Удосконалення методів адаптації мікроклонів Paulownia tomentosa до умов in vivo з використанням бактерій Bacillus megaterium onu 500

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Удосконалення методів адаптації мікроклонів Paulownia tomentosa до умов in vivo з використанням бактерій Bacillus megaterium onu 500

Н.І. Теслюк, І. Аврамович

Павловнія повстяна (Paulownia tomentosa) відноситься до одних з самих швидкорослих дерев і володіє значним економічним потенціалом (цінна деревина, високий темп вироблення біомаси, підвищена стійкість до стресів та ін.) [6]. Павловнія повстяна добре очищає землі [5]. Це є дуже важливим чинником для вирощування її на території України. Основним джерелом забруднення ґрунтів є відходи промислових підприємств, автотранспорт є головним джерелом надходження до ґрунту свинцю, цинку, а також погано працюючі системи санітарної очистки. Забруднені землі потребують відновлювальних робіт. Вирощування Павловнії повстяної рекомендоване для очищення ґрунтів і відновлення їх властивостей шляхом інтенсивного землеробства. Звичайні методи розмноження насінням ненадійні через хвороби і шкідників, поганого проростання, а також повільного росту, ніж живці [12]. Застосування методів мікроклонального розмноження для агролісомеліорації має важливе значення. Цей метод пропонує швидкий спосіб виробництва клонованого фонду та сприяє наповненню екологічним високоякісним матеріалом, котрий є генетично однорідним, без хвороб і вірусів [8]. Основним недоліком цього методу є низька життєздатність мікроклонів під час адаптації їх до умов in vivo, що часто призводить до втрати 90-100% мікроклонів.

Актуальним та важливим є пошук універсальних, раціональних варіантів технологічного процесу вирощування Павловнії повстяної при масовому розмножені та удосконалення окремих етапів мікроклонального розмноження з використанням бактерій. Один із найскладніших етапів є адаптація рослин з умов in vitro до in vivo. Першою серйозною перепоною для адаптації стає контакт порівняно слабо розвиненої і повністю стерильної кореневої системи мікроклона із мікробіотою ґрунту. Якщо у природі процеси формування ризосфери проходять поступово, то при адаптації рослин з умов in vitro коренева система є абсолютно беззахисною проти патогенних мікроорганізмів відкритого ґрунту. Тому саме на цьому етапі є доцільним використання корисних бактерій, вплив яких потенційно може підвищити кінцевий вихід мікроклонів.

У практиці аграрного виробництва накопичено значний матеріал, який підтверджує ефективність використання різних мікроорганізмів, зокрема, ризосферних азотфіксувальних та фосфатмобілізувальних бактерій, для стимуляції росту та розвитку рослин [2]. Із аналізу літературних джерел відомо, що бактерії Bacillus spp. позитивно впливають на урожайність, тому що формують біоплівки на коренях рослин та займають екологічні ніші фітопатогенів [7]. Рід Bacillus - це один з найбільш різноманітних і комерційно корисних груп бактерій, які синтезують антимікробні речовини проти фітопатогенів: циклічний ліпопептид, сурфактин, ітурін, макролактин та фунгіцин. Ці речовини успішно використовуються у сільському господарстві [9, 10, 11]. Завдяки антагоністичним властивостям по відношенню до інших видів бактерій бацили використовують у виробництві антибіотиків [4]. В лабораторії кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології Одеського національного університету імені І.І. Мечникова вивчено штам B. megaterium ONU500, який характеризується високою антагоністичною активністю до фітопатогенних мікроорганізмів та значно стимулює ріст дводольних та однодольних рослин. Цей штам запатентовано як штам-антагоніст проти збудників хвороб сільськогосподарських рослин [14]. Метою роботи було удосконалення процесів адаптації мікроклонів Павловнії повстяної (Paulownia tomentosa), вирощеної у культурі in vitro, до умов in vivo з використанням бактерій штаму Bacillus megaterium ONU500.

Матеріалом для дослідження слугували мікроклони Павловнії повстяної (Paulownia tomentosa), а також бактерії штаму Bacillus megaterium ONU500.

Цей штам характеризується високою антагоністичною активністю до фітопатогенних мікроорганізмів, значно стимулює ріст дводольних та однодольних рослин [14].

Для мікроклонального розмноження Павловнії повстяної in vitro застосовували тверде середовище МС (середовище Мурасіге і Скуга) з модифікаціями, яке є зручним для посадки експлантів різних розмірів і розмноження мікроклонів павловнії. В роботі використовували агар-агар у концентрації 8 г/л, фітогормон групи цитокінінів - 6-БАП (6-бензиламінопурин) - 1,2 мг/л та фітогормон групи ауксинів - індолілоцтова кислота (ІОК) - 0,5 мг/л [1]. Культивування введених у культуру експлантів здійснювалося в умовах культурального боксу за температури 25°С, інтенсивності освітлення 2500 лк, відносній вологості 56-70% та фотоперіоді 16 год. Рослини, що сформували 6-7 вузлів, вилучали з пробірок і повторно живцювали. Початок формування коренів спостерігався через 6-8 днів. На цьому етапі здійснювали підготовку культур мікроорганізмів до експерименту.

Бактерії штаму B. megaterium ONU500 вирощували у рідкому середовищі LB (Lysogeny broth) стандартного складу, pH - 7,9 у термостаті-шейкері за 180 об/хв до загальної концентрації 9,2 х 10⁷ кл/мл, яку вони досягали на другу добу культивування[13].

Для адаптації рослин до умов in vivo відбирали мікроклони Павловнії повстяної з розвиненою кореневою системою. Рослини мали 5-6 вузлів та були за висотою 5-8 см (Рис. 1).

А В

Рис. 1. Культивування мікроклонів Павловнії повстяної на живильному середовищі МС в умовах in vitro (A, B): А - коренеутворення у мікроклонів Павловнії повстяної при розмноженні в культурі in vitro; В - мікроклони Павловнії повстяної висотою 5-6 см

Величина обсягу вибірки для однієї повторності експерименту становила 30 мікроклонів. На 10-ти мікроклонах тестували дію 4,6 х 10⁷ кл/мл бактерій, на наступних 10-ти мікроклонах - дію 2,3 х 10⁷ кл/мл бактерій, а інші 10 рослин були контрольними зразками.

Адаптацію проводили за розробленою нами методикою у дві стадії. Перша - підготовка фізіологічного стану мікроклонів: розвиток та нормалізація функціонування продихів, активізація процесів фотосинтезу та дихання мікроклонів, нарощування коренів. З цією метою рослинам поступово відкривали доступ до звичайного повітря протягом семи діб в умовах стерильного культурального боксу (рис. 2).

Рис. 2. Мікроклони Павловнії повстяної на першому етапі адаптації до умов in vivo

Потім проводили висадку рослин у підготовлений субстрат, яким слугувала суміш простерилізованих гарячим паром під тиском одної атм ґрунту «Поліський» універсальний (виробник - ТзОВ «Richland», Україна) та корисної домішки «Агроперліт» (виробник - ТзОВ «Richland», Україна).

Після підготовчого етапу адаптації мікроклони розділяли на три групи. Корені рослин першої групи 30 хв перед висадкою витримували у

4,6 х 10⁷ кл/ мл бактерій, другої групи - у 2,3 х 10⁷ кл/мл, а третя слугувала контролем зі стерильною дистильованою водою. Після цього рослини висаджували у персональні ємності із підготовленим ґрунтом. Полив здійснювали автоклавованим дистилятом протягом перших двох тижнів, а потім - звичайною водогінною водою за необхідності.

Спостереження за рослинами після висадки проводили протягом 100 діб. На 14-й, 30-й та 100-й дні адаптації, як найбільш показові для етапів та темпу росту мікроклонів Павлонії повстяної, проводили вимірювання параметрів росту та розвитку досліджуваних рослин. Результати опрацьовували за методом дисперсійного аналізу [3] із використанням комп'ютерних статистичних програм Excel. Дисперсійний аналіз проводили окремо за кожним досліджуваним показником.

Приживлюваність і життєздатність рослин. В зв'язку з тим, що до-слідження з адаптації мікроклонів Павловнії повстяної проводили в осінньо-зимовий період, результати з приживлюваності за всіма дослідним варіантами були досить низькими, але при цьому зберігалися достовірні закономірності (табл.). Було виявлено, що в середньому найбільше життєздатних рослин на 100-ту добу адаптації залишалося у групі мікроклонів з додаванням 2,3 х 10⁷ кл/мл бактерій B. megaterium ONU500, а саме 51,7 ± 0,1%. Для концентрації 4,6 х 10⁷ кл/мл цей показник був нижчим і складав 23,6 ± 0,2%, а у контрольної групи на 100-ту добу залишалося лише 8,3 ± 0,4% життєздатних рослин.

Приживлюваність адаптованих мікроклонів Павловнії повстяної після інокуляції бактеріями B. megaterium ONU500

Показники приживлюваності були відповідно на 43,4% та 15,3% більшими за контрольні, що свідчить про значний позитивний вплив бактерій B. megaterium ONU500 на приживлюваність рослин у процесі адаптації.

Висота та приріст рослин. Протягом усього часу спостереження за рослинами найвищі показники приросту надземної частини реєстрували у групи мікроклонів, які інокулювали бактеріями B. megaterium ONU500 у концентрації 2,3 х 10⁷ кл/мл. Трохи нижчими були рослини з використанням 4,6 х 10⁷ кл/ мл, і найменшу висоту мали рослини у контролі (рис. 3).

На 30-ту добу спостереження контрольні рослини у середньому мали приріст висоти 6,8 ± 0,3 см, рослини інокульовані бактеріями в концентрації 4,6 х 10⁷ кл/мл - висотою 7,1 ± 0,5 см, а ті, що оброблені суспензією 2,3 х 10⁷ кл/мл - 8,3 ± 0,9 см.

Через 100 діб різниця за висотою приросту пагонів між групами складала 6,0 ± 0,02 см, рослини з 4,6 х 10⁷ кл/мл бактерій B. megaterium ONU500 - 13,2 ± 0,02 см, з 2,3 х 10⁷ кл/мл бактерій - 16,5±1,6 см.

Таким чином, завдяки інокуляції коренів мікроклонів Павловнії повстяної перед висадкою в ґрунт суспензією бактерій B. megaterium ONU500 в концентрації 2,3 х 10⁷ клм/л, на 100-ту добу адаптації вдалося прискорити процеси росту рослин та підвищити середню висоту приросту пагонів на 7,2 см порівняно із обробкою 4,6 х 10⁷ кл/мл бактерій та на 10,5 см порівняно із контрольними рослинами.

Найвищі показники за кількістю новоутворених вузлів у рослин протягом 100 діб спостережень мали рослини Павловнії повстяної, корені яких інокулювали бактеріями B. megaterium ONU500 у концентрації 2,3 х 10⁷ кл/ мл (рис. 4).

Рис. 3. Приріст рослин Павловнії повтсяної під час адаптації після інокуляції бактеріями B. megaterium ONU500

Рис. 4. Кількість новоутворених вузлів у рослин Павловнії повстяної під час адаптації після інокуляції бактеріями B. megaterium ONU500

На 30-ту добу експерименту контрольні рослини у середньому мали 3,8 ± 0,3 новоутворених вузлів, рослини з 4,6 х 10⁷ кл/мл бактерій B. megaterium ONU500 - 4,5 ± 0,4 новоутворених вузлів, а група тих, що інокулювали з бактеріями в концентрації 2,3 х 10⁷ кл/мл, мали в середньому 5,6 ± 0,2 новоутворених вузлів.

Через 100 діб після інокуляції кількість новоутворених вузлів у контрольному варіанті складала по 4,3 ± 0,01 вузлів, у варіанті із використанням 4,6 х 10⁷ кл/мл бактерій B. megaterium ONU500 - 6,7 ± 0,3 вузлів, а у рослини в досліді з 2,3 х 10⁷ кл/мл отримано в середньому по 8,3 ± 0,3 вузлів.

Таким чином, застосування методу інокуляції кореневої системи мікро - клонів суспензією B. megaterium ONU500 з концентрацією 2,3 х 10⁷ кл/мл дозволило підвищити утворення кількості вузлів на 4,0 шт. у рослин павловнії порівняно з контролем на 100-ту добу адаптації.

Результати досліджень з адаптації Павловнії повстяної підтвердили, що бактерії штаму B. megaterium ONU500 позитивно впливають на життєздатність лабораторних мікроклонів. Виявлено, що суспензії бактерій B. megaterium ONU500 позитивно впливають на параметри росту та розвитку рослин Павловнії повстяної під час адаптації до умов in vivo.

Встановлено, що найбільш ефективними для удосконалення процесів адаптації Павловнії повстяної є використання суспензії B. megaterium ONU500 з концентрацією 2,3 х 10⁷ кл/мл. Застосування такого прийому дозволяє підвищити життєздатність, приріст рослин та кількість новоутворених вузлів.

Список використаної літератури

1. Аврамович І., Теслюк Н.І. Клональне мікророзмноження Павловнії повстяної (Paulownia tomentosa) II Мікробіологія в сучасному сільськогосподарському виробництві: матеріали ХІІІ наукової конференції молодих вчених, присвяченої 100-річчю з дня заснування Національної академії аграрних наук України (м. Чернігів, 24-25 жовтня 2018 р.): тез. доп.: Чернігів: видавець Брагинець О.В. - 2018. - С. 176-179.

2. Мельничук М.Д., П. Григорюк, Т.В. Новак, О.Л. Кляченко, Ю.В. Коло - мієць, В. Г Спиридонов, Клюваденко А.А., Антіпов І.О., Оверченко В.В. Біо - технологія рослин: практикум. - К., ТОВ «Аграр Медіа Груп», 2012. - 215 с.

3. Менчер Э.М., Земшман А.Я. Основы планирования эксперимента с элементами математической статистики в исследованиях по виноградарству II - Кишинев: Штиинца, 1986. - С. 238.

4. Мерліч А.Г., Ліманська Н.В., Жунько І.Д., Бабенко Д.О. Вплив Lactobacillus plantarum та Bacillus atrophaeus на проростання насіння та ріст проростків пшениці II Мікробіологія і біотехнологія. - 2017. - №2 1. - С. 36-47.

5. Ткаченко К. Адамове дерево, чи царствена павловнії I/ У світі рослин. - №12. - 2013. - С. 26-29.

6. Шурганов Б.В., Мишуткина Я.В., Нескородов Я.Б. Разработка эффективной системы регенерации Paulownia shan tong (P fortunei x P. tomentosa) II Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Агрономия и животноводство. - 2015. - №3. - С. 49-58.

7. Arkhipova T.N., Veselov S.U., Melentiev A.I., Martynenko E.V, Kudo - yarova G.R. Ability of bacterium Bacillus subtilis to produce cytokinins and to influence the growth and endogenous hormone content of lettuce plants II Plant Soil. - 2005. - Vol. 272, №1-2. - P. 201-209.

8. Bahri NB, Bettaieb T. In vitro propagation of a forest tree Paulownia to - mentosa (Thunb.) Steud. - A valuable medicinal tree species II Albanian journal of agricultural sciences. - 2013- V 12 (1). - P 37-42.

9. Chen Y, Yan F, Chai Y., Liu H., Kolter R., Losick R. Biocontrol of tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on conserved genes mediating biofilm formation II Environ. Microbiol. - 2013. - Vol. 15, №3. - P. 848-864.

10. Eppinger M., Bunk B., Johns M.A., Edirisinghe J.N., Kutumbaka K.K., Koenig S.S., Vary P.S Genome sequences of the biotechnologically important Bacillus megaterium Strains QM B1551 and DSM319 II Journal of Bacteriology. - 2011. - V 193 (16). - P. 1499-4213.

11. Huang J., Wei Z., Tan S., Mei X., Shen Q, Xu Y. Suppression of bacterial wilt of tomato by bioorganic fertilizer made from the antibacterial compound producing strain Bacillus amyloliquefaciens HR62 II J. Agric. Food Chem. - 2014. - Vol. 62. - P. 10708-10716.

12. Rahman M.A., F. Rahman, M. Rahmatullah In vitro regeneration of Paulownia tomentosa Steud. plants through the induction of adventitious shoots in explants derived from selected mature trees, by studying the effect of different plant growth regulators // American-Eurasian Journal of Sustainable Agriculture. - 2013. - V 7 (4). - P. 259-268.

13. Shimizu K., Nakamura H., Ashiuchi M Salt-Inducible Bionylon Polymer from Bacillus megaterium // Applied and Environmental Microbiology. -2007. - V 73 (7). - P. 2378-2379.

14. Пат. 126879 Україна, МПК C12N 1/20, А0Ш 63/00, на корисну модель. Штам-антагоніст Bacillus megaterium ONU 500 проти збудників хвороб сільськогосподарських рослин / Іваниця В.О., Крилова К.Д., Ліманська Н.В., Жунько І.Д., Драгуновська О. І.; заявл. 29.01.2018; опубл. 10.07.2018, Бюл. №13. - с 4.

Размещено на Allbest.ru