Прикріплення та реакції хемотаксису фітопатогена Rhizobium radiobacter у присутності Lactobacillus plantarum, виділених з рослинних поверхонь

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Одеський національний університет імені І. І. Мечникова, кафедра мікробіології, вірусології та біотехнології

Прикріплення та реакції хемотаксису фітопатогена Rhizobium radiobacter у присутності Lactobacillus plantarum, виділених з рослинних поверхонь

Д.В. Сокол, студент

Д.Б. Мельникович, студентка

Ю.В. Кононюк, студентка

Н.В. Ліманська, к.б.н., доцент

М.Б. Галкін, к.б.н., ст. наук. співробітник

Запропоновано прості методики визначення здатності бактерій-антагоністів Lactobacillus plantarum пригнічувати збудника бактеріального раку Rhizobium radiobacter на рівні хемотаксису до рослинних тканин та прикріплення. У відповідь на присутність екстракту певної тест-рослини клітини R. radiobacter утворювали дифузійну або грибоподібну біоплівку. Уперше виявлено, що R. radiobacter і L. plantarum можуть утворювати змішані біоплівки.

Ключові слова: бактеріальний рак; хемотаксис; адгезія; антагонізм; молочнокислі бактерії.

ПРИКРЕПЛЕНИЕ И РЕАКЦИИ ХЕМОТАКСИСА ФИТОПАТОГЕНА RHIZOBIUM RADIOBACTER В ПРИСУТСТВИЕ LACTOBACILLUS PLANTARUM, ВЫДЕЛЕННЫХ С РАСТИТЕЛЬНЫХ ПОВЕРХНОСТЕЙ

Резюме

Бактерии вида Lactobacillus plantarum благодаря выраженным антагонистическим свойствам являются перспективными микроорганизмами для защиты растений от фитопатогенов. Целью работы была разработка методик определения способности бактерий-антагонистов L. plantarum угнетать возбудителя бактериального рака Rhizobium radiobacter на уровне хемотаксиса к растительным тканям и прикрепления. Материалы и методы. Для выявления реакций хемотаксиса использовали экстракты растений моркови, томатов и каланхоэ. В качестве барьеров между атрактантом и клетками R. radiobacter использовали пять культур L. plantarum. Для исследования конкурентной адгезии на стекле була предложена методика совместного культивирования фитопатогена и антагониста. Результаты исследований. Показано, что влияние экстрактов тест-растений на проявление реакций хемотаксиса фитопатогенов R. radiobacter отличался в зависимости от вида тест-растения. В присутствие тканевых жидкостей моркови бактерии образовывали диффузные биопленки, томатов - формировали микроколонии и диффузную биопленку, каланхоэ - исключительно грибоподобную биопленку. Присутствие большинства исследуемых штаммов-антагонистов L. plantarum изменяло реакцию хемотаксиса клеток R. radiobacter по отношению к экстракту моркови в сторону образования грибоподобной биопленки вместо диффузной. Используя предложенную нами методику совместного культивирования, было впервые показано образование смешанных биопленок R. radiobacter и L. plantarum. Вывод. Предложено простые методики изучения влияния бактерий-антагонистов на первом этапе патогенеза заболевания растений - на этапе хемотаксиса, и на другом этапе - этапе прикрепления.

Ключевые слова: бактериальный рак; хемотаксис; конкурентная адгезия; антагонизм; молочнокислые бактерии.

ATTACHMENT AND CHEMOTAXIS REACTIONS OF PHYTOPATHOGEN RHIZOBIUMRADIOBACTER IN PRESENCE OF LACTOBACILLUS PLANTARUM ISOLATED FROM PLANT SURFACES

Abstract

Lactobacillus plantarum with strong antagonistic activities are the perspective microorganisms for protection of plants against phytopathogens. The aim of the investigation was to develop the methods to study the capability of L. plantarum to inhibit crown gall agent Rhizobium radiobacter at the levels of chemotaxis to plant tissues and attachment. Materials and methods. Extracts of carrots, tomatoes and kalanchoe plants were used to observe the chemotaxis reactions. Five cultures of L. plantarum were applied as barriers between the attractant and R. radiobacter cells. A method of simultaneous cultivation of the phytopathogen and antagonist to study the competition adhesion to glass surface was proposed. Results. Effect of plant extracts on R. radiobacter chemotaxis reactions varied depending on the species of the test plant. In presence of carrot tissue liquids bacteria formed flat biofilms, tomatoes - formed microcolonies and flat biofilms, kalanchoe - strictly mushroomlike biofilms. Presence of the majority of L. plantarum antagonistic strains altered the chemotaxis reaction of R. radiobacter cells as to carrot extract towards formation of mushroom-like biofilms instead of flat ones. With application of our proposed method of simultaneous cultivation, we showed the formation of mixed biofilms of R. radiobacter and L. plantarum for the first time.

Conclusion. Simple methods to study the effect of antagonistic bacteria on chemotaxis as the first stage of plant disease pathogenesis and on attachment as the second stage were proposed.

Key words: crown gall; chemotaxis; competition adhesion; antagonism; lactic acid bacteria.

Вступ

Збудник бактеріального раку Rhizobium radiobacter реагує на хімічні сигнали від пошкоджених поверхонь рослин [5]. Рослинні ексудати одночасно несуть поживні речовини і атрактанти для запуску циклу життєдіяльності даного збудника, який призводить до патогенезу бактеріального раку [3]. Для захисту рослин від даного патогена надзвичайно важливим є застосування штамів-антагоністів для біологічного контролю. У літературі описано антагоністи збудника бактеріального рака з декількох родин - Bacillus, Rhizobium, Pseudomonas, Rahnella [8]. Уперше було запропоновано використовувати як антагоністів молочнокислі бактерії Lactobacillus plantarum [9], перевагою яких є їх абсолютна безпечність для людини і тварин, затверджена статусом GRAS - «generally recognized as safe» (англ.) - «абсолютно безпечні». Лактобацили даного виду також населяють поверхні рослин, і саме вони постають основною причиною молочнокислого бродіння ферментованого рослинного матеріалу [9].

Для відбору найефективніших штамів-антагоністів серед лактобацил необхідними є швидкі та прості методики, які б дозволяли за короткий термін виявити штами, які пригнічують початкові стадії патогенезу бактеріального раку. Першою такою стадією є хемотаксис, а другою - адгезія, коли клітини фітопа- тогена пересуваються у напрямку до ексудатів рослини і починають прикріплення на рослинній поверхні і формування біоплівки [3, 5].

Метою роботи була розробка методик визначення здатності бактерій-антагоністів Lactobacillus plantarum пригнічувати збудника бактеріального раку Rhizobium radiobacter на рівні хемотаксису до рослинних тканин та прикріплення.

Матеріали і методи дослідження

У дослідженні використовували два штами фітопатогена - Rhizobium radiobacter С58, люб'язно наданий доктором Ф. І. Товкачем (Інститут мікробіології та вірусології імені Д.К. Заболотного, м. Київ), та R. radiobacter pJZ, люб'язно наданий доктором І. Р. Головльовим (Університет м. Умео, Швеція), і п'ять штамів лактобацил-антагоністів (лактобацил з раніше встановленими антагоністичними властивостями [1]) - Lactobacillus plantarum ОНУ 12, ОНУ 311, ОНУ 333, ОНУ 355 та ОНУ 475.

Для постановки експерименту ризобії культивували у рідкому середовищі LB [2], а лактобацили - у рідкому середовищі MRS [4] протягом доби. Також добові культури лактобацил підтримувалися на щільному середовищі MRS.

Для дослідження реакції хемотаксису було модифіковано методику Hawes et al., 1988 [6]. Модифікація полягала у використанні 0,5% голодного агару, оскільки метою дослідження було не вивчення руху ризобій, а їх реакцій хемотаксису. Також як атрактанти, замість кінчиків коренів паростків гороху, застосовували три рослинних екстракти - каланхое Kalanchoe daigremontiana Mill, томатів Lycopersicon esculentum L., моркви Daucus carota L. Екстракти отримували шляхом фільтрації свіже зцідженого рослинного соку (каланхое і томати - листя, морква - коренеплоди) через паперовий фільтр та фільтри 0,22 мкм «Millipore», а потім зберігали при - 20°С.

Посередині чашки Петрі в голодний агар до самого дна чашки вводили рослинний екстракт в об'ємі 2 мкл. На відстані 1 см або 0,5 см від точки введення екстракту було введено 2 мкл трьох-годинної культури фітопатогена. У дослідах з вивчення антагоністичної активності лактобацил між точкою введення рослинного екстракту і точкою внесення ризобій проводили бар'єр зі щільної добової культури лактобацил, розташовуючи його так, щоб він знаходився на середині відстані від екстракту та фітопатогену. Чашки інкубували при 28 °С протягом доби, потім знімали з чашки агар, фіксували бактерії 96° етиловим спиртом 15 хв, а далі забарвлювали кристалічним фіолетовим 1 % (водний розчин) протягом 10 хв. Висушували упродовж доби та мікроскопіювали у світловому мікроскопі за збільшення 600х. Реакції хемотаксису оцінювали за фенотиповими змінами культур - утворюванням мікроколоній, біоплівки або моношару клітин. Усі дослідження проводили у 8 повторностях.

Для дослідження конкурентної адгезії було запропоновано просту методику, яка може застосовуватись у випадку зіставлення властивостей грампозитив- них і грамнегативних бактерій. У флакон, простерилізований разом із покривним скельцем, вносили по 500 мкл культури лактобацил або фітопатогена і 1,5 мл відповідного живильного середовища - MRS або LB. Такі варіанти були контрольними. У дослідні флакони вносили по 500 мкл культур лактобацил і фітопатогена і 1 мл живильного середовища. З метою підбору найкращих умов для прикріплення обох видів бактерій порівнювали культивування суміші мікроорганізмів у MRS та LB і різні температури інкубації - 28 °С та 37 °С. Після витримування добу у термостаті покривні скельця виймали, фіксували 96° етиловим спиртом протягом 15 хв і прикріплені бактерії фарбували за Грамом. Мікроскопіювали у світловому мікроскопі за збільшення 600х. Конкурентне прикріплення оцінювали у відсотках бактерій - грампозитивних лактобацил і грамнегативних ризобій у п'яти полях зору у двох незалежних експериментах.

хемотаксис фітопатоген rhizobium radiobacter

Результати досліджень та їх обговорення

Рослинні екстракти спричиняли різний прояв реакцій хемотаксису фітопатогенів Rhizobium radiobacter С58 та R. radiobacter pJZ залежно від виду тест-рослини. У відповідь на присутність екстракту каланхое клітини ризобій утворювали мікроколонії. Формування мікроколоній і грибоподібної біоплівки, може бути захисною реакцією бактерій на стресові фактори навколишнього середовища [7]. Екстракти каланхое відомі за своїми бактерицидними властивостями [10]. Можливо, що утворення мікроколоній бактеріями штамів R. radiobacter С58 та R. radiobacter pJZ є наслідком несприятливого впливу екстракту каланхое.

За присутності екстракту листів томату спостерігалося утворення мікроколоній, а також були й клітини, рівномірно розподілені по склу у вигляді дифузної біоплівки, що може свідчити про менший несприятливий вплив тестованих рослинних речовин, оскільки саме грибоподібна біоплівка з її товстішим матриксом і складною архітектурою зазвичай формується у більш несприятливих умовах, ніж дифузна, - в умовах, коли бактерії стають менш рухливими [11]. Ймовірно, екстракти каланхое та томату впливали на рухливість клітин, пригнічуючи її, внаслідок чого клітини не поширювалися по субстрату у вигляді дифузної біоплівки, а формували саме грибоподібну біоплівку.

У дослідах, де атрактантами виступали екстракти моркви, клітини ризобій розташовувалися рівномірно по поверхні скла, утворюючи дифузну біоплівку, і були направлені у напрямку точки введення екстракту. Отже, можна зробити висновок, що речовини тканинного соку моркви не мали негативного впливу на клітини R. radiobacter С58 та R. radiobacter pJZ.

Дійсно, усі три тест-рослини є класичними моделями для вивчення патогенезу бактеріального раку дводольних рослин, але якщо порівнювати час, який потрібен для проявів симптомів захворювання, то найшвидше пухлини утворюються на моркві (12-14 днів), далі - на томатах (20-21 день) і найдовше проявів очікують на каланхое (30-40 днів) (власні спостереження). Можна припустити, що час, потрібний для прояву захворювання, пов'язаний саме з пригнічувальним впливом тканинних рідин певної рослини.

Проаналізувавши реакції фітопатогенів на рослинні екстракти, для подальших експериментів з вивчення антагоністичних властивостей лактобацил у якості атрактанту було обрано екстракт моркви, оскільки його вплив спричиняв утворення не грибоподібної біоплівки, а саме дифузійної.

Використання п'яти штамів як бар'єрів між атрактантом і культурою патогенних ризобій показало, що бактерії обох штамів - Я. гаЯіоЬаеїєг С58 та Я. гаЯіоЬаеґєг рІ2 - реагували на присутність лактобацил однаково.

Бактерії штаму L. рїаШагит ОНУ 333 не проявили ніякого впливу на реакцію хемотаксису ризобій - клітини фітопатогену утворювали дифузну біоплів- ку так само, як і у контролі - тобто за відсутності лактобацил (рис. 2).

Рис. 1. Реакція бактерій штама R. radiobacter С58 на рослинні екстракти: А - каланхое; Б - томату; В - моркви (мікрофотографії, 600х)

Найбільший вплив проявили штами L. рїаШагит ОНУ 311 та L. ОНУ 475. За присутності лактобацил штаму ОНУ 311 спостерігалося утворення добре сформованих мікроколоній і початок формування грибоподібної біоплівки (рис. 2). Бар'єр з клітин штаму L. рїаШагит ОНУ 475 спричиняв утворення добре сформованих мікроколоній Я. гаЯіоЬаеїєг (рис. 2).

Вплив штамів L. рїаШагит ОНУ 12 та ОНУ 355 був більш помірним - мікроколонії утворювалися поряд з формуванням дифузної біоплівки (рис. 2).

Рис. 2. Реакція бактерій штаму Я. га<іюЬасїег рР2 на екстракт моркви у присутності бар'єрів зі штамів-антагоністівЬ. ріапїагит

Отже, дослідження впливу штамів L. рїаагит показало, що присутність лактобацил змінювала реакцію хемотаксису клітин Я. гаЯіоЬаеґєг. Реакції хемотаксису є першою реакцією патогенних ризобій на присутність тканинних рідин ранових поверхонь рослин [3, 5]. Раніше було виявлено, що лактобацили є активними антагоністами Я. гаЯіоЬаеґєг, і вони здатні пригнічувати патоген, як у дослідах на живильних середовищах, так і на рослинах [1]. Отримані результати показують, що перші прояви впливу чотирьох з п'яти штамів-антагоністів проявилися вже на етапі хемотаксису.

У результаті апробаційних досліджень запропоновано просту методику визначення впливу бактерій-антагоністів на першому етапі патогенезу захворювання рослин - на етапі хемотаксису. Методика потребує наявності світлового мікроскопа, 0,5 % «голодного агару», чашок Петрі, добових культур дослідних бактерій, стерильного екстракту рослинних тканин.

Далі вивчали конкурентні відносини фітопатогена і антагоніста на етапі прикріплення. Для цього було запропоновано простий метод, заснований на контрастному забарвлюванні грампозитивних і грамнегативних бактерій. Одночасне культивування R. radiobacter і L. plantarum для отримання скелець обростання дозволило швидко, за одну добу, оцінити потенціал штаму-антагоніс- та щодо пригнічення адгезії фітопатогена.

Для розробки простого методу оцінки конкурентної взаємодії лактобацил і R. radiobacter на етапі прикріплення підбирали оптимальні умови інкубування, які підходили б для кожного з тестованих видів бактерій. Лактобацили і ризобії вирощували за різних температур 28 °С і 37 °С і у живильних середовищах різного складу - MRS і LB. Вимірювання щільності клітинних суспензій після доби культивування показало, що R. radiobacter добре росли у середовищі MRS при 28 °С, і концентрація клітин досягала (4-6)x10⁷ кл/мл. Але за температури 37 °С у обох середовищах - і MRS, і оптимальному LB, ризобії майже не росли. Що стосується лакгобацил, то вони найкраще росли за 37 °С у оптимальному для них середовищі MRS, і концентрація їх клітин сягала до (6-7 x10⁹ кл/мл, але за температури 28 °С ріст у MRS також був достатньо рясним - до (6-8)x10⁷ кл/мл. У середовищі LB лактобацили майже не росли при 28 °С - до (2-4)x10¹ кл/мл, а за температури 37 °С спостерігався слабкий ріст - до (4-5) x10² кл/ мл.

Аналізуючи дані з культивування бактерій різних видів, у якості оптимальних умов, які б дозволяли бактеріям і R. radiobacter, і L. plantarum накопичу - вати біомасу, було обрано живильне середовище MRS і 28 °С, ріст в якому за даної температури дозволяв отримати за добу 10⁷ кл/мл обох видів бактерій. Дійсно, мікроскопія скелець обростання показала, що за даних умов клітини R. radiobacter і L. plantarum за добу інкубування успішно прикріплювалися до скла і починали формувати біоплівку (рис. 3).

Рис. 3. Прикріплення бактерій до скла у контролях за умови інкубування у середовищі MRS і температури 28 °С

Інкубування суміші фітопатогена і антагоніста у MRS при 28 °С за одночасного внесення культур показало, що за добу утворювалася змішана біоплівка, в якій присутність грамнегативних ризобій та грампозитивних лактобацил можна було відмітити візуально за відмінністю забарвлення (рис. 4).

Рис. 4. Прикріплення бактерій до скла у сумішах за умови інкубування у середовищі MRS і температури 28 °С

Таблиця 1

Співвідношення клітин R. radiobacter і L. plantarum у змішаних біоплівках за добове культивування у середовищі MRS при 28 °С

Найкращі результати з вбудовування у біоплівку з витісненням клітин ризобій було отримано зі штамами L. рїапіагиш ОНУ 12 і L. рїапіагиш ОНУ 355 щодо Я. гаЯюЬасієг С58. Дійсно, дані штами лактобацил у попередніх наших дослі-дженнях проявили високу антагоністичну активність проти R. radiobacter С58 як in vitro, так й in vivo на тест-рослинах [1]. Проти фітопатогена R. radiobacter pJZ найактивнішими конкурентами у прикріпленні до скла були штами ОНУ 12, ОНУ 311 та ОНУ 355.

Загалом, результати вивчення конкурентної адгезії на склі вказують на те, що лактобацили здатні утворювати з фітопатогеном R. radiobacter змішані біоплівки. Зважаючи на те, що L. plantarum успішно пригнічують патогенез збудника бактеріального раку на тест-рослинах [1, 10], можна припустити, що активне інгібування фітопатогена відбувається й далі, після утворення біоплівки, коли бактерії різних видів ростуть поруч, і лактобацили починають значно підкислювати навколишнє середовище, роблячи його несприятливим для росту фітопатогена.

Здатність двох представників мікробіоти рослин - R. radiobacter і plantarum, утворювати змішані біоплівки показана уперше.

У подальшому необхідною є розробка простої методики виявлення впливу антагоністів на прикріплення фітопатогенів на моделі тест-рослин.

Висновки

1. Вплив екстрактів тест-рослин на прояв реакцій хемотаксису фітопатогенів Rhizobium radiobacter відрізнявся залежно від виду тест-рослини. У присутності тканинних рідин моркви бактерії утворювали дифузійні біоплівки, томатів - формували мікроколонії і дифузійну біоплівку, каланхое - виключно грибоподібну біоплівку.

2. Присутність більшості досліджених штамів-антагоністів L. plantarum змінювала реакцію хемотаксису клітин R. Radiobacter щодо екстракту моркви у бік утворення грибоподібної біоплівки замість дифузійної.

3. Запропоновано прості методики визначення впливу бактерій-антагоністів на першому етапі патогенезу захворювання рослин - на етапі хемотаксису, та на другому етапі - етапі прикріплення.

4. Уперше показано утворення змішаних біоплівок R. radiobacter і L. plantarum.

Список використаної літератури

1. Мерліч А. Г Антагоністична активність бактерій Lactobacillus plantarum, виділених з рослинних джерел України та Франції, проти фітопатогенних бактерій / А. Г Мерліч, Н. В. Ліманська // Мікробіологія і біотехнологія. - 2016. - № 4. - С. 71-85.

2. Bertani G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli /G. Bertani // Journal of Bacteriology. - 1951. - Vol. 62. - P. 293-300.

3. Burr T. J. Crown gall of grape / T. J. Burr, L. Otten // Annu Rev Phytopathol. - 1999. - Vol. 37. - P. 53-80.

4. de Man J. C. A medium for the cultivation of lactobacilli / J. C. de Man, M. Rogosa, M. E. Sharpe // Journal of Applied Bacteriology. - 1960. - № 23. - P. 130-135.

5. Escobar M. A. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease / M. A. Escobar, A. M. Dandekar // Trends Plant Sci. - 2003. - Vol. 8. - P. 380-386.

6. Hawes M. C. Agrobacterium tumefaciens mutants deficient in chemotaxis to root exudates / M. C. Hawes, L. Y. Smith, A. J. Howarth // Molecular and plant-microbe interactions. - 1988. - Vol. 1, № 4. - P. 182-186.

7. Lapaglia C. Stress-induced production of biofilm in the hyperthermophileArchaeoglobusfulgidus / C. Lapaglia, P L. Hartzell // Appl Environm Microbiol. - 1997. - Vol. 63, № 8. - P 3158-3163.

8. Limanska N. Prevention of grape crown gall / N. Limanska // Microbiology and Biotechnology. - 2012. - № 1(17). - P 6-22.

9. Limanska N. V Effect of Lactobacillus plantarum on tumor formation caused by Rhizobium radiobacter / N. V Limanska, N. V. Korotaeva, G. V. Yamborko, V. O. Ivanytsia //

10. Pattewar S. V. Antimocrobial potential of extract from leaves of Kalanchoepinnata / S. V. Pattewar, D. N. Patil,

S. B. Dahikar // Int J. Pharmaceutical Science and Research. - 2013. - № 13. - P 4577-4580.

11. Picioreanu C. Microbial motility involvement in biofilm structure formation - a 3D modelling study / C. Picioreanu, J.-U. Kreft, M. Klausen, J. A. J. Haagensen, T. Tolker-Nielsen // Water science and technology. - 2007. - Vol. 55, № 8. - P 337-343.

References

1. Merlich A.G., Limanska N.V. (2016) «Antagonistic activity of Lactobacillus plantarum isolated from plant sources of Ukraine and France against phytopathogenic bacteria», Microbiology and Biotechnology, No 4, pp 71-85.

2. Bertani G. (1951) «Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli», Journal of Bacteriology, Vol 62, pp 293-300.

3. Burr TJ., Otten L. (1999) «Crown gall of grape», Annual Reviewes of Phytopathology, Vol 37, pp 53-80.

4. de Man J. C., Rogosa M., Sharpe M. E. (1960) « A medium for the cultivation of lactobacilli «, Journal of Applied Bacteriology, No 23, pp 130-135.

5. Escobar M.A., Dandekar A.M. (2003) «Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease», Trends in Plant Science, Vol 8, pp 380-386.

6. Hawes M.C., Smith L.Y., Howarth A.J. (1988) «Agrobacterium tumefaciens mutants deficient in chemotaxis to root exudates», Molecular and Plant-Microbe Interactions, Vol 1, pp 182-186.

7. Lapaglia C., Hartzell P.L. (1997) «Stress-induced production of biofilm in the hyperthermophile Archaeoglobus fulgidus», Applied and Environmental Microbiology, Vol 63, pp 3158-3163.

8. Limanska N. (2012) «Prevention of grape crown gall», Microbiology and Biotechnology, No 1, pp 6-22.

9. Limanska N.V., Korotaeva N.V, Yamborko G.V., Ivanytsia V.O. (2014) «Effect of Lactobacillus plantarum on tumor formation caused by Rhizobium radiobacter», Microbiology and Biotechnology, No 1, pp 8-18.

10. Lindow S.E., Brandl M.T. (2003) «Microbiology of the phyllosphere», Applied and Environmental Microbiology, Vol 69, pp 1875-1883.

11. Picioreanu C., Kreft J.-U., Klausen M., Haagensen J.A.J., Tolker-Nielsen T. (2007) «Microbial motility involvement in biofilm structure formation - a 3D modelling study», Water science and technology, Vol 55, pp 337-343.

Размещено на Allbest.ru