтня 2004 року N 521 «Про затвердження методичних вказівок "Медико-біологічні дослідження виробничих штамів мікроорганізмів і токсиколого-гігієнічна оцінка мікробних препаратів, визначення їх безпеки та обґрунтування гігієнічних нормативів і регламентів".

10. Павленко М.І., Сорока Я.М., Гвоздяк П.І., Кухар В.П. Біодеструкція поліциклічних ароматичних вуглеводнів // Катализ и нефтехимия. - 2007. - № 15. - С. 46-62.

11. Пименова Е.В. Разработка метода оценки цитотоксичности антигенов возбудителя мелиоидоза in vitro на модели перевиваемых клеточных культур: Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук 03.02.03 - микробиология. - Волгоград, 2016. - 115 с.

12. Серебренникова М.К. Биодеградация нефтяных углеводородов иммобилизованными родококками в колоночном биореакторе: Дисс. Канд. биол. наук. - Пермь, 2014. - 159 с.

13. Сопрунова О.Б., Утепешева А.А., Виет Тиен Нгуен Микроорганизмы - деструкторы ПАВ в водных средах// Вестник Астраханского государственного технического университета. Серия: Рыбное хозяйство. - 2013. - № 1. - С. 83-90.

14. Bergй A., Cladiиre M., Gasperi J., Coursimault A., Tassin B., Moiller- on R. Meta-analysis of environmental contamination by alkylphenols (Review) // Envir. Sci. Pollut. Res. - 2012. - Vol. 19, № 9. - P. 3798-3819.

15. Gudzenko Tatyana, Wolodymyr Iwanycja, Olga Woljuwacz, Boris Galkin, Olga Zuk, Elena Gorszkowa. Biodegradacja fenoli i nnych cyklicznych zwi^z- kow aromatycznych. - Publisher: GlobeEdit is a trademark of International Book Market Service Ltd., member of OmniScriptum Publishing Group, 17 Meldrum Street, Beau Bassin 71504, Mauritius. - 2018. - 85 p.

16. Harley V.S., Dance D.A.B., Drasar B.S. Effects of Burkholderia pseudomallei and other Burkholderia species on eukaryotic cells in tissue culture// Microbios. - 1998. - Vol. 96. - P. 71-93.

17. Tayabali A.F, Coleman G., Crosthwait J., Nguyen K.C., Zhang Y.,Sh- wed P. Composition and pathogenic potential of a microbial bioremediation product used forcrude oil degradation. PLOS ONE

Размещено на Allbest.ru