Токсичность кислорода: образование активных форм кислорода в митохондриях

Размещено на http: //www. allbest. ru/

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования

«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Институт фундаментальной биологии и биотехнологии

Кафедра медицинской биологии

Институт фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского федерального университета

Реферат:

Токсичность кислорода: образование активных форм кислорода в митохондриях

тема № 21

Преподаватель: Н.М. Титова

Студент: ББ17-32Б А. В. Юдин

Красноярск 2020

Вступление

Митохондрии -- это органеллы, которые содержатся во всех клетках высших организмов. Они являются основным производителем основного соединения, поддерживающего энергетический баланс клетки и всего организма - АТФ. Процесс синтеза АТФ, это многоступенчатый процесс, в котором участвует множество ферментов. Результатом их деятельности будет создание протонного потенциала. Это достигается путём переноса протонов водорода из матрикса митохондрий в межмембранное пространство. Далее, через специальные протонные каналы с АТФ-синтазной активностью. Вместе с тем, каждый из участников данной цепи способен прореагировать с молекулярным кислородом, который находятся в митохондриях и играет роль конечного акцептора водорода. При взаимодействии переносчика и кислорода образуется не вода, как это должно быть в норме, а продукт одноэлектронного восстановления кислорода - супероксид-анион радикал. Это первичная активная норма кислорода. В сравнении с другими АФК эта молекула относительно безопасна, однако и она способна окислять многие вещества, включая белки, что приводит к нарушению их конформации и влечёт их функциональную несостоятельность. Однако наиболее опасно то, что при определённых обстоятельствах, например, при взаимодействии с ионами металлов с непостоянной валентностью, эта молекула способна превращаться в другие, куда более реакционноспособные и токсичные АФК, например, в гидроксильный радикал. Рассмотри подробнее, что такое электрон-транспортная цепь, на каких её этапах возможно образование АФК и что такое активные формы кислорода. Также будет рассмотрено их деструктивное влияние на митохондрии и клетку в целом.

1. Электрон-транспортная цепь

Электрон-транспортная цепь или дыхательная цепь митохондрий - это совокупность ферментов и низкомолекулярных соединений, участвующая в создании протонного электрохимического потенциала. Она локализована во внутренне1 мембране митохондрий и включает в себя 5 звеньев.

Первое звено в ЭТЦ, это NADH-дегидрогеназа (НАДН-Q-редуктаза, комплекс I). Это сложный белок, состоящий из нескольких полипептидных цепей. Кофактором для него служит ФлавинМоноНуклеотид (ФМН). ОН специфичен, единственным субстратом для него служит восстановленная форма НАД+- НАДН. При их взаимодействии осуществляется переход двух электронов и одного протона от НАДН к ФМН. Вместе с одним электроном происходит захват протона из окружающей среды, т.е. из матрикса. Результатом будет образование восстановленной формы ФМН - ФМНН2. В рамках того же фермента, электроны далее переносятся на ряд Fe/S белков, играющих роль второго кофактора данного фермента. Следующим звеном будет кофермент Q (Q10, убихинон). Принимая электроны от последнего Fe/S белка, он восстанавливается до гидрохинона. Это полиизопреноидное гидрофобное вещество. При этом, продукт неполного восстановления убихинона - семихинон, обладает радикальной активностью, пусть и несравнимой с АФК. Гидрохинон передаёт пару электронов на комплекс III (коэнзим Q-цитохром с-редуктаза). Это также довольно сложный белковый фермент. Он состоит из 3-х типов цитохромов - b1, b2и С1. Внутри комплекса электроны передаются от цитохромов b на Fe/S центры, далее на цитохром С1, затем на цитохром с - следующее подвижное звено в ЭТЦ. Группа гема способна переносить лишь по одному электрону, поэтому он может некоторое время находиться в семихиноновой форме. Последним ферментом данной цепи будет цитохромоксидаза. Она состоит из двух цитохромов типа аа3, каждый из которых может связываться с кислородом. Для этого у них есть железопорфириновая группа и ионы меди, локализованные СuA-центрах. В ЭТЦ переносчики протонов и электронов (коферменты НАД, ФМН (ФАД) и KoQ) чередуются с переносчиками только электронов (Fe/S и цитохромы). Это вызывает перемещение Н+ из матрикса в межмембранное пространство.

Комплекс 2 (сукцинатдегидрогеназа) похож по своей роли на комплекс один, однако он использует иной субстрат (сукцинат) и является, одновременно, ферментом цикла Кребса.

Итак, на каком из этапов возможно образование АФК? Исследования связывают образование супероксид-аниона с 1 и 3 комплексами. В первом случае полагаю, что АФК-генерирующий центр это флавин. Флавины (FMN и FAD) способны принимать и отдавать один электрон с образованием радикальных форм. Во многих ферментах это свойство флавинов используется при переносе электронов от субстратов-доноров на компоненты, способные принимать только один электрон - Fe/S центры, гемы цитохромов.

В случае комплекса III источником считают полувосстановленный семихинон, который обладает радикальной активностью.

Митохондрии обладают достаточно хорошей антиоксидантной защитой, в которую входят как ферментативные антиоксиданты (глутатионпероксидаза, СОД), так и низкомолекулярные соединения (аскорбиновая кислота, a-токоферол, рутин, церуллоплазмин и т.д.). Функция СОД состоит в том, чтобы превращать О2- в менее токсичную Н2О2. Н2О2 является субстратом для другого фермента, разлагающего её до Н2О и О2 - каталаза. Однако, если по каким-либо причинам, Н2О2 не удаляется вовремя, то СОД начинает проявлять прооксидантную активность, давая начало более активному и нежелательному гидроксильному радикалу.

Ферменты-генераторы АФК

· Дигидрооротатдегидрогеназа

Это флавин-содержащий фермент, катализирующий ОВР в синтезе пиримидинов de novo. Локализован во внутренней мембране митохондрий. ФМН-содержащий активный центр находится в гидрофильной части белка, направлен в межмембранное пространство, гидрофобный элемент играет роль якоря и связывается с убихиноном. Исследователи предполагали, что АФК-продуцирующий фрагмент находиться возле флавина.

· NADPH-оксидаза (NOX4)

Фермент, роль которого заключается в переносе электронов с NADP(H) на О2 для образования О2-. Хорошо изучена активность этого фермента у фагоцитов. Это сложный интегральный трансмембранный белок. Содержит 6 трансмембранных спиралей и 5 петель. В С-концевом участке есть NAD(P)H- и FAD-связывающие центры. ЭТЦ данного фермента можно упрощённо представить в таком виде: NAD(P)H > FAD > гем b > гем b > молекула О2. В митохондриях содержится одна из форм этого фермента. Для её активации нужен дополнительный мембранный белок р22.

Повышение активности NOX4 коррелирует с уровнем окисления сульфгидрильных групп некоторых митохондриальных белков (например, аконитазы, цитратсинтазы и некоторых субъединиц комплекса I), что может являться причиной функциональных нарушений в митохондриях, приводящих к гибели клеток.

· Комплекс I

Это довольно сложный фермент, состоящий из 44 различных субъединиц. Центр связывания NADH и первичный акцептор электронов FMN локализованы в наиболее удаленной от мембраны части фермента и экспонированы в водную фазу окружающего матрикса. Цепь переноса электронов в рамках этого фермента выглядит так:

NADH > FMN > N3 > N1b > N4 > N5 > > N6a > N6b > N2 > Q.

Центр N1a расположен в стороне от этого пути, но в непосредственной близости к флавину. В каталитическом цикле центр N1a может временно акцептировать электрон от FMN-радикала, возникающего при окислении восстановленного флавина одноэлектронным акцептором. Данный рисунок отображает L-образую форму комплекса I, а также показывает (звёздочками) возможные места образования АФК.

При нормальном дыхании митохондрии катализируют образование АФК со скоростью, равной ~0,25% от скорости поглощения кислорода комплексом IV. При этом основная часть АФК (85%) производится комплексом I, а остальные 15% приходятся на долю комплексов II, III и других ферментов. Мембран-связанный комплекс I способен продуцировать АФК в различных условиях: 1) в реакции энергозависимого обратного переноса электронов; 2) в нормальной NADH-оксидазной реакции, когда восстанавливаемый комплексом I убихинон окисляется дыхательной цепью; 3) при окислении NADH в присутствии ингибиторов дыхательной цепи (ротенон, пиерицидин, антимицин А и др.)

При повышении степени разобщённости ЭТЦ продукция АФК значительно возрастает. Считается, что комплекс I в основном катализирует образование О2- (более 90%) и в гораздо меньшей степени О2Н2. Также есть данные, подтверждающие зависимость соотношения генерации этих веществ от соотношения NAD+/NADH.

· Комплекс II

Комплекс II, сукцинатдегидрогеназа, локализован во внутренней мембране митохондрий. Фермент выполняет две роли: катализирует реакцию ЦТК и поставляет электроны ЭТЦ. Фермент состоят из 4 субъединиц, с гидрофильным и гидрофобным доменами. Домен, ответственный за генерацию АФК также расположен у сайта взаимодействия с убихиноном. Образование О2- происходит так: если флавину нужно отдать второй электрон на Fe/S-центр, он уже восстановлен, то этот электрон передается на О2 и образуется О2-. Также показано, что скелетные мышца способны к более активной генерации АФК, чем митохондрии других клеток, например, кардиомиоцитов. Комплекс II также образует АФК при восстановлении убихинона б-глицерофосфатом.

· Комплекс III

Катализирует окисление убихинона цитохромом с. Сопряжено с трансмембранным переносом двух Н+. Имеет вид гомодимера, у каждого мономера имеется сердцевина, образованная гидрофобным полипептидом, несущим два гема bL/bN. Реакция, осуществляемая данным комплексом, носит название протон-движущего Q-цикла.

Он состоит из двух полуреакций. На первой стадии реакции происходит окисление убихинола в центре Q0. Электроны могут пойти двумя путями: один электрон идёт в Fe/S-центр, а другой электрон переносится на bL. Окисление убихинола приводит к высвобождению двух протонов в межмембранное пространство. Электрон с Fe/S-центра переносится на цепь цитохромов, а электрон с bL переносится на bN. На второй стадии восстанавливается убисемихинон в геме bN и реакции повторяются. В конечном итоге происходит окисление одной молекулы убихинона двумя цитохромами с, трансмембранный перенос двух протонов из матрикса в межмембранное пространство и выделение двух протонов, так как убихинон - донор атомов водорода, а цитохром с акцептирует только электроны. Наличие двух гемовых групп bN/ bL, позволяет комплексу II генерировать АФК с двух сторон от мембраны. Как и во всех предыдущих случаях, образование АФК завязано на взаимодействии полувосстановленного убихинона с О2.

· Дигидролипоамиддегиддегидрогеназа (ДЛДГ)

ДЛДГ относится к группе флавин/тиол/дисульфид-зависимых оксидоредуктаз. Данный фермент представляет гомодимер с м.51кДа. В активный центр каждой субъединицы входят: центр связывания пиридиннуклеотидов, молекулы FAD и каталитически активная бисульфидная группа. ДЛДГ - FAD-содержащий элемент рядя дегидрогеназа, ответственных за конечные стадии окислительного декарбоксилирования б-кетоглутарата, пирувата, кетокислот с разветвленной цепью и глицина. В пользу участия ДЛДГ в образовании АФК свидетельствуют эксперименты с использованием гетерозиготных мышей с нокаутным геном ДЛДГ. Генерация АФК митохондриями таких мышей при окислении б-кетоглутарата оказалась сниженной почти в 2 раза. Генерация АФК изолированным препаратом б-КГДГК контролируется соотношением NAD+ /NADH, при снижении этого соотношения уменьшается скорость дегидрирования кетокислоты, и активируется генерация перекиси водорода. Генерация перекиси водорода митохондриальной ДЛДГ чувствительна к содержанию ионов аммония. При наличии таковых в миллимолярных концентрациях интенсивность процесса увеличивается в 5 раз и в этих условиях доля ДЛДГ в общей NADH-зависимой продукции АФК увеличивается до 90%. Однако данный эксперимент был проведён in vitro поэтому говорить о существовании подобного явления в живой клетке пока преждевременно, однако это позволяет нам объяснить токсичность аммиака для млекопитающих. Будучи источником АФК в митохондриях, ДЛДГ сама может быть мишенью для АФК, что приводит к необратимой инактивации одного из мономеров фермента и снижению скорости образования NADH в митохондриях.

Активные формы кислорода

Рассмотрим классификацию АФК. Наиболее удачной оказалась классификация, основывающаяся на очередности и причине возникновения АКМ. Согласно неё, все образующиеся в организме АКМ могут быть разделены на чужеродные и природные. Природные же в свою очередь так же делятся на первичные, вторичные и третичные. Такое деление оправдано с позиций влияния АКМ на организм, ведь природные, возникающие в результате работы ферментов первичные АКМ выполняют регуляторные, защитные и в редких случаях патологические функции. АКМ, вызванные действием извне, как правило приводят к развитию патологических процессов в организме.

Рассмотрим О2- и Н2О2, т.к. это основные АФК в митохондриях

· Супероксидный анион-радикал.

О2- возникает, когда к молекулярному кислороду в основном состоянии присоединяется электрон. Будучи заряженной частицей, радикал плохо мигрирует через мембраны клетки. Это не слишком реакционноспособное вещество, существующее в условиях клетки порядка 10-6с.Его окислительный потенциал слабый, в большинстве случаев выступает в роли восстановителя. При наличии свободных протонов и значении рН в районе 7,4 образуется гидроперекислый радикал НО2, представляющий из себя слабую кислоту. Будучи, в отличие от О2-незаряженной частицей, способен пересекать мембраны и выходить за пределы клетки. Рассмотрим положительное влияние О2-. Доподлинно известно, что супероксид-анион участвует в наработке хемотаксических пептидов, индуцирует синтез интерлейкин-1-подобного фактора, усиливает митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов, ингибирует эндотелиальный фактор расслабления сосудов, увеличивая адгезию к ним циркулирующих гранулоцитов. В низких концентрациях стимулирует пролиферацию фибробластов в культуре. В данный момент нет единого мнения о том, влияет ли как-то непосредственно супероксид-анион на чужеродные компоненты,однако его роль в имунном ответе неоспорима.

Базальная экспрессия фермента у человека довольно низка, однако под действием цитокинов, гормонов или гипоксии (в частности при ишемии) существенно увеличивается. кислород митохондрия фермент органелла

· Перекись водорода

Перекись водорода образуется при переносе двух электронов на молекулу кислорода или одного на супероксид-анион. Образовавшийся в результате двухзарядный анион О22- не может существовать в свободном состоянии и, присоединяя к себе протоны, переходит в Н2О2. Это окислитель средней силы, не имеющий заряда, что позволяет ему относительно свободно диффундировать через мембраны. Механизмы цитотоксического действия перекиси разнообразны. Это может быть поведение ДНК. В концентрации 0,1-2,5мМ вызывает однонитевые разрывы в ДНК, что может служить причиной гибели клеток или их мутации. Это может быть инактивация ферментов. Также перекись способна индуцировать процессы ПОЛ и как следствие, изменять проницаемость мембран клеток. При действии высоких концентраций перекиси водорода наблюдается деактивация ферментативной системы глутатионпероксидазы. Наконец, перекись водорода может спонтанно дисмутировать с образованием крайне токсичного и высоко реактивного гидроксильного радикала. Наработка перекиси водорода приводит к закислению среды в очаге воспаления, что индуцирует выход трёхвалентного железа из ферритина, усиливая цитотоксическийэ ффект перекиси, увеличивая образование гидроксильного радикала.

Итоги и выводы

Таким образом, ы можем сделать вывод, что образование АФК - постоянный процесс, который идёт живых клетках, по-видимому, с тех пор, как появился аэробный тип метаболизма. И с тех же пор организмы начали совершенствовать свои антиоксидантные защитные системы. Как мы видим, эволюционно сложилось так, что борьба с АФК в клетках пошла не по пути полного предотвращения их образования, т.к. нет свидетельств наличия белковых систем, экранирующих все реакционные центры вышеперечисленных ферментов от взаимодействий с кислородом, а по пути создания ферментативных и низкомолекулярных систем перехвата уже образовавшихся АФК. Разумеется, эти системы минимизируют вред от АФК в момент времени, однако данные изменения имеют свойства накапливаться в клетках, в конечном счёте вызывая существенные поражения. На данной идее основана одна из гипотез старения, т.н. «гипотеза катастроф». Возможно, одним из решений этой проблемы станет создание белковых препаратов, которые смогут встраиваться в приведённые выше митохондриальные ферменты так, чтобы не нарушать их структуру и функции, но при этом экранироваться все АФК-генерирующие центры от молекулярного кислорода. Однако необходимо помнить, что АФК играют важное значение в иммунном ответе организма и потеря способности генерировать АФК рядом её клеток может стать опасной. Примером тому служат люди с мутацией в ферменте NOX4. Прямое следствие этой мутации - возникновение хронического гранулематоза.

Также хотелось бы обратить внимание на мнении, согласно которому митохондрии - главные внутриклеточные производители АФК. С одной стороны, данная идея вполне уместна и логична, ввиду того, что именно митохондрии являются «энергетической станцией клеток». С другой стороны, данный процесс имеет давнюю эволюционную историю, то наверняка, митохондрии, лучше прочих компартментах клетки, защищены от АФК. Поэтому мне кажется целесообразным поставить вопрос несколько иначе: Являются ли АФК, производимые митохондриями наиболее токсичными для организма?

Другая интересная проблема, это изучение возможной сигнальной роли АФК. Прежде всего, надо сказать, что ни о какой сигнальной роли в привычном понимании не может идти речи, ввиду абсолютной не специфичности АФК по отношению к субстрату. Часть исследователей полагает, что единственная возможна сигнальная роль АФК сводится к взаимодействию с сульфидными группами цистеина с образованием SS - связей. Возможно, в ряде случаев, это действительно играет сигнальную роль.

Существенную проблему представляет точное измерение содержания АФК в момент времени, ввиду их высокой реакционной способности. Часто используется косвенный способ, через взаимодействие АФК и хромогена, количество которого уже можно относительно легко и точно измерить.

Размещено на Allbest.ru