Бактеріальна біоінокуляція як спосіб підвищення морфометричнихпоказників однорічних сіянців сосни звичайної

Размещено на http://www.allbest.ru/

Бактеріальна біоінокуляція як спосіб підвищення морфометричнихпоказників однорічних сіянців сосни звичайної

За результатами дослідження встановлено, що бактеріальний штам P. abietaniphila є представником рістстимулювальних бактерій. Він проявив одну із ключових властивостей Plant Growth-Promoting Bacteria (PGPB), а саме здатність продукувати фітогормон ауксинової природи - індолілтриоцтову кислоту (ІОК) у кількості 85,06 мг на літр поживного середовища. З'ясовано, що ця властивість бактерій сприяє розвитку системної резистентності рослин та збільшенню морфофізіологічних показників проростків після біоінокуляції. Спостерігали за збільшенням довжин кореневих систем в однорічних сіянців, що попередньо інокулювалися з бактеріальним штамом P. abietaniphila на 57,7-58,7 %. Виявлено, що тенденція до збільшення довжини кореневої системи сіянців відобразилася на збільшенні сирої маси однорічних сіянців. Для дослідної групи, що обробляли суспензією з 109 КУО/мл, це значення становило 0,283 г, а для інокулянту з 108 КУО/мл - 0,210 г, тоді як для контрольної групи сіянців - 0,117 г. Загалом вдалося встановити, що загальна довжина інокульованих сіянців з бактеріальним штамом P. abietaniphila у всіх варіантах дослідження зростає завдяки збільшенню довжини кореневої системи. Проте з'ясовано, що оброблення 14-добових проростків суспензією, що містила 109 КУО/мл, спричинило збільшення довжини надземної частини однорічних сіянців на 20 %, порівняно з відповідним контролем. Результати наших досліджень свідчать, що бактеріальний штам P. abietaniphila потенційно покращить адаптацію сіянців сосни до природних умов середовища. Це свідчить про на перспективність використання його у практиці лісового господарства, для отримання високоякісних сіянців та саджанців сосни звичайної.

Сосна звичайна (Pinus sylvestris L.) - це головна лісотвірна порода в лісах України. За даними Державного агентства лісових ресурсів України станом на серпень 2018 р. площа всихання насаджень у лісах сягає понад 395,4 тис. га (близько 25,3 % від загальної площі лісових ділянок України) і щорічно збільшується на 8 тис. га. Майже половина загиблих дерев, а саме 200 тис. га - це соснові насадження (State agency, 2018).

Питання нарощування лісистості входить до пріоритетних напрямів розвитку світової лісогосподарської галузі. Тому важливим завданням Державного агентства лісових ресурсів України (центрального органу виконавчої влади у галузі лісового та мисливського господарства) є отримання високоякісного садивного матеріалу хвойних дерев, зокрема сосни звичайної (Sviridova, 2019). Зі світової практики стало очевидним, що єдиним безальтернативним шляхом виходу лісового господарства із системної кризи є перехід на засади сталого розвитку. Одним з важливих факторів досягнення цієї мети є широке застосування в лісовому господарстві здобутків агробіотехнології, що стосуються розроблення ефективних новітніх біопрепаратів для покращення живлення сіянців та застосування техніки біоінокуляції.

Аналіз літературних даних. Традиційно у сільському та лісовому господарствах використовують синтетичні хімічні сполуки для захисту рослин, що веде до зростання кількості екологічних проблем: їх виявлено у харчовому ланцюзі, пестициди мають здатність викликати стійкість у фітопатогенних організмів, встановлена токсичність для людини, рослин, домашніх тварин та дикої природи робить їх непридатними для подальшого використання.

Тому зараз на світовому ринку є потреба у нових ефективних біопрепаратах на підставі бактеріальних штамів для сільськогосподарської і лісової галузей господарства, що є екологічно безпечні. Основою сучасних біоінокулянтів є рістстимулювальні бактерії або Plant Growth-Promoting Bacteria (PGPB) - це група корисних мікроорганізмів, що можуть перебувати у зоні ризосфери, на поверхні кореня або бути асоційованими з коренем, і здатні збільшувати ріст рослини та стійкість проти біотичного та абіотичного стресу (Glick, 2012; Hallmann, 1997; Kloepper, 1989; Souza, 2015). Встановлено, що є декілька механізмів або генетичних процесів, через які PGPB стимулюють ріст рослин та доступність поживних речовин, а саме шляхом біологічної фіксації атмосферного азоту, перетворення нерозчинних сполук фосфатів у розчинну форму, підвищення стресостійкості внаслідок модуляції експресії 1 - аміноциклопропан-1-карбоксилат деамінази, продукування фітогормонів та сидерофорів (Glick, 2005, 2007, 2012; Chen, 2006; Souza, 2015).

Найширшого застосування набули біопрепарати у сільському господарстві на підставі бактеріальних культур родів Pseudomonas, Azotobacter, Azospirillum, Bacillus та Klebsiella spp. (Vandana, 2018; Kloepper, 1989; Souza, 2015). Проте останніми роками бактеріальні штами цих родів, як біоконтрольні агенти, почали тестувати і в лісовому господарстві. Так, іспанські та канадські дослідники з'ясували, що бактеріальний штам Pseudomonas fluorescens S32R2, ізольований з ендори- зосфери здорових дерев Pinus radiate L. в осередку ураження, інгібував ріст фунгальних патогенів Heterobasi- dion annosum, Armillaria mellea та Fusarium circinatum in vitro та знижував наслідки патогенного впливу у P. radiate L. (Mesanza et al., 2016; Iturritxa, E., 2017). Бразильські дослідники, продемонстрували, що інокуляція сіянців Pinus taeda бактеріальним штамом Bacillus sub- tilis збільшувала біомасу коріння і пагонів на 67,1 % і 33,1 %, відповідно (Santos, 2018). Сербські науковці встановили, що інокуляція сінців сосни звичайної та ялини комплексною бактеріальною суспензією Azotobacter chroococcum, Bacillus megaterium, B. circulans, B. licheniformis, B. pumilus, B. amyloliquefaciens призвела до збільшення біомаси у сосни на 43 % і ялини - на 34 % (Karlicic, 2016).

Проте в Україні даних про вплив інокуляції бактеріальними біопрепаратами на головні хвойні деревні породи є досить мало. У попередніх наших дослідженнях виявлено, що новим потенційним представником рістстимулювальних бактерій є штам P. аbietaniphila. Так, після трьох діб інокуляції 7-добових проростків сосни звичайної з бактеріальною суспензією P. аbieta- niphila, відзначено збільшення морфометричних показників проростків (результати не опубліковано). На відміну від інших бактеріальних штамів роду Pseudomonas, дослідний штам виділений з тканин сосни звичайної в осередку ураження та здатний рости на абети- новій та дегідроабіетиновій кислотах, які своєю чергою є основною складовою частиною каніфолі хвойних, а це свідчить про тісний еволюційний взаємозв'язок між цією бактерією і сосною звичайною (Martin, 1999; Mohn, 1999).

Об'єкт дослідження - біопротекторні процеси бактерій P. аbietaniphila, що підвищують стійкість сосни звичайної.

Предмет дослідження - методи і засоби встановлення морфометричних показників однорічних сіянців сосни звичайної після бактеріальної біоінокуляції.

Мета роботи - встановити основні рістстимулю- вальні властивості штаму P. аbietaniphila щодо сіянців сосни звичайної.

Завдання дослідження - виявити здатність штаму P. аbietaniphila до продукції фітогормону ауксинової природи - ІОК та дослідити зміну морфометричних показників сіянців сосни звичайної після інокуляції бактеріальною суспензією цього штаму.

Наукова новизна дослідження полягає в тому, що на сьогодні у веденні лісового господарства дедалі частіше стали використовувати прийоми та методи агробіотех- нології. Зокрема, великої популярності набуває застосування новітніх біопрепаратів для цінних хвойних деревних порід: сосни звичайної, ялиці білої, ялини європейської та ін. Тому актуальним є пошук нових ефективних бактеріальних штамів із ріст стимулювальними властивостями, що сприятимуть підвищенню імунності сіянців та саджанців сосни звичайної і стійкості до негативної дії біотичних та абіотичних чинників довкілля.

Матеріали та методи дослідження. Визначення вмісту ауксину (індолілтриоцтової кислоти (ІОК)) у культуральному середовищі бактерій. Для виявлення здатності бактеріального штаму P. abietaniphila продукувати фітогормони ауксинової природи використали колориметричний метод за Сальковським (Gordon, 1951). Для цього бактеріальні клітини нарощували у колбах упродовж чотирьох діб у середовищі Кінга з додаванням 0,5 % триптофану на качалці (240 об/хв) за 30 оС упродовж 24 год. Відбирали 1,5 мл нарощеної бактеріальної суспензії у мікропробірки та осаджували центрифугуванням (13 000 об./хв, упродовж 10 хв). У підготовлені лабораторні пробірки додавали 1 мл утвореної надосадової рідини та 4 мл реактиву Сальковсь- кого (1 мл 0,5 M FeCl3, 50 мл H2O і 30 мл конц. H2SO4). Наявність ІОК у культуральному середовищі визначали за появою рожевого забарвлення. Вміст досліджуваного фітогормону у культуральній рідині кількісно визначали спектрофотометрично за допомогою спектрофотометра ULAB 102 UV, за довжини хвилі 530 нм. Як контроль використали стерильне поживне середовище з триптофаном без бактеріальної культури. Кількість ауксину вираховували відносно калібрувальної кривої для стандартного розчину ІОК (50 мг/л). Вміст ІОК у культуральному середовищі обчислювали як різницю між отриманим значенням досліджуваного зразка та контрольної групи.

Біоінокуляція проростків сосни звичайної. У дослідах використано насіння P. sylvestris L., люб'язно надане Львівським лісовим селекційно-насіннєвим центром. У чашках Петрі пророщували по 50 насінин на фільтрувальному папері, попередньо змоченому дистильованою водою, за температури +26 °С. На 14-ту добу корінці проростків сосни інокулювали бактеріальною суспензією впродовж 2 год, що містила 109 та 108 колоніє утворюючих одиниць у мілілітрі середовища (КУО/мл). Як контроль використали фізіологічний розчин - 0,9 % розчин натрій хлориду. По 10 оброблених проростків сосни, для кожного варіанта дослідження, висаджували в горщики з поліетиленових матеріалів, що наповнювали ґрунтосумішшю. Щоб оцінити дію бактеріальної інокуляції, проводили облік збереження однорічних сіянців. Вимірювали морфометричні показники сіянців сосни звичайної контрольної і дослідної групи на 45-й тиждень після інокуляції. Довжину надземної частини (англ. Shoot Length, SL), кореневої системи (англ. Root Length, RL), сумарну довжину сіянців (англ. Total Seedlings Length, TSL) вимірювали у міліметрах за допомогою лінійки. Загальну масу свіжих проростків (англ. Fresh Weight of Seedlings, FWS) визначали зважуванням на лабораторних вагах Mettler PM 4600, з точністю до сотої частини грама. Статистичні методи дослідження. Статистичне опрацювання отриманих результатів проводили з використанням програми Microsoft EXCEL-2007. Побудову 3D моделей та обчислення статистичних даних проводили за допомогою стандартного модуля Multiple Regression програми STATISTICA 10.0. Досліди проведено у двотриразовій повторності для кожного варіанта. Результати дослідження. Вплив бактерій групи РОРБ на рослинний організм здебільшого досягається внаслідок продукування фітогормонів ауксинової групи. Продукування ІОК рістстимулювальними бактеріями, - це один із шляхів стимулювання проростання насіння, пришвидшення росту кореня, зміни структури кореневої системи, збільшення біомаси коріння і зрештою пришвидшення росту рослини (БаИа, 2000).

Використовуючи якісну реакцію на з'єднання, що містять індол, ми перевірили вміст ауксинів у бактеріальному культуральному середовищі P. abietaniphila. Спостерігали за зміною забарвлення в рожевий колір у пробірці, де знаходився дослідний зразок. Утворення забарвленої сполуки ІОК з реактивом Сальковського вказує, що штам бактерій P. abietaniphila продукує фі- тогормон з ряду ауксинів (рис. 1).

Рис. 1. Якісне виявлення ІОК у культуральному середовищі бактерій P. аЬМапірИІа (в). Як контроль використали зразки з дистильованою водою (а) (негативний контроль) і розчином ІОК з концентрацією 200 мкг/мл (б)

Використовуючи спектрофотометричний метод, детектували, що бактеріальний штам Р. abietaniphila здатний синтезувати 85,06 мг ІОК на літр середовища, відповідно до значень калібрувальної кривої для ІОК. Це значення у 2,75 раза більше, відносно контролю - середовище без росту бактерій. З аналізу літературних даних нам вперше вдалося встановити цю властивість для штаму Р. аЬШапіркіїа.

Здатність бактеріальних штамів до синтезу фітогормону корелює зі зростанням морфометричних показників рослин, що попередньо ними інокулюються. Наступним етапом роботи були дослідження впливу інокуляції бактеріальним штамом на проростки сосни звичайної. На час аналізу досліду, встановили, що попередня обробка 14-добових проростків P. sylvestris L. бактеріальною суспензією, збільшує збереженість однорічних сіянців у ґрунтовому субстраті в 1,9--2,0 рази відносно контролю.

Окрім цього бактеріальна біоінокуляція позитивно впливала на біометричні показники однорічних сіянців сосни звичайної. Так, довжина кореневої системи у сіянців експериментальної групи, які інокулювали з бак-теріальною суспензією, що містила 109 КУО/мл, збіль-шувалася на 57,7 %, тоді як оброблення інокулянтом, що містив 108 КУО/мл - на 58,7 %, відносно контрольної групи проростків (таблиця, рис. 2, знизу).

На час аналізу біометричних показників однорічних сіянців P. sylvestris L. виявили достовірну позитивну різницю у довжині надземної частини у варіантах з бактеріальною суспензію, що містила 109 КУО/мл. Спостерігали тенденцію до збільшення лінійного розміру стебла на 20 %, порівняно з відповідним контролем (див. таблицю).

Використовуючи 3D моделі у програмі Statistica, провели порівняльний аналіз залежності загальної сирої маси однорічних сіянців сосни звичайної від довжин кореневої системи та надземної частини, за дії бактеріальної біоінокуляції штамом P. Abietaniphila.

Визначили, що вплив бактерій з кількістю 109 КУО описується таким рівнянням: TWS(109RyO) = -0,299 + 0,0075-х - 0,0002-у, тоді як дія інокулянту, що містив 108 КУО - TWS(109RyO) = -0,282 + 0,0049-х - 0,0008-у. На підставі цих даних нам вдалося встановити, що здатність бактерій до синтезу фітогормону ауксинової природи веде до збільшення підземної частини сіянців сосни звичайної у всіх варіантах дослідження, відносно відповідного контролю. Проте збільшення кількості клітин в інокулянті у 10 разів спричиняє покращення росту і надземної частини на 11,8 мм та 14,2 мм відносно контрольної групи сіянців та тесту з 108 КУО, відповідно. Тенденція до збільшення довжин кореневої системи позначилася на збільшенні сирої маси однорічних сіянців. Для дослідної групи, що обробляли суспензією з 109 КУО/мл, це значення становило 0,283 г, а для інокулянту з 108 КУО/мл - 0,210 г, тоді як для контрольної групи сіянців - 0,117 г. Ймовірно, бактерії штаму P. abietaniphila володіють й іншими рістстимулювальни- ми властивостями, зокрема, здатні поглинати атмосферний азот та переводити нерозчинні сполуки Фосфору у легкодоступну форму для рослин. Тому збільшення клітин в інокулянті на порядок чинить ефект збільшення морфометричних показників сіянців сосни, не лише за дії фітогормону, але і завдяки покращенню їх мінерального живлення.

Обговорення результатів дослідження. Бактерії роду Pseudomonas - це одна з найчисленніших груп рістстимулювальних мікроорганізмів, на підставі яких розроблено сучасні біопрепарати для рослин, що здатні покращувати їх ріст та сприяти захисту від атак патогенними організмами. На підставі наших досліджень нам вперше вдалося виявити нового представника групи PGPB - P. abietaniphila. Виявлено його здатність до продукування фітогормону ауксину, подібно до інших рістстимулювальних бактерій цього роду. Таку властивість описано і для P. fluorescence, ізольованого зі зони ризосфери цибулі, що продукував ІОК у кількості 15,38±0,537 мкг/мл середовища (Reetha, 2014). За результатами іншого дослідження встановлено, що бактеріальні штами P. fluorescens і P. putida, ізольовані з ризосфери м'якої пшениці, синтезують ІОК in vitro у кількості 89 мкг/мл та 116 мкг/мл, відповідно (Meliani, 2017).

ІОК допомагає в утворенні більш довгих коренів зі збільшенням кількості кореневих волосків і бічних сторін кореня, які залучені у поглинанні поживних речовин (Datta, 2000). Тому інокуляція 14-добових проростків сосни звичайної бактеріальною суспензією P. abietaniphila сприяла кращому розвитку кореневої системи в однорічних сіянців у межах 57,7-58,7 %, порівняно з контролем. Відповідно детектували і збільшення сирої маси сіянців майже вдвічі. Проте у дослідженні з сіян-цями P. taeda L. показано, що інокуляція з бактеріальним штамом P. fluorescens, що продукує ауксини, веде до збільшення довжини кореня в межах стандартної по-хибки, але спостерігали за зменшенням біомаси корене-вої системи до 31,42 % (Santos, 2018). Проте у дослі-дженні з проростками Acacia polyphylla DC., що попе-редньо біоінокулювалися з бактеріальною суспензією P. fluorescens (strain MCR1.10), що синтезує 441,8 мкг/мл ІОК, встановлено достовірне збільшення кількості додаткових корінців, але зменшення загальної сухої маси її на 19,7 %, порівняно з контролем (Castro, 2018).

Висновки

бактерія резистентність рослина

За результатами дослідження нам вперше вдалося встановити, що бактеріальний штам P. abi- etaniphila є представником ріст стимулювальних бактерій, за його властивістю до синтезу фітогормону ауксинової природи - ІОК. Окрім цього цей бактеріальний штам сприяє зростанню основних морфофізіологічних показників однорічних сіянців сосни звичайної: довжини кореневої системи - на 57,7-58,7 % (під час аналізу усіх дослідних груп) та довжини стебла на 14,2 мм (після оброблення бактеріальною суспензією, що містила 109 КУО/мл).

Саме на підставі цих властивостей штаму P. abietaniphila та з використанням техніки біоінокуляції сіянців і сіянців сосни звичайної цією бактеріальною суспензією покращуватиметься адаптація сіянців сосни до природних умов середовища. Це свідчить про перспективність використання його в практиці лісового господарства для отримання високоякісних сіянців і саджанців сосни звичайної, а також для підвищення агрономічної ефективності завдяки зниженню собівартості та забруднення навколишнього середовища на противагу хімічним препаратам.

Публікація містить результати досліджень, проведених за грантом Президента України за конкурсним проектом Ф82/217-2019.

Література

бактерія резистентність рослина

1.Biological fire. (2018). The area of trees drying is almost 400 thousand hectares. State Agency of Forest Resources of Ukraine. Retrieved from: https://dklg.kmu.gov.ua/forest/control/uk/publish/ article?art id=194269&cat id=32888&fbclid=IwAR1TnrfSCTN- YfHkOur8bwEbh2WsOFmBERuDL6UVovG9YstHRknbzCDboh4.

2.Castro, R. A., Dourado, M. N., Almeida, J. R., Lacava, P. T., Nave, A., Melo, I. S., & Quecine, M. C. (2018). Mangrove endophyte promotes reforestation tree (Acacia polyphylla) growth.

Размещено на Allbest.ru