Получение мышиной клеточной линии FDC-P1 со сверхэкспрессией гена KIT N822K человека

Размещено на http://www.allbest.ru/

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Получение мышиной клеточной линии FDC-P1 со сверхэкспрессией гена KIT N822K человека

Э.Р. Вагапова, Т.Д. Лебедев, В.И. Попенко, О.Г. Леонова

Экспрессия гена KIT, кодирующего рецепторную ти- розинкиназу, характерна для различных злокачественных заболеваний: лейкозов, нейробластом, гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО), мастоцитом и меланом [1--3]. В ходе нормального гемопоэза KIT экспрессируется в субпопуляции незрелых гемопоэтических клеток-предшественни- ков, позитивных по CD34 (маркер стволовых клеток и ранних клеток-предшественников) [4].

В клетках острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) и мастоцитоза встречаются мутации в гене киназы KIT, причем наиболее часто это мутации D816V и N822K, локализованные в тирозинкиназном домене и приводящие к ее конститутивной активации. Активирующие мутации D816V и D814V вызывают существенное уменьшение чувствительности клеток, несущих эти мутации, к ингибитору KIT - иматинибу (Gleevec; Novartis Pharma AG, Basel, Швейцария) in vitro и in vivo [5, 6]. Мутации в киназном домене KIT ассоциированы с повышенной частотой рецидивов

FAB М2 ОМЛ после химиотерапии [7]. Иматиниб - высокоселективный ингибитор киназ Abl, BCR-ABL, PDGFRa/Я и KIT, применяется при BCR-ABL- позитивных лейкозах и ГИСО с мутациями в генах KIT и PDGFR. В комбинации с другими антилейкоз- ными препаратами иматиниб используют при ОМЛ. Показано, что иматиниб эффективно воздействует на клетки ОМЛ у пациентов высоких групп риска. Однако монотерапия иматинибом в высокой концентрации нередко приводит к развитию тяжелой цитопении и поэтому не рекомендуется [8].

На основе цитокинзависимой клеточной линии FDC-P1 лейкоза мышей с невысоким уровнем экспрессии гена KIT дикого типа мы получили новую перевиваемую линию клеток со сверхэкспрессией мутантного гена KIT N822K человека и изучили роль этой мутации, локализованной в тирозинкиназном домене, в поддержании злокачественного статуса лейкозных клеток - выживаемости, чувствительности к препаратам и росте в контакте со стромальными клетками.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культуры клеток

Перевиваемые клетки FDC-P1 культивировали в среде IMDM, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1 мM пи- рувата натрия, 2 мМ L-глутамина и 7% кондиционированной среды клеток WEHI-3B, содержащей интерлейкин-3 (IL3) мыши, при 37°C и 5% CO2. Линию стромальных клеток HS-5 человека культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1 мM пиру- вата натрия, 2 мМ L-глутамина. Все реагенты производства Gibco, ThermoFisher Scientific (США). Линии клеток получены из Heinrich-Pette Institute-Leibniz Institute for Experimental Virology (HPI, Гамбург, Германия) и протестированы на отсутствие контаминации микоплазмой.

Иммуноцитохимический анализ клеток

Для проведения качественного анализа клетки FDC-P1 фиксировали 4% параформальдегидом на 0.1 М фосфатном буфере (ФСБ) в течение 15 мин, далее промывали ФСБ, обрабатывали ФСБ с 0.2% Triton X-100 и антителами, специфичными к белку KIT человека, конъюгированными с красителем PerCP/Cy5.5 (PerCP/Cy5.5, Abcam, ab157320, 1 : 50). После промывки ФСБ клетки заключали в заливочную среду Slowfade gold (Invitrogen, США, s36936), содержащую 1 мкг/мл DAPI (Sigma- Aldrich, США), препараты герметизировали лаком для ногтей. Препараты анализировали c использованием конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Leica, Германия) и объектива HCX PLAPO CS. Для количественного определения интенсивности окраски клетки FDC-P1 обрабатывали антителами, специфичными к белку KIT человека, конъюгированными с красителем PerCP/Cy5.5 (PerCP/Cy5.5, Abcam, ab157320, 1 : 50) и анализировали на проточном цитофлуориметре LSRFortessa (BD Biosciences). Результаты анализировали при помощи программного обеспечения FlowJo.

Количественная ПЦР в реальном времени и дизайн праймеров

РНК выделяли с использованием Trizol (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию препарата РНК и его чистоту определяли на спектрофотометре (NanoDrop). кДНК синтезировали с помощью набора для обратной транскрипции ThermoFisher (Random-праймеры). ПЦР в реальном времени проводили с флуоресцентным красителем Maxima SYBR Green Supermix (Thermo

Scientific) на амплификаторе CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, США). Экспрессию целевых генов нормировали на экспрессию гена Я-актина (b-actin) в каждой пробе. Подсчет Ct и относительного уровня экспрессии производили в программном обеспечении CFX Manager 3.1. В каждом эксперименте использовали не менее трех повторов. Праймеры подбирали с помощью Primer Blast (NCBI, США) по следующим параметрам: размер продукта амплификации 50-200 п.н., температура отжига праймеров 57°С. Энергетические характеристики пар праймеров проверяли с использованием Oligo Analyzer (idtdna) для исключения образования высокоэнергетических шпилечных конструкций и димеров (более 10 кДж). Последовательности праймеров: B-actin forward 5'-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGA-3'; B-actin reverse 5'-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3'; musKIT forward 5'-CCATAGACTCCAGCGTCTTCC-3'; musKIT reverse 5'-GCCTGGATTTGCTCTTTGTT- GTT-3'; humKIT forward 5'-CCACCCTGGTCAT- TACAGAA-3'; humKIT reverse 5'-CTCCAGGTT- TCATGTCCATG-3'.

Статистический анализ

Все тесты и подсчеты отклонений анализировали с использованием программного обеспечения GraphPad prism.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение перевиваемых клеток мышиного лейкоза со сверхэкспрессией мутантного гена KIT N822K человека

С целью анализа онкогенного потенциала рецепторной тирозинкиназы KIT с мутацией N822K в киназном домене, в частности, ее способности влиять на пролиферацию лейкозных клеток миелоидного происхождения, получена клеточная линия FDC-P1 N822K. Для этого ^3-зависимые клетки FDC-P1 мыши трансдуцировали ретровирусным вектором, направляющим экспрессию гена, кодирующего рецепторную тирозинкиназу KIT человека с мутацией N822K. Этот вектор также направляет синтез маркерного зеленого флуоресцентного белка GFP (рис. 1А). Вектор любезно предоставлен Carol Stocking (HPI, Гамбург, Германия). Контрольную линию клеток трансдуцировали исходным ретровирусным вектором, не содержащим KIT N822K. злокачественный кроветворный клетка лейкозный

Популяция клеток с наибольшей интенсивностью флуоресценции в канале FITC, что соответствует высокой экспрессии GFP, была отобрана на клеточном сортере (S3e Cell Sorter, Bio-Rad) (рис. 1Б). В отобранных клетках методом количественной ПЦР в реальном времени определена экспрессия гена KIT (рис. 1Г). Клетки FDC-P1 N822K экспонируют белок KIT (рис. 1В). Присутствие белка KIT человека в клетках FDC-P1 KIT N822K подтверждено с помощью конфокальной микроскопии, тогда как в клетках FDC-P1, трансдуцированных контрольным вектором, экспрессия KIT человека не обнаружена - ни на уровне мРНК, ни на уровне белка (рис. 1В,Д).

Рис. 1. Сверхэкспрессия гена KIT человека в клетках мышиного лейкоза FDC-P1.

А - схема вектора, направляющего экспрессию гена KIT N822K человека. Б - сортировка популяции клеток с высокой интенсивностью флуоресценции в канале FITC (FL1) (выделено контуром), серым показаны нетрансдуцированные клетки FDC-P1, зеленым - трансдуцированные вектором KIT N822K. Экспонирование рецептора KIT на поверхности контрольных клеток и клеток со сверхэкспрессией мутантного гена KIT N822K человека. В -- клетки обработаны моноклональными антителами к KIT человека, конъюгированными с PerCP/Cy5.5 и проанализированы на проточном цитоф- луориметре. Интенсивность не обработанных антителами клеток показана серым цветом, обработанных антителами к KIT - розовым. Г - уровень экспрессии мРНК гена KIT мыши (mus) и KIT человека (hum) в клетках FDC-P1 со сверхэкспрессией KIT N822K по данным ПЦР. Д - микрофотография клеток FDC-P1, инкубированных с антителами к рецептору KIT человека (розовый цвет) и красителем ДНК DAPI (зеленый)

Введение KIT N822K приводит к IL3- независимому росту клеток FDC-P1

Контрольные клетки и клетки FDC-P1 N822K были посеяны с одинаковой плотностью. Подсчет клеток проводили в течение 6 дней. Введение мутантного KIT N822K не влияло на скорость роста клеток FDC-P1 в присутствии IL3 (рис. 2А).

Сверхэкспрессия мутантного гена KIT в клетках FDC-P1 приводит к их фактор-независимому росту (рис. 2А). Скорость роста контрольных клеток FDC-P1 существенно снижается в среде с пониженным содержанием кондиционированной среды с IL3 (0.25%).

Мы не зарегистрировали существенного изменения скорости роста клеток под действием лиганда KIT - SCF (Abcam) (рис. 2Б). Контрольные и FDC-P1

22К-клетки были обработаны противоопухолевыми препаратами: иматинибом (7.5 и 10 мкМ) и ци- тарабином (75 и 100 нМ). Количество клеток подсчитывали на 3 день после добавления препаратов. Концентрация иматиниба, ингибирующая рост контрольных клеток FDC-P1 на 50% (IC), составила 10 мкМ. Клетки FDC-P1 со сверхэкспрессией KIT N822K были более чувствительными к этой концентрации препарата (рис. 2В). Чувствительность клеток к цитарабину осталась такой же, как в контроле (рис. 2Г).

Рис. 2. Скорость роста клеток FDC-P1 в присутствии IL3 (сплошная линия) и при пониженном содержании IL3 (пунктирная) (А). Количество клеток FDC-P1, обработанных рекомбинантным SCF, в 1 мл среды (Б). Количество клеток FDC-P1 (в %) относительно необработанных клеток на 3 день после добавления иматиниба (В) и цитараби- на (Г). * - p < 0.05

Полученные нами данные соответствуют результатам, согласно которым мутация в тирозинкиназном домене KIT, в частности D816V, усиливает чувствительность к иматинибу [9].

Получение смешанной культуры лейкозных и стромальных клеток

Факторы, которые продуцируют стромальные клетки, участвуют в стимуляции пролиферации кроветворных клеток, регуляции клеточного цикла, а также контролируют апоптоз. В то же время процессы, происходящие при контакте стромальных клеток с лей- козными, плохо изучены.

Перевиваемые стромальные клетки человека HS-5 были посеяны в количестве 5000 клеток на лунку. На следующий день культуральную среду клеток HS-5 сменили на среду IMDM, содержащую клетки FDC-P1 (500 клеток на лунку). Через 3 и 5 дней после посева подсчитали количество клеток в суспензионной фракции. Прямой контакт лейкозных и стромальных клеток приводит к снижению скорости роста контрольных клеток FDC-P1 (рис. 3А, Б), но не клеток FDC-P1, сверхэкспрессирующих KIT N822K.

Рис. 3. Количество клеток FDC-P1, культивируемых в отсутствие (зеленый цвет) и в присутствии стромальных клеток HS-5 (розовый цвет) на 3-й (А) и 5-й (Б) день; фотографии культуры клеток FDC-P1, смешанных с HS-5: контрольные (Я), N822K (Г). Продольные клетки стромы адгезируют ко дну планшета, круглые клетки FDC-P1 находятся в суспензии

Известно, что цитокины и факторы роста, продуцируемые клетками стромы (в том числе HS-5), могут модулировать экспрессию гена KIT в кокульти- вируемых с ними лейкозных клетках [10]. Вероятно, скорость роста клеток FDC-P1 с эктопической экспрессией KIT N822Kне меняется при сверхэкспрессии данной киназы. Кроме того, скорость роста может отличаться из-за различий в адгезии контрольных клеток FDC-P1 и клеток FDC-P1 N822K.

Заключение

IL/3-зависимая мышиная клеточная линия FDC-P1 широко используется для исследования онкогенного действия киназ, транскрипционных факторов, а также эффективности противолейкозных препаратов [11, 12]. Нами получена и охарактеризована линия клеток FDC-P1 со сверхэкспрессией мутантного гена KIT N822K человека. Показано, что мутация N822K в гене KIT приводит к увеличению чувствительности клеток FDC-P1 к иматинибу. Мутация D419A во внеклеточном домене рецептора KIT также повышает чувствительность клеток к иматинибу [9]. Показано снижение скорости роста контрольных клеток при контакте со стромой, что не характерно для клеток FDC-P1, экспрессирующих мутантный ген KIT N822K. Исследование механизмов взаимодействия лейкозных клеток со стромальными требует более пристального внимания для установления возможного вклада стромальных клеток в ответ лейкозных клеток на химиотерапевтические агенты. Полученная нами модель может использоваться для тестирования различных противолейкозных препаратов, в том числе при совместном культивировании лейкозных и стромальных клеток.

Список литературы

1. Hassan H.T. // Leuk. Res. 2009. V. 33. № 1. P. 5-10.

2. Tabone S., Thйou N., Wozniak A., Saffroy R., Deville L., Juliй C., Callard P., Lavergne-Slove A., Debiec-Rychter M., Lemoine A., et al. // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Basis Dis. 2005. V. 1741. № 1-2. P. 165-172.

3. Krams M., Parwaresch R., Sipos B., Heidorn K., Harms D., Rudolph P. // Oncogene. 2004. V. 23. № 2. P. 588-595.

4. Thorйn L.A., Liuba K., Bryder D., Nygren J.M., Jensen C.T., Qian H., Antonchuk J., Jacobsen, S.-E.W. // J. Immunol. Am. Ass. Immunol. 2008. V. 180. № 4. P. 2045-2053.

5. Growney J.D., Clark J. J., Adelsperger J., Stone R., Fabbro D., Griffin J.D., Gilliland D.G. // Blood. Am. Soc. Hematol. 2005. V. 106. № 2. P. 721-724.

6. Ustun C., DeRemer D.L., Akin C. // Leuk. Res. Pergamon. 2011. V. 35. № 9. P. 1143-1152.

7. Wang Y.-Y., Zhao L.-J., Wu C.-F., Liu P., Shi L., Liang Y., Xiong S.-M., Mi J.-Q., Chen Z., Ren R., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. № 4. P. 1104-1109.

8. Kindler T., Breitenbuecher F., Marx A., Beck J., Hess G., Weinkauf B., Duyster J., Peschel C., Kirkpatrick C.J., Theobald M., et al. // Blood. Am. Soc. Hematol. 2004. V. 103. № 10. P. 3644-3654.

9. Cammenga J., Horn S., Bergholz U., Sommer G., Besmer P., Fiedler W., Stocking C. // Blood. 2005. V. 106. № 12. P. 39583961.

10. Gordon P.M., Dias S., Williams D.A. // Leukemia. 2014. V. 28. № 11. P. 2257-2260.

11. Gaikwad A., Prchal J.T. // Exp. Hematol. 2007. V. 35. № 11. P. 1647-1656.

12. McCallum L., Price S., Planque N., Perbal B., Pierce A., Whet- ton A.D., Irvine A.E. // Blood. 2006. V. 108. № 5. P. 1716-1723.

Реферат

Для изучения процессов злокачественного перерождения кроветворных клеток и механизмов развития резистентности лейкозных клеток к химиотерапевтическим препаратам необходимы новые модельные системы. На основе цитокинзависимой мышиной клеточной линии FDC-P1 острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) нами получены перевиваемые клетки с эффективной эктопической экспрессией мутантного гена KIT N822K человека. Изучена роль повышенной экспрессии мутантного KIT в выживаемости и чувствительности этих клеток к терапевтическим препаратам. Также создана и охарактеризована смешанная культура, состоящая из линии FDC-P1 лейкозных клеток мыши и линии HS-5 стромальных клеток человека. Полученные результаты могут быть использованы для изучения роли мутаций N822K в гене KIT в ответе клеток на противолейкозные препараты, факторы роста и цитокины. Эти данные представляют интерес для разработки эффективных подходов к терапии лейкозов.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), рецепторная тирозинкиназа KIT, FDC-P1, KIT N822K, стромальные клетки.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ SCF - фактор стволовых клеток (stem cell factor); ОМЛ - острый миелоидный лейкоз; FAB M2 - острый миелобластный лейкоз с созреванием (подтип ОМЛ по Франко-АмериканоБританской классификации); CD34 - дифференцировочный кластер 34.

Размещено на Allbest.ru