Склад жирних кислот, амінокислот та моносахаридів бактерій роду Bacillus, виділених з донних відкладень Чорного моря

Размещено на http://www.allbest.ru/

Склад жирних кислот, амінокислот та моносахаридів бактерій роду Bacillus, виділених з донних відкладень Чорного моря

М.Д. Штеніков, А.М. Остапчук, В.О. Іваниця, Одеський національний університет імені І.І. Мечникова

Анотація

Метою роботи було визначити кількісний та якісний склад жирних кислот, амінокислот та моносахаридів антагоністично активних споротвірних бактерій роду Bacillus, ізольованих з глибоководних донних відкладень Чорного моря. Матеріали та методи. Об'єктом дослідження були антагоністично активні бактерії Bacillus velezensis ONU 553, Bacillus pumilus ONU 554, Bacillus subtilis ONU 559, Bacillus megaterium 11, Bacillus pumilus 95. Склад жирних кислот визначали на газовому хроматографі з полум'янойонізаційним детектором Agilent 7890 (Agilent Technologies, США), моноцукридів - методом газо-рідинної хромато-масспектрометрії на Agilent 6890N/5973 inert (Agilent Technologies, USA), амінокислот - на рідинному хроматографі Agilent 1200 (Agilent Technologies, USA).

Виявлено характерні для досліджених штамів жирні кислоти: для штаму B. velezensis ONU 553 - 17:0, 14:0 anteiso, 11:0 2OH, для B. subtilis ONU559 19:0 iso, 19:0 anteiso, для B. megaterium 11 - 15:0 2OH, B. pumilus 95 - 15:1 isow5c та 12:0. Амінокислотні патерни досліджених штамів не демонструють значущу кореляцію з патерном біоти океану, а штамів B. velezensis ONU 553, B. pumilus ONU 554 та B. pumilus 95 характерні для біоти пісча- них ґрунтів. Крім характерних для бактерій групи B. subtilis моносахаридів виявлена арабіноза, багатоамтоні спирти - L-ідітол та міоінозитол, функції яких у клітинах бацил не відомі. Висновки. Показники НАІ та а15/ і15 штамів B. velezensis ONU 553, B. pumilus ONU 554 та B. subtilis ONU 559 характерні для мезофільних бактерій, а B. megaterium 11 та B. pumilus 95 для помірних термофілів. Результати досліджень підтримують гіпотезу про неавтохтонність досліджуваних бактерій для глибоководних донних відкладень Чорного моря.

Ключові слова: Bacillus, Чорне море, донні відкладення, жирні кислоти, амінокислоти, моносахариди.

Реферат

Целью работы было определить количественный и качественный состав жирных кислот, аминокислот и углеводов антагонистически активных спорообразующих бактерий рода Bacillus, изолированных из глубоководных донных осадков Черного моря. Материалы и методы. Объектом исследования были бактерии Bacillus velezensis ONU 553, Bacillus pumilus ONU 554, Bacillus subtilis ONU 559, Bacillus megaterium 11, Bacillus pumilus 95. Состав жирных кислот определяли на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором Agilent 7890 (Agilent Technologies, США), моносахаридов - методом газо-жидкостной хромато-мас-спектрометрии на Agilent 6890N/5973 inert (Agilent Technologies, USA), амінокислот - на жидкостном хроматографе Agilent 1200 (Agilent Technologies, USA). Результаты. Обнаружены характерные для исследованных штаммов жирные кислоты: для штамма B. velezensis ONU 553 - 17:0, 14:0 anteiso, 11:0 2OH, для B. subtilis ONU 559 - 19:0 iso, 19:0 anteiso, для B. megaterium 11 - 15:0 2OH, B. pumilus 95 - 15:1 isow5c и 12:0. Аминокислотные паттерны исследованных штаммов не демонстрируют значимой корреляции с паттерном биоты океана, а у штаммов B. velezensis ONU 553, B. pumilus ONU 554 и B. pumilus 95 характерны для биоты песчаных грунтов. Кроме характерных для бактерий группы B. subtilis углеводов обнаружена арабиноза, многоатомные спирты - L-идитол и миоинозитол, функции которых в клетках бацилл неизвестны. Выводы. Показатели НАІ и а15/і15 штаммов B. velezensis ONU 553, B. pumilus ONU 554 и B. subtilis ONU 559 характерны для умеренно мезофильных бактерий, а B. megaterium 11 и B. pumilus 95 - для умеренных термофилов. Результаты исследований поддерживают гіпотезу о неавтохтонности исследуемых бактерий для глубоководных донных осадков Черного моря.

Ключевые слова: Bacillus, Черное море, донные отложения, жирные кислоты, аминокислоты, моносахариды.

Summary

The aim of this work was to determine the quantitative and qualitative composition of fatty acids, amino acids and, carbohydrates of antagonistically active sporeforming Bacillus genus bacteria isolated from the deep-sea sediments of the Black Sea. Materials and methods. The object of the study was the antagonistically active bacteria of Bacillus velezensis ONU 553, Bacillus pumilus ONU 554, Bacillus subtilis ONU 559, Bacillus megaterium 11, Bacillus pumilus 95 strains.

The fatty acid composition was determined by using a gas chromatograph with flame ionization detector Agilent 7890 (Agilent Technologies, USA), monosaccharides - by gas-liquid chromatography-mass spectrometry on Agilent 6890N/5973 inert (Agilent Technologies, USA), amino acids - on liquid chromatograph Agilent 1200 (Agilent Technologies, USA). Results. There were found the characteristic fatty acids for the studied strains: for strain B. velezensis ONU 553 - 17:0, 14:0 anteiso, 11:0 2OH, for B. subtilis ONU559 - 19:0iso, 19:0anteiso, for B. megaterium 11 - 15:0 2OH and, B. pumilus 95 - 15:1 isow5c and 12:0. The amino acid patterns of the studied strains do not show any significant correlation with the ocean biota pattern and strains B. velezensis ONU 553, B. pumilus ONU 554 and B. pumilus 95 show such characteristic for sandy soil biota. In addition to B. sub- tilis group bacteria-specific monosaccharides there were revealed arabinose, polyatomic alcohols - L-iditol and myoinositol, which functions are unknown in bacilli cells. Conclusions. It can be concluded that HAI and a15/i15 indices of B. velezensis ONU 553, B. pumilus ONU 554 and B. subtilis ONU 559 strains are characteristic of mesophilic bacteria and B. megaterium 11 and B. pumilus 95 are of moderate thermophiles. The results of the studies support the hypothesis that these bacteria are not autochthonous for the deep-sea bottom sediments of the Black Sea.

Key words: Bacillus, the Black Sea, bottom sediments, fatty acids, amino acids, monosaccharides.

Представники роду Bacillus являють собою об'єкт активного дослідження з самого зародження мікробіології як науки [9]. Це пов'язано як з різноманітністю екологічних ніш, які вони займають (від різних форм паразитизму до коменсалізму та мутуалізму), специфічною будовою (здатність до утворення ендоспор) та здатністю до синтезу широкого спектру біологічно активних вторинних метаболітів у тому числі антибіотиків [10, 12]. До антимікробних сполук належать нерибосомні пептиди родин сурфактинів, ітуринів, фенгіцинів та курстакінів, аміноглікозидні антибіотики (бутирозин, неотрегалозодиамін) тощо [16]. Біосинтетичний потенціал бацил морського походження поки лишається мало вивченим. Є всі підстави очікувати розширення наших знань про біосинтетичний потенціал бацил саме завдяки морським штамам. Так, у представників роду Bacillus морського походження було виявлено антибіотики пептидної природи ряду нових класів (маріхізини, гагеостатини, бацилітетрини) та незвичайно модифіковані сполуки раніше відомих класів (наприклад, глікозильований макролактин W) [8].

Інформація про первинні метаболіти, такі як амінокислотний та вуглеводний склад, в літературі представлена значно менше і для ряду груп взагалі відсутня, не зважаючи на важливість таких даних як з погляду цитофізіології, так і потенціалу штамів як пробіотиків, що актуально зокрема і для бацил [9]. Ці показники характеризують дуже важливі для клітинної фізіології молекули - білки та поліцукриди, що робить їх також одним з інструментів поліфазного таксономічного аналізу [13].

У попередніх дослідженнях з глибоководних донних відкладень Чорного моря було ізольовано більше 100 штамів споротвірних факультативно-анаеробних бактерій, визначено їх таксономічний склад та антагоністичну активність до широкого спектру тест штамів [1, 15].

Метою роботи було проаналізувати кількісний та якісний склад жирних кислот, амінокислот та вуглеводів антагоністично активних споротвірних бактерій роду Bacillus, ізольованих з глибоководних донних відкладень Чорного моря.

Матеріали та методи

Об'єктами дослідження були антагоністично активні бактерії Bacillus subtilis ONU 553, Bacillus megaterium Bacillus megaterium ONU 554, Bacillus 559, Bacillus megaterium 11, Bacilluspumilus 95, відібрані з колекції споротвірних факультативно-анаеробних бактерій, ізольованих з глибоководних донних відкладень Чорного моря [1]. Бактерії підтримували на середовищі Nutrient agar (Himedia).

Для досліджень використовували добову культуру, яку двічі пересівали на щільному живильному середовищі Tryptic Soy Agar (TSA). Визначення жирнокислотних спектрів (далі - ЖК-спектрів) виконували методом газової хроматографії, за стандартною методикою [14] з використанням автоматичної системи ідентифікації мікроорганізмів MIDI Sherlock на базі газового хроматографа з полум'яно-йонізаційним детектором Agilent 7890 (Agilent Technologies, США). Розділення проводили на капілярній колонці 30м*0,25мм*0,25мкм Ultra 2, швидкість потоку 3 мл/хв, газ-носій водень, градієнт температури від 150 ^оС до 300 ^оС впродовж 6 хв.

Для визначення загального складу моносахаридів до зразку бактеріальної біомаси об'ємом у дві бактеріологічні петлі додавали 2 мл 2М трифтороцтової кислоти [7]. Гідроліз проводили при 100 ^оС впродовж 6 год. Гідролізат упарювали, промивали водою для видалення кислоти. Для отримання альдонітрильних похідних моносахаридів до екстракту додавали дериватизувальну суміш (гідроксиламін солянокислий у метанолі). Розчинений екстракт витримували впродовж 25 хв при 75 °С. Після ацетилювання до реакційної суміші додавали 1 мл дихлорметану. Дихлорметановий шар відбирали, висушували досуха та розчиняли в 300 мкл суміші гептан/етилацетат (1:1 v/v).

Моносахариди визначали методом газо-рідинної хромато-масспектрометрії на системі Agilent 6890N/5973inert (Agilent technologies, USA), колонка капілярна HP-5ms (30m*0,25mm*0,25mkm). Температура випаровувача 250 ^оС, температура інтерфейсу 280 ^оС. Розділення проводили в режимі програмування температури - початкову температуру 160 ^оС витримували впродовж 8 хв, піднімали з градієнтом 5 ^оС/хв до 240 ^оС. Кінцеву температуру витримували впродовж 6 хв. Пробу об'ємом 1 мкл, вводили в режимі поділу потоку 1:50. Детектування проводили в режимі SCAN в діапазоні (38400 m/z). Швидкість потоку газу носія через колонку 1,2 мл/хв. Ідентифікацію проводили за часом утримання стандартів моносахаридів та з використанням бібліотеки мас-спектрів NIST 02. Кількісний аналіз проводили шляхом додавання розчину внутрішнього стандарту в досліджувані проби. Як внутрішній стандарт використовували розчин сорбітолу.

Для визначення загальної кількості амінокислот дві бактеріологічні петлі бактеріальної біомаси вносили до віали, додавали 2 мл водного розчину 6N соляної кислоти та поміщали в термостат при 110 ^оС [6]. Гідроліз проводили впродовж 24 год. Після чого 0,5 мл відцентрифугованого екстракту/ гідролізату упарювали на роторному випаровувачі, тричі промиваючи дистильованою водою для видалення соляної кислоти. Ресуспендували в 0,5 мл дистильованої води та фільтрували крізь мембранні фільтри з регенерованої целюлози з порами 0,2 мкм. Отримання флуоресцентних похідних проводили в автоматичному програмованому режимі перед введенням проби в хроматографічну колонку з використанням OPA (orthophthalaldehyde) та FMOC (9-fluorenylmethyl chloroformate). Ідентифікацію амінокислот проводили шляхом порівняння часу утримання з з стандартною сумішшю амінокислот (Agilent 5061-3334). Кількісна оцінка рангової кореляції між рядами спадання вмісту для амінокислот була виконана з використанням тесту Кендела, реалізованого в бібліотеці ScyPy мови програмування Python [2, 17].

Результати та їх обговорення

Отримані дані свідчать про те, що спектри жирних кислот досліджених штамів в цілому демонструють риси, характерні для представників роду Bacillus та групи видів Bacillus subtilis, зокрема. До даної групи, окрім вищезазначеного, входять такі види, як Bacillus megaterium, B. atrophaeus, B. licheniformis, B. amiloliquefaciens, B. pumilus, B. mojavensis тощо [9, 10]. Багато штамів даної групи є продуцентами різноманітних біологічно активних речовин, зокрема антибіотиків та бактеріоцинів. До ознак першої групи належить характерне для представників роду Bacillus переважання розгалужених жирних кислот із довжиною вуглецевого ланцюга від 14 до 17 атомів (табл. 1). До властивостей ЖК-спектрів, характерних для групи Bacillus subtilis входить різке переважання насичених жирних кислот над ненасиченими, яке наближається до 100% в деяких випадках, значення індексу теплової адаптації (heat adaptation index - далі НАІ), близькі до одиниці та значення а15/і15 між 1,0 та 3,0 [3]. Ознаки останньої групи були у випадку досліджених штамів проявлені так само чітко, як це зазвичай характерно для групи Bacillus subtilis. Ця обставина стане нижче предметом обговорення. Підрахунок НАІ виконували за формулою [3]:

(п14: 0) + р(п16: 0) + р(і14: 0) + р(і15:0) + р(і 16: 0) + р(і17:0) л^,

р(а15: 0) + р(а17: 0) + р(п16:1) + р(і17:1 (п -- 10)) + р(16: lw 7с alcohol)

де р є часткою певної жирної кислоти.

Значення sim-індексів, що вказують на подібність отриманого жирнокислотного спектру для такого у типового штаму даного виду, визначеного за стандартною методикою, для штамів B. velezensis ONU 553 та B. subtilis 559, виявилися досить високими для видової ідентифікації, тобто більшими за 0,500. Відповідні значення для B. megaterium 11 та B. pumilus 95 такої ідентифікації виконати не дозволяють через низьке значення різниці між альтернативними індексами (штам 11) чи значення менше за 0,5 (штам 95) (табл. 1). Підкреслимо, що формально індекси цих штамів є задовільними для видової ідентифікації як такої згідно з керівництвом виробника, але різниця між їх значеннями та запропонованими альтернативними індексами не перевищує 0,1. Значення Sim-індексу штаму B. pumilus 95 може вказувати на нетиповість даного штаму для виду Bacillus pumilus.

Показники НАІ та а15/і15, що є оцінкою термофільності даного штаму і були розроблені саме для представників роду Bacillus, були розраховані за формулами, запропонованими Diomandй et al. [3]. Їх значення інтерпретуються таким чином: якщо НАІ штаму приймає значення близьке до одиниці, то штам мезофільний; якщо він більший чи менший, то, штам ідентифікується, відповідно, як термофільний та психрофільний. Аналогічно визначається коефіцієнт а15/і15: мезофільні штами мають значення між 1 та 3, термофільні та психрофільні - менші за 1 та більші за 3, відповідно.

Інтерпретуючи в такому ключі отримані дані, можна дійти висновку, що показники НАІ та а15/і15 штамів B. velezensis ONU 553, B. pumilus ONU 554 та B. subtilis ONU 559 характерні для мезофільних бактерій, а B. megaterium 11 та B. pumilus 95 демонструють набір ознак, характерних для помірних термофілів, тобто відносно високі значення НАІ та низькі а15/і15 [3]. Температурні діапазони росту для досліджуваних штамів не визначалися, проте всі вони демонстрували задовільний ріст за інкубації при 30 °С.

Також можна відзначити унікальні для кожного зі штамів жирні кислоти - для штаму B. velezensis ONU 553 це 17:0, 14:0 anteiso, 11:0 2OH. Для штаму B. pumilus 554 таких жирних кислот не виявлено, для B. subtilis ONU 559 такими є 19:0 iso, 19:0 anteiso, для B. megaterium 11 - 15:0 2OH і, відповідно, B. pumilus 95 - 15:1 isow5c та 12:0.

Порядок виявлених амінокислот по зниженням масової долі майже незмінний (табл. 2).

Таблиця 1 Спектри жирних кислот бактерій роду Bacillus, ізольованих з Чорного моря

В роботі Moura et al. [11] запропоновано цікавий метод аналізу амінокислотного складу для організмів різних біологічних ніш. Авторам вдалося виявити, що за розташування амінокислот за зниженням вмісту, організми різних біотопів демонструють певні сигнатури чи патерни чергування амінокислот у таких спектрах.

Таблиця 2 Амінокислотний склад бактерій роду Bacillus, ізольованих з Чорного моря

Аналіз отриманих нами даних не виявив однозначної відповідності з жодним із запропонованих Moura патернів. Спостерігається певне наближення до інвертованого патерну, характерного для біоти піщаних ґрунтів (по зростанню кількості: аргінін-лізин-лейцин-аланін-аспарагін /аспартат), що може мати відношення до вихідного місця походження даних штамів. Також спостерігається, що компоненти патерну, характерного для організмів океану, групуються на початку відповідних переліків амінокислот, практично не відтворюючи досить цікавий саме в даному випадку мотив (по зростанню: аланін-триптофан-гліцин-глутамін/глутамат-лейцин).

Для об'єктивного порівняння порядків було використано тест рангової кореляції Кендела. Результати обрахування даного показника наведено у табл. 3.

Таблиця 3 Коефіцієнт рангової кореляції Кендела для наборів амінокислотдослідних штамів

Примітка: Порівняння проведено за даними амінокислотного пулу: А -біоти піщаних ґрунтів [11], В - з даними біоти океану [11], т - коефіцієнт кореляції Кендела. Значення т вважається за значуще, якщо відповідне значення p-value менше за 0,05.

Амінокислотні патерни штамів B. velezensis ONU 553, B. pumilus ONU 554 та B. pumilus 95 демонструють значущу і пряму кореляцію з відповідним патерном біоти піщаних ґрунтів, в той час як їх кореляція з патерном океанічної біоти слабка і незначуща. Це можна інтерпретувати як свідоцтво на користь походження досліджуваних штамів з піщаних пляжів узбережжях Чорного моря.

Патерн штаму B. megaterium 11 демонструє обернену та значущу кореляцію з патерном біоти океану і не демонструє переконливої кореляції з патерном пісків. Такий результат важко піддається інтерпретації. Те ж стосується штаму B. subtilis ONU 559, патерн якого не корелює з жодним з запропонованих.

Вміст моносахаридів для досліджених бактерій носить в цілому очікуваний характер (табл. 4). Рибоза входить до складу РНК та у низки представників Bacillus subtilis до тейхоєвих кислот, і цілком природно припустити її наявність у тій самій ролі у клітинних стінках штамів філогенетично близьких видів. Рамноза для бацил відома лише у складі ендоспор та її наявність у зразках усіх штамів, окрім B. velezensis ONU 553, може свідчити про початок процесу ендоспороутворення у бактерій. Цікавою в цьому контексті є відсутність рідкісного моносахариду хіновози, характерного для ендоспор B. subtilis та вегетативних форм деяких штамів цього виду[18]

Велика кількість глюкози зрозуміла з позицій її ролі в енергетичному обміні прокаріот та зокрема фірмікут. Високий вміст галактози відомий для Bacillus anthracis, що відрізняє даний вид навіть з досить однорідної групи B. cereus. У невеликих кількостях, менших приблизно на два порядки за відповідні значення для глюкози, галактоза також давно відома як компонент клітин Bacillus subtilis, проте її точна локалізація та функція в клітині невідомі [18]. Арабіноза не відома як компонент клітин бацил та взагалі фірмікут. Серед прокаріот вони відомі лише для актинобактерій як компоненти арабіногалактану [4, 5].

Таблиця 4 Склад маносахаридів бактерій роду Bacillus,ізольованих з Чорного моря (% від загальної суми площ піків)

У досліджених штамів виявлені також два багатоамтоних спирти - L-ідітол (у всіх штамів) та міоінозитол (у всіх штамів, окрім B. velezensis ONU 553), у штаму B. subtilis ONU 559 - редукувальний дисахарид туранозу, у штамів B. velezensis ONU 553 та B. pumilus ONU 554 - глікозидсалірепін, а у штаму B. megaterium 11 - алкалоїд солазодин, однак ці результати потребують подальшого дослідження та аналізу.

Отже, можна зробити висновок, що за показниками НАІ та а15/і15 штами B. velezensis ONU 553, B. pumilus ONU 554 та B. subtilis ONU 559 можуть бути віднесені до мезофільних бактерій, а B. megaterium 11 та B. pumilus 95 - до помірних термофілів. Ці дані та характеристика амінокислотних спектрів досліджених штамів підтримують гіпотезу про алохтонність досліджуваних штамів для глибоководних донних відкладень Чорного моря.

Роботи з використанням хроматографічного обладнання були проведені в Центрі колективного користування унікальним науковим обладнанням при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ, при технічному та методичному сприянні к.б.н. Хархоти Максима Андрійовича, за що висловлюємо йому щиру вдячність.

амінокислота бактерія моносахариди море

Список використаної літератури

1. Іваниця В.О., Штеніков М.Д., Остапчук А.М. Факультативно-анаеробні спороутворювальні бактерії глибоководних відкладень чорного моря. // Мікробіологія і біотехнологія. - 2017. - V 40, N 4. - P 94-103.

2. Abdi H. Kendall rank correlation. In: Salkind NJ, editor. Encyclopedia of Measurement and Statistics. - Thousand Oaks (CA): Sage; 2007. P. 508-510.

3. Diomandй S.E., Nguyen-The C., Guinebretiиre M.H., Broussolle V., Brillard J. Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. // Front. Microbiol. - 2015. - 6. - P 1-20.

4. Doyle R.J. (edit.) Glycomicrobiology. - Kluwer Academic Publishers New York, Boston, Dordrecht, London, Moscow. 2002. 557 p.

5. Fox A., Stewart G.C., Waller L.N., Fox K.F, Harley W.M., Price R.L. Carbohydrates and glycoproteins of Bacillus anthracis and related bacilli: targets for biodetection. // Journal of Microbiological Methods. -2003. - V 54, N 2. - Р. 143-152.

6. Jвmbor A., Molnвr-PerlI. Quantitation of amino acids in plasma by high per formance liquid chromatography: Simultaneous deproteinization and derivati- zation with 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride. // Journal of Chromatography A. - 2009. - V 1216, N 34 - P. 6218-6223.

7. Guerrant G.O., Moss C.W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. //Analytical Chemistry. - 1984. - V 56, N 4. - P. 633-638.

8. Kaspar F., Neubauer P., GimpelM. Bioactive Secondary Metabolites from Bacillus subtilis: A Comprehensive Review. // J Nat Prod. - 2019. - V 82, N 7. -

P. 2038-2053.

9. Logan N.A, De Vos P Bacillus. In: Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteriaю NJ: Wiley, 2015.

10. Mandic-Mulec I, Stefanic P, van Elsas J.D. Ecology of Bacillaceae. // Microbiology Spectrum. - 2015. - V 3, N 1. - P. 1-24.

11. Moura A., Savageau M.A., Alves R. Relative Amino Acid Composition Signatures of Organisms and Environments. // PLoS One. - 2013. - V 8, N 10. - P. 1-9.

12. Nicholson W.L. Roles of Bacillus endospores in the environment. // Cellular and Molecular Life Sciences. - 2002. - V 59, N 3. - P. 410-416.

13. Raina V, Nayak T., Ray L., Kumari K., Suar M.A. Chapter 9. Polyphasic Taxonomic Approach for Designation and Description of Novel Microbial Species. // Microbial Diversity in the Genomic Era. - Academic Press, 2019. - P. 137-152.

14. Rainey F, Oren A. Methods in Microbiology. Volume 38. - Taxonomy of Prokaryotes. - Elsevier ltd, 2011. - 474 p.

15. Shtenikov M.D., Ostapchuk А.М., Ivanytsia V.O. Antagonistic activity of endosporeforming bacteria of deep water the Black Sea sediments. // Microbiology & Biotechnology. - 2018. - V 43, N 3. - P. 82-89.

16. Stein T. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions. // Mol Microbiol. - 2005. - V 56, N 4. - P. 845-857.

17. Virtanen P, Gommers R., Oliphant T.E., HaberlandM., Reddy T., Cour- napeau D. et al. SciPy 1.0: fundamental algorithms for scientific computing in Python. // Nature methods. - 2020. - V 17. - P. 261-272.

18. Wunschel D., Fox K.F., Black G.E., Fox A. Discrimination among the Bacillus cereus group, in comparison to B. subtilis, by structural carbohydrate profiles and ribosomal RNA spacer region PCR. // Syst. Appl. Microbiol. - 1995. - V 17, N 4. - P. 625-635.

Размещено на Allbest.ru