Биологическое обоснование применения микробных компонентов Trichoderma spp. in vitro для оздоровления овощных культур закрытого грунта от фитопатогенной инфекции

Размещено на http://www.allbest.ru/

Орловский государственный аграрный университет

Биологическое обоснование применения микробных компонентов Trichoderma spp. in vitro для оздоровления овощных культур закрытого грунта от фитопатогенной инфекции

Гнеушева И.А., Павловская Н.Е., Солохина И.Ю., Лушников А.В.

Сегодня во всем мире наблюдается стремление снизить зависимость сельского хозяйства от пестицидов с целью повышения потребительской и экологической безопасности сельскохозяйственной продукции. При производстве биологически полноценных и безопасных продуктов питания, в том числе кормов, в экологическом земледелии не допускается применение синтетических регуляторов роста, химических пестицидов, поэтому все больший интерес приобретают биоудобрения, биопрепараты и пестициды биологического происхождения [1].

В настоящее время для интенсификации роста растений, а также для борьбы с фитопатогенной инфекцией, в составе биологических средств защиты широко используют бактерии, чаще Bacillus subtilis. Тем не менее, многолетние обширные научные исследования доказали, что штаммы почвенных грибных микроорганизмов, которыми обработаны семена сельскохозяйственных культур, повышают их всхожесть, укрепляют развитие рассады, улучшают питание азотом и фосфором, стимулируют процесс корнеобразования благодаря выделению физиологически активных веществ [2].

Применяют микробную массу вместе с выделяемыми ими метаболитами (обычно антибиотиками) - это «Бактофит» (на основе культуральной жидкости Bacillus subtilis и продуцируемого им антибиотика), «Агат-25» (на основе Pseudomonas aureofaciens и продуктов метаболизма), «Триходермин» (споровая масса гриба Trichoderma lignorum и антибиотики: триходермин, веридин и глиотоксин). Эти препараты эффективнее и дешевле химических пестицидов, так как не требуют разделения компонентов; до достижения эффективного биологического эффекта необходимы наноконцентрации.

Грибы рода Trichoderma spp. являются одними из наиболее часто используемых микробных агентов биологического контроля в сельском хозяйстве. В настоящее время они входят в состав биопестицидов, биоудобрений, усилителей роста и стимуляторов естественной резистентности. Различные разновидности этих грибов используются в сельскохозяйственной практике для борьбы с фитопатогенами культур как открытого, так и закрытого грунта. Наибольшее биологическое и коммерческое значение имеют виды Trichoderma harzianum, Trichoderma hamatum и Trichoderma lignorum, а также их биотипы. Действующим началом препаратов на основании гриба-антагониста являются его споры, мицелий и продукты метаболизма [3, 4, 5].

Грибы рода Trichoderma spp. продуцируют антибиотики, миколитические ферменты, физиологически активные вещества, которые обеспечивают защиту сельскохозяйственного растения в течение всего вегетационного периода. Препараты на основе клеток микромицета действуют только на фитопатогенные грибы, не оказывают негативного влияния на непатогенную микрофлору почвы [6, 7].

Обширный список биологических препаратов для защиты растений указывает на их востребованность в растениеводстве, они существенно снижают заболеваемость растений распространенными грибными и бактериальными инфекциями: фитофторозом, черной ножкой, фузариозом, мучнистой росой и др. [8].

Источники заражения овощеводческой продукции фитопатогенными микроорганизмами в естественных условиях различны. Одними из важнейших являются уже зараженные семена и поражение проростков вирусными инфекциями на ранних стадиях развития микрорастения. Вирусы, как правило, проникают в растение при их ранениях (при пересадке, обработке почвы и др.) и снижают иммунитет, тем самым открывая ворота бактериальным, а затем и грибным инфекциям [9].

Таким образом, для защиты сельскохозяйственных растений от комплекса фитопатогенов, особенно в условиях закрытого грунта, где распространение заболеваний, как грибных, так и бактериальных, происходит скоротечно, необходимо иметь препарат, сочетающий иммуномодулирующие свойства, бактерицидное и фунгицидное действие.

В связи с этим целью данного исследования являлось выявление перспективных штаммов-антагонистов из рода Trichoderma spp. и обоснование применения их микробных компонентов в условиях in vitro для оздоровления овощных культур закрытого грунта от бактериальной и грибной инфекции.

Экспериментальная часть

В исследовании использовали потенциальные антагонисты фитопатогенных микроорганизмов - штаммы грибов рода Trichoderma spp. из учебной коллекции кафедры биотехнологии ФГБОУ ВО Орловский ГАУ: Trichoderma harzianum, Trichoderma lignorum, Trichoderma viride, Trichoderma lixii. Действующим началом препарата на их основе являлись продукты метаболизма - метаболиты, полученные экстрагированием органическими растворителями из глубинных культур.

Штаммы фитопатогенных микроорганизмов Xanthomonas vesicatoria, Phoma destructivа, Pseudomonas syringae, Ascochyta cucumis были выделены в 2017 г. с пораженных заболеваниями вегетативных масс и плодов овощных культур закрытого грунта.

Выделение фитопатогенов в чистую культуру проводили по стандартной методике. Пораженные листья и стебли измельчали при помощи ножниц, поверхностно стерилизовали этиловым спиртом и фламбированием, помещали на поверхность картофельно-глюкозного агара (для грибов) и ГМФ-агара (для бактерий) в чашки Петри и инкубировали в термостате до появления колоний.

Путем последовательных многократных пересевов фитопатогены выделяли в чистые культуры, просматривали под микроскопом и идентифицировали по морфо-культуральному типу колоний, морфологии конидий, а также по типу спороношения у грибов по определителю Саттона (Саттон Д. и др.1997) и у бактерий - по определителю бактерий Берджи (Берджи, 1997).

Возбудитель черной бактериальной пятнистости томата Xanthomonas vesicatoria относится к грамотрицательным не спорообразующим аэробным палочкам размером 0,6-0,7х1,0-1,5 мкм с одним полярным жгутиком. Встречаются одиночно, парами или цепочками.

Возбудитель фомозной гнили томата - Phoma destructivа. Болезнь может поражать все надземные органы растения. На листьях она вызывает появление многочисленных мелких пятен с окраской от темно-коричневой до черной, на которых, по мере их увеличения в размерах, могут образовываться концентрические кольца. На стеблях образуются темно-коричневые пораженные участки с концентрическими кругами. Повреждения на плодах обычно появляются со стороны чашечки в виде мелких вдавленных пятен, которые позднее превращаются в более крупные черные вдавленные пятна с кожистой поверхностью, в центре которых образуются многочисленные пикниды гриба.

Возбудитель угловатой пятнистости листьев огурца - бактерия рода Pseudomonas syringae. Данный вид относится к семейству псевдомонад, принадлежащих к классу бактерий актиномицет. Это заболевание считается одной из наиболее опасных болезней огурца: оно начинает проявляться в рассадный период, и к концу вегетации число больных растений может составить 100%, а больных плодов -- до 50%.

Возбудитель аскохитоза огурца Ascochyta cucumis - несовершенный гриб из порядка Пикнидиальные, но в цикле развития патогена часто развивается сумчатая стадия. Болезнь чаще распространена в тепличных хозяйствах. Поражаются аскохитозом листья, стебли, реже - плоды огурца.

Объектами исследования являлись семена и микрорастения томата сорта «Санька», огурца сорта «Герман F1».

В условиях in vitro поражение семян фитопатогенной инфекцией происходит быстрее. Поэтому в пробирках выращивали микрорастения огурца, томата, семена которых были заражены фитпатогенными возбудителями: огурца - Pseudomonas syringae, Ascochyta cucumis, томата - Xanthomonas vesicatoria, Phoma destructivа. В среду выращивания микрорастений (Мурасиге-Скуга) вносили метаболиты штаммов Trichoderma spp.: T. harzianum, T. lignorum, T. viride, T. lixii. Микрорастения оценивали по морфометрическим показателям на 10-е сутки вегетации. Контролем служили микрорастения, семена которых обработаны биологическим препаратом на основе Bacillus subtilis «Фитоспорин-М» (контроль-Ф) и заявленными фитопатогенными микроорганизмами (контроль-0).

Антимикробное действие метаболитов на основе мицелиальных грибов рода Trichoderma spp. на фитопатогенные микроорганизмы, наиболее часто встречающиеся на овощных культурах закрытого грунта, проверяли in vitro, руководствуясь методическими указаниями МЗ РФ (МУК 4.2.1890-04. «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»).

Действие метаболитов микромицетов в отношении фитопатогенных микроорганизмов определяли в условиях in vitro методом диффузии в агар с помощью стандартных дисков производства ЗАО НИЦФ (г. Санкт-Петербург).

Для этого из 5-суточной чистой культуры фитопатогенных микроорганизмов, выращенных на плотной среде, готовили в физиологическом растворе суспензию до концентрации 0,5 ЕД по оптическому стандарту мутности Мак-Фарланда (McF). На плотную питательную среду взвесь исследуемых культур наносили с помощью стерильного ватного тампона, распределяя по всей поверхности штриховыми движениями в трёх направлениях, и помещали на диски с метаболитами исследуемых мицелиальных грибов. Интерпретацию результатов определения чувствительности фитопатогенных микроорганизмов к метаболитам микроорганизмов-антагонистов проводили в соответствии с инструкцией по применению дисков, учитывая диаметр зон задержки роста.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета Microsoft Office 2010 (Excel). Все опыты проводились в пятикратной повторности.

Обсуждение результатов

В данной научной работе исследования по биологическому обоснованию применения микробных метаболитов для оздоровления овощных культур осуществлялись на следующих модельных системах: огурец - Pseudomonas syringae, Ascochyta cucumis, томат - Xanthomonas vesicatoria, Phoma destructivа.

На 10-е сутки выращивания микрорастений огурца и томата в условиях in vitro на среде Мурасиге-Скуга с добавлением метаболитов некоторых штаммов Trichoderma spp.: T. harzianum, T. lignorum, T. viride, T. lixii. проводили подсчет длины корешков и проростков в каждом заявленном варианте опыта. Результаты исследования представлены на рис. 1-2.

Исследования показали, что длина проростков и корешков микрорастений как огурца, так и томата, различны в зависимости от того, чем были обработаны их семена. Семенные материалы огурца и томата, обработанные исследуемыми фитопатогенными бактериями и грибами, в культуре in vitro отставали в росте и развитии от других вариантов опыта, где проводились обработки биологическим препаратом «Фитоспорин-М» и метаболитами Trichoderma spp.

Проростки и корешки 10-дневных микрорастений огурца, зараженных бактериями рода Pseudomonas syringae, на 24,6-25,2 % отставали в росте от контрольных микрорастений, обработанных «Фитоспорин-М». Грибная инфекция (возбудитель Ascochyta cucumis) снижает рост микрорастений огурца на 9,0-17,8 %. Такая же тенденция сохранена и на микрорастениях томата. Бактериальная инфекция снижает рост проростков и корешков микрорастений томата на 10,9-35,1 %, грибная - на 11,3-20,5 %.

Также отмечалось, что во всех вариантах исследования большими ростостимулирующими свойствами биологический препарат «Фитоспорин-М» обладает в отношении бактерий Pseudomonas syringae, Xanthomonas vesicatoria. Очевидно, это связано с тем, что латентный период грибной инфекции существенно продолжительнее бактериальной.

Согласно полученным результатам, метаболиты Trichoderma spp. также проявляли ростостимулирующий эффект в отношении микрорастений огурца и томата, причем в меньшей степени - на проростках, а в большей - на корешках. В отношении бактериальной инфекции они менее эффективны, что нельзя сказать про метаболиты T. lixii, которые стимулировали рост микрорастений огурца, семена которых были заражены бактериальной инфекцией: проростков - на 2%, корешков на - 14,4% по сравнению с микрорастениями, семена которых обработаны биологическим препаратов «Фитоспорин-М». В отношении грибной инфекции: проростков - на 10,8%, корешков - на 31,9%.

Рис. 1. Влияние микробных метаболитов Trichoderma spp. на морфометрические показатели 10-суточных микрорастений огурца сорта «Герман F1»:

длина проростков (а) и длина корешков (б): контроль-Ф - семена обработаны «Фитоспорином-М»; контроль-0 - семена обработаны фитопатогенными микроорганизмами; T. harz., T. lign., T. vir., T. lix. - семена обработаны метаболитами данных штаммов микромицетов рода Trichoderma spp.

Рис. 2. Влияние микробных метаболитов Trichoderma spp. на морфометрические показатели 10-суточных микрорастений томата сорта «Санька»:

длину проростков (а) и длину корешков (б): контроль-Ф - семена обработаны «Фитоспорином-М»; контроль-0 - семена обработаны фитопатогенными микроорганизмами; T. harz., T. lign., T. vir., T. lix. - семена обработаны метаболитами данных штаммов микромицетов рода Trichoderma spp.

Томаты менее отзывчивы на метаболиты мицелиальных грибов. Но, тем не менее, биологически активные соединения T. lixii стимулируют рост проростков томатов, зараженных бактериальной инфекцией, на 7,5%, корешков - на 3,1%, по сравнению с контролем. При заражении семян грибной инфекцией рост проростков выше на 14,6%, корешков - на 10,5%.

Грибы рода Trichoderma spp. успешно колонизируют ризосферу сельскохозяйственных культур, секретируют различные низкомолекулярные метаболиты, в связи с этим на микрорастениях огурца их ростостимулирующее действие выражено. Растения огурца наиболее часто в рассадный период в условиях закрытого грунта поражаются особо опасными заболеваниями. Действие метаболитов на ранних стадиях развития микрорастений снижает фитопатогенную нагрузку. Перспективным штаммом для биоконтроля фитопатогенной инфекции своими продуктами метаболизма может являться T. Lixii. Положительными ростостимулирующими эффектами обладают также метаболиты T. lignorum, T. viride, как на микрорастениях огурца, так и томата.

Во всем мире признано, что грибы рода Trichoderma spp., в частности, T. harzianum, являются наиболее перспективными агентами в биоконтроле над фитопатогенной инфекцией за счет не только разнообразных выделяемых ими метаболитов комплексного действия, но и за счет быстрого размножения клеток. В нашем случае в качестве активного компонента Trichoderma spp. мы брали не живые клетки продуцента, а экзометаболиты, выделенные из глубинной культуры грибов. Ростостимулирующие свойства метаболитов T. harzianum ниже, чем в контролях. Также нас интересовали антимикробные свойства представленных метаболитов в отношении распространенных на овощных культурах закрытого грунта фитопатогенных микроорганизмов. Диско-диффузионным методом на чистых культурах фитопатогенов были получены данные антимикробной активности, представленные в таблице 1. Контролем в микробиологическом исследовании служил диск, нагруженный рабочим раствором биологического препарата «Фитоспорин-М», в составе которого содержится споровая культура Bacillus subtilis, продуктами своей жизнедеятельности (вырабатывает фунгицидные олигопептиды) подавляющая размножение возбудителей грибных и бактериальных болезней растений.

Таблица 1. Антимикробная активность микробных компонентов Trichoderma spp. в отношении распространенных на овощных культурах закрытого грунта фитопатогенных микроорганизмов (диско-диффузионный метод)

В результате исследования показано, что «Фитоспорин-М» на всех представленных тест-объектах бактериальной природы практически не проявляет бактериального эффекта. В отношении грибных патогенов микробиологической активности совсем нет. Метаболиты T. harzianum малоэффективны в отношении грибной инфекции. Литературные сведения подтверждают факт, что споровая биомасса как Bacillus subtilis, так и Trihoderma harzianum, за счет своего быстрого роста подавляет фитопатогены, не ингибируя их, а лишь приостанавливая развитие.

Метаболиты T. lignorum, T. viride, T. lixii проявляют бактерицидные и фунгицидные свойства в отношении распространенных на овощных культурах закрытого грунта фитопатогенных микроорганизмов. T. lixii является перспективным продуцентом метаболитов - биологически активных соединений, которые проявляют высокую бактериальную (24,9-25,4 мм) и фунгицидную (25,8-26,5 мм) активность.

Заключение

Полученные результаты исследования показали, что метаболиты T. lixii могут быть использованы в составе средств защиты овощных культур закрытого грунта как микробный компонент, сочетающий иммуномодулирующие свойства, бактерицидное и фунгицидное действие. Биологическое обоснование их действий в отношении распространенных контаминантов овощных культур позволяет рекомендовать данные биологически активные соединения в качестве компонента питательной среды для оздоровления пробирочных микрорастений овощных культур с целью не только оздоровления, но и укоренения этих растений при дальнейших пересадках. антагонист микробный грибной инфекция

В экспериментах использованы материалы и оборудование ЦКП «Орловский региональный центр сельскохозяйственной биотехнологии» ФГБОУ ВО Орловский ГАУ.

Список использованных источников

1. Гнеушева И.А., Солохина И.Ю., Павловская Н.Е., Лушников А.В., Белая С.В. Антагонистический потенциал штаммов Trichoderma spp. в отношении возбудителей грибных и бактериальных заболеваний растений // В сборнике: Продовольственная безопасность: от зависимости к самостоятельности. Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - 2017. - С. 54-56.

2. Полякова М.В., Павловская Н.Е., Гнеушева И.А. Разработка комплексных препаратов на основе БАВ микробного происхождения для овощеводства // В сборнике: Продовольственная безопасность: от зависимости к самостоятельности Материалы Всероссийской научно- практической конференции. - 2017. - С. 187-188.

3. Harman G.E. Overview of mechanisms and uses of Trichoderma spp. // Phytopathology. - 2006. - No. 96 (2). - Pp. 190-194.

4. Reino J.L., Guerrero R.F., Hernбndez-Galбn R., etc. Secondary metabolites from species of the biocontrol agent Trichoderma // Phytochem Rev. - 2008. - No. 7. - Pp. 89-123.

5. Vinale F., Sivasithamparam K., Ghisalberti E.L., etc. Trichoderma secondary metabolites that affect plant metabolism // Nat. Prod. Commun. - 2012. - No. 7. - Pp. 1545-1550.

6. Павловская Н.Е., Гнеушева И.А., Дедков В.Н., Ботуз Н.И., Лушников А.В., Маркина О.А. Метаболиты грибов рода Trichoderma - перспективные компоненты микробиологических препаратов для агротехнологий // Вестник Орел ГАУ. - 2016, №2 (59). - С. 60-64.

7. Павловская Н.Е., Гнеушева И.А., Полякова М.А. Определение фитотоксичности различных штаммов грибов рода Trichoderma // В сборнике: Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Межрегиональный сборник научных работ. - Воронеж. - 2016. - С. 121-125.

8. Ахатов А.К., Ганнибал Ф.Б., Мешков Ф.Б. Болезни и вредители овощных культур и картофеля // Товарищество научных изданий КМК. - 2013. - С. 392-393.

9. Круг Г. Овощеводство. Пер. с нем. В.И. Леунова. - М.: КолосС. - 2000. - 576 с.

10. Гнеушева И.А., Павловская Н.Е., Солохина И.Ю., Лушников А.В. Биологическое обоснование применения микробных компонентов Trichoderma spp. in vitro для оздоровления овощных культур закрытого грунта от фитопатогенной инфекции // АгроЭкоИнфо. - 2019

Аннотация

Проводили скрининг перспективных штаммов-антагонистов из рода Trichoderma spp. с целью обоснования применения их микробных компонентов в условиях in vitro для оздоровления овощных культур закрытого грунта от бактериальной и грибной инфекции. В исследовании использовали метаболиты потенциальных антагонистов фитопатогенных микроорганизмов Trichoderma harzianum, Trichoderma lignorum, Trichoderma viride, Trichoderma lixii; чистые культуры фитопатогенных микроорганизмов Xanthomonas vesicatoria, Phoma destructivа, Pseudomonas syringae, Ascochyta cucumis. Объектами исследования являлись семена и микрорастения томата сорта «Санька», огурца сорта «Герман F1». В среду выращивания микрорастений огурца и томата (Мурасиге-Скуга) вносили метаболиты штаммов-антагонистов и фитопатогены, определяли ростостимулирующее действие микробных компонентов на 10-е сутки вегетации. Определение антимикробной активности проводили стандартным диско-диффузионным методом на чистых культурах фитопатогенов. Полученные данные показали, что метаболиты T. lignorum, T. viride, T. lixii проявляют бактерицидные и фунгицидные свойства в отношении распространенных на овощных культурах закрытого грунта фитопатогенных микроорганизмов, при этом стимулируют рост и развитие проростков и корешков микрорастений. Метаболиты T. lixii могут быть использованы в составе средств защиты овощных культур закрытого грунта как микробный компонент, сочетающий иммуномодулирующие свойства, бактерицидное и фунгицидное действие.

Ключевые слова: ОГУРЕЦ, ТОМАТ, ФИТОПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, TRICHODERMA SPP., ДЛИНА КОРЕШКА, ДЛИНА ПРОРОСТКА, АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ

Размещено на Allbest.ru