Влияние 1-гидрокси-1,1-этилидендифосфоновой кислоты на поведение самок крыс в тестах "открытое поле" и "приподнятый крестообразный лабиринт"

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Влияние 1-гидрокси-1,1-этилидендифосфоновой кислоты на поведение самок крыс в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт»

Черетаев И.В.

Чуян Е.Н.

Раваева М.Ю.

Шульгин В.Ф.

Аннотация

противотревожный активность поведенческий животное

В статье изложены данные изучения влияния 1-гидрокси-1,1-этилидендифосфоновой кислоты в широком диапазоне доз (от 5 до 200 мг/кг) на поведение самок крыс в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт». Опыты проведены на 60 крысах-самках линии Вистар. Показано, что изучаемая кислота в тесте «открытое поле» в дозе 150 мг/кг угнетает локомоторную активность и поисково-исследовательское поведение испытуемых животных, что указывает на седативный и анксиогенный эффект этой дозы кислоты. Эти эффекты отражались в достоверном снижении относительно контроля общего пройденного расстояния на 49,06 % (р?0.001, n=10) и исследовательской активности норок на 51,85 % (р?0.05, n=10). В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» показан слабый анксиогенный эффект 1-гидрокси-1,1-этилидендифосфоновой кислоты в дозе 150 мг/кг, проявлявшийся лишь в достоверном снижении относительно контроля времени выхода крыс в центр лабиринта на 79,35 % (р?0.05, n=10).

По данным обзорных исследований [1, С. 168-176], [2, С. 83-88], [3, С. 5-13], тревожные и тревожно-депрессивные аффективные расстройства поведения являются глобальной проблемой всего человечества. Распространены эти расстройства и на территории России и, в частности, Республики Крым, [4, С. 80-81]. В связи с этим, проведение биоскрининга различных химических биологически активных веществ на наличие противотревожной (анксиолитической) активности с использованием поведенческих моделей на животных актуально для прикладной фармакологии и медицины.

На настоящий момент для проведения таких биоскрининговых исследований перспективны бисфосфонаты. Так, 1-гидроксиэтилиден-1,1-дифосфоновая кислота (ГДК) существенно влияет на обмен кальция и аденозинтрифосфата (АТФ) в клетке [5, С. 1255-1262]. Как известно, кальций и АТФ - основные вторичные мессенджеры в клетках нервной ткани [6, С. 1-11], [7, С. 1261-1296], [8, С. 326-336], поэтому колебания их уровня способны значительно повлиять на функционирование ЦНС и обусловленные активностью её нейромедиаторных систем поведенческие реакции и психоэмоциональный статус организма. В отношении ГДК нами ранее было показано, что она в определённых дозах обладает противоболевой активностью, повышая у самцов и самок крыс пороги температурной и механической болевой чувствительности [9, С. 162-175], [10, С. 92-97].

Несмотря на сказанное выше, непосредственные данные о влиянии ГДК на тревожное поведение отсутствуют.

Цель работы - изучить влияние ГДК на поведение самок крыс в тестах «открытое поле» (ОП) и «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ).

Методы и принципы исследования

Перед началом в тесте ОП были выбраны 60 лабораторных самок крыс линии Вистар весом 180-200 г со средним показателями поведения по результатам данного теста, что позволяло достичь однородности поведенческих показателей в исследуемой выборке крыс.

Экспериментальные самки находились в условиях содержания, аналогичных представленным в публикациях [9, С. 162-175], [10, С. 92-97]. Научные исследования были выполнены согласно требованиям ГОСТ Р-53434-2009 и Директивой ЕС 2010/63/EU от 22.09.2010 г. Опыты были проведены на базе ЦКП научным оборудованием «Экспериментальная физиология и биофизика» Таврической академии КФУ им. В.И. Вернадского.

В эксперименте с БТП участвовало 60 самок крыс («ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово»), разделенных на 6 групп по 10 самок. Перед проведением эксперимента у самок была достигнута синхронизация фаз эстрального цикла. Самкам контрольной группы делали однократные внутрибрюшиные инъекции 0,2 мл 0,9-%-ного раствора хлорида натрия, они содержались в стандартных условиях (согласно ГОСТ Р-53434-2009), остальные 5 экспериментальных групп получали по 0,2 мл однократных внутрибрюшинных инъекций БТП в одной из исследуемых доз (5, 50, 100, 150 и 200 мг/кг соответственно). Тестирование поведенческих показателей у животных проводили через 1 час после инъекций в тестах ОП и ПКЛ, использующихся согласно [11, С. 264-275] в исследованиях по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия веществ. Постоянство освещения опытных установок контролировали с помощью люксметра Testo 540 (ФРГ), интенсивность освещения составляла 250±15 Лк. Установки тестов изнутри протирали мокрыми и сухими салфетками после каждого животного.

В тесте ОП проводили тестирование общей двигательной и ориентировочно-исследовательской активности крыс в установке IR Actimeter (Pan Lab Harvard Apparatus, Испания) - установке размером 45 х 45 см с прозрачными полипропиленовыми стенками высотой 20 см с двумя инфракрасными рамками, выполняющих роль датчиков движений. Принцип теста заключался в количественном измерении компонентов поведения животного, помещенного в неизвестное открытое пространство и испытывающего с одной стороны страх перед неизвестностью, а с другой - стремление исследовать новую обстановку [11, С. 267-268], [12, С. 12-16], [13, С. 68-77]. Регистрацию и анализ данных теста проводили с помощью программного обеспечения Actitrack 2.0 (Pan Lab Harvard Apparatus, Испания). Видеорегистрацию поведенческих реакций животного осуществляли с помощью цифровой видеосистемы с переносным штативом VS1304-P (НПК Открытая Наука, Россия). Регистрировали такие показатели поведенческой активности крыс, как горизонтальная двигательная активность, которая представляла собой общее пройденное расстояние (в см) внутри поля; вертикальная двигательная активность (ВДА), общее количество актов исследовательской активности (ИА); общее количество актов груминга; количество актов дефекации и уринаций (показатели уровня эмоциональности животного). Продолжительность теста составляла 3 мин, в течение которых регистрировали с помощью актиметра IR Actimeter и видеокамеры VS1304-P поведенческие характеристики.

Тест ПКЛ (НПК Открытая Наука, Россия) представлял собой крестообразную установку, пол и стенки которой сконструированы из жёсткого поливинилхлорида серого цвета. Ширина рукавов 14 см при длине 50 см, высота стенок в закрытых рукавах составляла 30 см, а высота борта открытых рукавов - 1 см. В месте пересечения рукавов располагалась центральная площадка 14 х 14 см. Торцевые стенки на концах закрытых рукавов отсутствовали. Лабиринт располагался на высоте 55 см над уровнем пола на тележке со стопорами, выполненной из крашеного алюминия и стальных труб. Продолжительность теста составляла 3 мин. С помощью видеокамеры VS1304-P регистрировали такие характеристики локомоторного и ориентировочно-исследовательского поведения грызунов: время, проведённое в открытых, закрытых рукавах и центре лабиринта (эти показатели отражают исследовательское и тревожное поведение у грызунов), вертикальную двигательную активность (ВДА), количество заглядываний вниз с краёв открытых рукавов [11, С. 266-267], [14, С. 322-328], [15, C. 129-130].

Данные представлены в виде медианы и межквартильного диапазона (25 и 75 %), их статистический анализ и графическое представление выполнены в программном пакете Graph Pad Prism 7.0. Достоверность различий между группами определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) c апостериорным тестом Тьюки и непараметрическим критерием множественных сравнений Данна [11, С. 903-906].

Основные результаты и обсуждение

Результаты проведённого анализа влияния ГДК на поведение самок крыс в тесте ОП представлены на рис. 1.

Показано, что ГДК в тесте ОП в исследуемом широком диапазоне доз от 5 до 200 мг/кг в дозе 150 мг/кг приводила к достоверному снижению общего пройденного расстояния (см. рис. 1, а) на 49,06 % (р?0.001, n=10), то есть угнеталась локомоторная активность испытуемых животных. Также в данном тесте обнаружено угнетающее действие ГДК у самок крыс в дозе 150 мг/кг (см. рис. 1, б) на ИА (показатель характеризует исследовательское, норковое поведение грызунов [11, С. 267]) на 51,85 % (р?0.05, n=10) относительно контроля. Эти данные согласно официальному экспериментальному протоколу теста [11, С. 267-268] свидетельствуют о седативном и анксиогенном эффекте данного вещества в указанной дозе. Остальные показатели теста - ВДА, общее количество актов груминга, количество актов дефекации и уринаций ни в одной из исследуемых доз ГДК достоверно не отличались от контроля, на рис. 1 они не показаны.

Рис. 1. Влияние 1-гидрокси-1,1-этилидендифосфоновой кислоты на поведение самок крыс в тесте «открытое поле»:

а - общее пройденное расстояние,

б - исследовательская активность;

Примечание: * - p?0.05; *** - p?0.001 - достоверность отличий показателя по сравнению с контролем (значение медианы контроля принято за 100 %)

В более аверсивном тесте ПКЛ (см. рис. 2), был показан слабый анксиогенный эффект ГДК только в дозе 150 мг/кг. В данном тесте у самок крыс достоверно снижалось относительно контроля только время выхода в центр лабиринта на 79,35 % (р?0.05, n=10, см. рис. 2, в), что и свидетельствует согласно [11, С. 266-267], [14, С. 322-328] об увеличении тревожности животных и наличии некоторого анксиогенного эффекта ГДК. При этом остальные основные (время, проведённое в открытых и закрытых рукавах лабиринта) и косвенные показатели (ВДА, количество заглядываний вниз) теста достоверно не изменялись, поэтому можно говорить лишь о слабом анксиогенном эффекте ГДК в дозе 150 мг/кг. Тем не менее, данные тестов ОП и ПКЛ согласуются между собой, указывая на угнетающее действие ГДК именно в дозе 150 мг/кг на двигательную активность и ориентировочно-исследовательское поведение самок крыс.

В целом, данные тестов ОП и ПКЛ согласуются между собой, указывая на угнетающее действие ГДК на поведение самок крыс в дозе 150 мг/кг.

Рис. 2. Влияние 1-гидрокси-1,1-этилидендифосфоновой кислоты на поведение самок крыс в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт»:

а - время, проведённое в открытых рукавах,

б - время, проведённое в закрытых рукавах,

в - время, проведённое в центре лабиринта,

г - вертикальная двигательная активность,

д - количество заглядываний вниз с краёв открытых рукавов;

Примечание: * - p?0.05; - достоверность отличий показателя по сравнению с контролем (значение медианы контроля принято за 100 %)

Таким образом, седативный и слабый анксиогенный эффект ГДК у самок крыс проявляется только в дозе 150 мг/кг. Можно сказать, что данное соединение является относительно безопасным, и только в высокой дозе может существенно изменять психоэмоциональный статус организма крыс, увеличивая тревожность самок крыс и снижая их локомоторную активность. С учётом коэффициента пересчёта доз (в мг/кг) с животных на человека [11, С. 22], учитывающего соотношение между массой и площадью поверхности тела человека и лабораторных крыс, ГДК можно рекомендовать для дальнейших клинических испытаний и применения у женщин при однократном использовании в дозах ниже 885 мг/кг без риска выраженных побочных эффектов в отношении базового уровня тревожности. Предварительные исследования анальгетического эффекта ГДК позволяют рекомендовать её для однократного применения в ещё более низких дозах [10, С. 92-97].

Обнаружено, что ГДК в протестированном диапазоне доз от 5 до 200 мг/кг обладает угнетающим действием на двигательную активность и ориентировочно-исследовательское поведение самок крыс только в дозе 150 мг/кг:

В тесте ОП ГДК в дозе 150 мг/кг угнетает локомоторную активность, поисково-исследовательское поведение испытуемых животных, достоверно снижая относительно контроля общее пройденное расстояние на 49,06 % (р?0.001, n=10) и ИА на 51,85 % (р?0.05, n=10). Эти результаты указывают на седативный и анксиогенный эффект ГДК в дозе 150 мг/кг.

В тесте ПКЛ показан слабый анксиогенный эффект ГДК в дозе 150 мг/кг, проявлявшийся лишь в достоверном снижении относительно контроля времени выхода крыс в центр лабиринта на 79,35 % (р?0.05, n=10).

Список литературы

1. Kessler R.C. Lifetime prevalence and age-on-set distributions of mental disorders in the World Health Organisation's World Mental Health Survey Initiative / R.C. Kessler, M. Angermeyer, J.C. Anthony and others // Word Psychyatry. - 2007. - V. 6. - P. 168-176.

2. Федотова А.В. Тревожно-депрессивные расстройства в общеклинической практике / А.В. Федотова // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. - 2008. - № 3. - С. 83-88.

3. Марута Н.А. Тревожная депрессия (клинико-психопатологическая и патопсихологическая характеристика) / Н.?А. ?Марута,?Т.?В.?Панько,? Г.?Ю. Каленская [и др.]. // Таврический журнал психиатрии. - 2014. - Т. 18, № 2 (67). - С. 5-13.

4. Строевский В.В.? Профилактика суицидов у пациентов с аффективными расстройствами в АР Крым / В.В.?Строевский // Таврический журнал психиатрии. - 2014. - Т. 18, № 2 (67). - С. 80-81.

5. Lehenkari P.P. Further insight into mechanism of action of clodronate: inhibition of mitochondrial ADP/ATP translocase by a nonhydrolyzable, adenine-containing metabolite / P.P. Lehenkari, M. Kellinsalmi, J.P. Nдpдnkangas and others. // Mol. Pharm. - 2002. - V. 61, No 5. - P. 1255-1262. doi: 10.1124/mol.61.5.1255.

6. Kugelgen I. Pharmacology of mammalian P2X and P2Y-receptors / I. Kugelgen // Biotrend Reviews. - 2008. - № 3. - P. 1-11.

7. Berridge M.G. The Inositol Trisphosphate/Calcium Signaling Pathway in Health and Disease / M.G. Berridge // Physiol. Rev. - 2016. - V. 96, No - Р. 1261-1296. doi: 10.1152/physrev.00006.2016.

8. Черетаев И.В. АТФ-зависимые и кальциевые механизмы влияния салицилатов на электрические потенциалы нейронов моллюска Helix Albescens // И.В. Черетаев, И.И. Коренюк, Д.Р. Хусаинов и др. // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2015. - Т. 101, № - С. 326-336.

9. Черетаев И.В. Влияние 1-гидрокси-1,1-этилидендифосфоновой кислоты, бис(2-пиридил-1,2,4-триазолил-3)пропана и их аддукта на болевую чувствительность самцов крыс (часть 1) / И.В. Черетаев, М.Ю. Раваева, Э.Р. Джелдубаева [и др.]. // Учёные записки Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского. Биология, химия. - 2019. - Т. 5 (71), № 2. - С. 162-175.

10. Черетаев И.В. Влияние 1-гидрокси-1,1-этилиден-дифосфоновой кислоты и бис(2-пиридил-1,2,4-триазолил-3)пропана на болевую чувствительность самок крыс / И.В. Черетаев, Е.Н. Чуян, М.Ю. Раваева и др. // Международный научно-исследовательский журнал. - 2019. - № 7 (85), Ч. 1. - С. 92-97. doi: https://doi.org/10.23670/IRJ.2019.85.7.018.

11. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / А.Н. Миронов, Н.Д. Бунатян, А.Н. Васильев и др. - Ч. 1. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.

12. Вдовина Н.В. Исследование особенностей поведения здоровых крыс разного возраста и крыс-опухоленосителей в «открытом поле» / Н.В. Вдовина, Е.С. Клинцова, Т.Г. Щербатюк // Современные технологии в медицине. - 2010. - № 2. - С. 12-16.

13. Митрошина Е.В. Адаптационная роль глиального нейротрофического фактора при ишемии головного мозга / Е.В. Митрошина, Б.Ж. Абогессименгане, М.Д. Уразов и др. // Современные технологии в медицине. - 2017. - Т. 9, № 1. - С. 68-77. doi: 10.17691/stm9.1.08.

14. Walf A.A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents / A.A. Walf, C.A. Frye // Nature Protocols. - 2007. - V. 2, No 2. - Р. 322-328. doi:10.1038/nprot.2007.44.

15. Sestakova N. Determination of motor activity and anxiety-related behaviour in rodents: methodological aspects and role of nitric oxide / N. Sestakova, A. Puzserova, M. Kluknavsky [et al.]. // Interdiscip. Toxicol. - 2013. - V. 6 (3). - P. 126-135. doi: 10.2478/intox-2013-0020.

Размещено на Allbest.ru