Нет такого экспериментального подхода или исследовательского направления в биотехнологии, которые бы не получили применения в медицине.

Антибиотики - это специфические продукты жизнедеятельности, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов и к злокачественным опухолям, избирательно задерживающих их рост или полностью подавляющих развитие. Далеко не все из этих соединений, число которых приближается к 5000, допущены для применения в медицине.

Причины неослабевающего внимания к поиску новых антибиотиков связаны с токсичностью существующих антибиотиков, аллергическими реакциями, вызываемыми ими, нарастанием устойчивости патогенных микроорганизмов к применяемым препаратам и, помимо этого, с необходимостью изыскания средств борьбы с возбудителями, против которых недостаточно эффективны известные ныне антибиотики. Основные пути поиска включают:

1) Испытание новых продуцентов. Так, с начала 80-х годов исследуют миксобактерии, продуцирующие большое количество антимикробных агентов.

2) Химическая модификация антибиотиков. Противомикробные макролиды токсичны для человека. Например, гептаен амфотерицин В, используемый по жизненным показаниям при тяжелых микозах, вызывает необратимые поражения почек. Получены метиловые эфиры амфотерицина, менее токсичные и сохраняющие противогрибковую активность. При модификации пенициллинов и цефалоспоринов используют иммобилизованные ферменты.

Биотехнология предоставляет медицине новые пути получения ценных гормональных препаратов. Особенно большие сдвиги произошли в последние годы в направлении синтеза пептидных гормонов.

Раньше гормоны получали из органов и тканей животных и человека (крови доноров, удаленных при операциях органов, трупного материала). Требовалось много материала для получения небольшого количества продукта. Так, человеческий гормон роста (соматотропин) получали из гипофиза человека, каждый гипофиз содержит его не более 4 мг. В то же время для лечения одного ребенка, страдающего карликовостью, требуется около 7 мг соматотропина в неделю; курс лечения должен продолжаться несколько лет. С применением генноинженерного штамма Е. coli в настоящее время получают до 100 мг гормона роста на 1 л среды культивирования. Открываются перспективы борьбы не только с карликовостью, но и с низкорослостью - более слабой степенью дефицита соматотропина. Соматотропин способствует заживлению ран и ожогов, наряду с кальцитонином (гормоном щитовидной железы) регулирует обмен Са²⁺ в костной ткани.

Инсулин, пептидный гормон островков Лангерганса поджелудочной железы, представляет основное средство лечения при сахарном диабете. Эта болезнь вызвана дефицитом инсулина и проявляется повышением уровня глюкозы в крови. До недавнего времени инсулин получали из поджелудочной железы быка и свиньи. Препарат отличался от человеческого инсулина 1-3 аминокислотными заменами, так что возникала угроза аллергических реакций, особенно у детей. Широкомасштабное терапевтическое применение инсулина сдерживалось его высокой стоимостью и ограниченностью ресурсов. Путем химической модификации инсулин из животных удалось сделать неотличимым от человеческого, но это означало дополнительное удорожание продукта.

Компания EliLilly с 1982 г. производит генноинженерный инсулин на основе раздельного синтеза Е. coli его А- и В-цепей. Стоимость продукта значительно снизилась, получаемый инсулин идентичен человеческому.

Значителен вклад биотехнологии и в промышленное производство непептидных гормонов, в первую очередь стероидов. Методы микробиологической трансформации позволили резко сократить число этапов химического синтеза кортизона, гормона надпочечников, применяемого для лечения ревматоидного артрита. При производстве стероидных гормонов широко используют иммобилизованные микробные клетки, например Arthrobacter globiformis, для синтеза преднизолона из гидрокортизона. Имеются разработки по получению гормона щитовидной железы тироксина из микроводорослей.

Биотехнология и пищевая промышленность

Микроорганизмы, культуры растительных клеток могут дать пищевые добавки, выгодно отличающиеся своей «натуральностью» от синтетических продуктов, преобладающих в настоящее время. В будущем кулинар сможет добавить в изделие аромат земляники или винограда, масло чеснока или мяты, продукты, образуемые в биореакторах с растительными клетками.

Все большее значение приобретают низкокалорийные, не опасные для больных диабетом заменители сахарозы, в первую очередь фруктоза - продукт превращения глюкозы при участии иммобилизованной глюкоизомеразы. В некоторых продуктах применяют глицин, дающий в комбинации с аспарагиновой кислотой различные оттенки сладкого и кислого. Планируют пищевое применение очень сладкого дипептида аснартама и особенно 100-200-звенных пептидов тауматина и монеллина, которые слаще сахарозы в 10 тыс. раз. В виде мультимера аспартам получен с помощью генноинженерных мутантов Е. coli, недавно клонирован также ген тауматина.

Немаловажную роль играют ныне в пищевой промышленности ферменты. С их помощью осветляют фруктовые соки, производят безлактозное (диетическое) молоко, размягчают мясо. Большие возможности в плане повышения питательной ценности представляет добавление в продукты питания витаминов и аминокислот. Ряд аминокислот производят с применением микробов-сверхпродуцентов, полученных с применением методов генетической инженерии. Так, генноинженерный штамм E.coli синтезирует до 30 г/л L-треонина за 40 ч культивирования. Важный аспект биотехнологии - улучшение штаммов промышленных микроорганизмов.

Биомасса одноклеточных в перспективе может употребляться как пищевая добавка. Основные принципы получения белка в пищу те же, что и для производства кормового белка, однако круг допустимых субстратов более ограничен, требования к компонентному составу биомассы более жесткие. В пищевой биомассе должно содержаться не менее 80% белка сбалансированного аминокислотного состава, не более 2% нуклеиновых кислот и 1% липоидов.

Перспективным представляется культивирование грибов, цианобактерий, зеленых водорослей, имеющих консистенцию и другие органолептические свойства, более привычные для человека.

2. Понятие о культивировании микроорганизмов

Культивирование - это выращивание микроорганизмов на питательных средах, в ходе которого происходит накопление как микроорганизмов так и продуктов их жизнедеятельности.

Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной среды, сильно зависит от физических и химических факторов (температуры, кислотности, аэрации, света и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболизма каждой группы бактерий. Можно выделить методы культивирования на твердых и в жидких питательных средах; в аэробных, анаэробных и микроаэрофильных условиях. Характеристики этого процесса устанавливают путем измерения таких показателей как число клеток или их биомасса.

В лаборатории микроорганизмы выращивают на плотных и жидких питательных средах, которые разливают в пробирки, колбы, матрасы и чашки Петри. Посуду и питательные среды предварительно стерилизуют различными методами.

Внесение микроорганизмов в стерильную среду называется посевом, или инокуляцией. Посев микроорганизмов требует соблюдения определенных правил, которые необходимо выполнять, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами. Перед посевом следует сделать надписи на посуде. Клетки микроорганизмов для посева или приготовления препаратов берут бактериологической петлей или иглой, если микроорганизмы выращивали на плотной среде. В случае, когда микроорганизмы выращены в жидкой среде, лучше пользоваться пипеткой. После пересева пробирки или другие сосуды с микроорганизмами помещают в термостаты с определенной температурой.

По окончании работы посуду с культурами микроорганизмов, подлежащими выбрасыванию, следует автоклавировать, чтобы убить клетки, и только после этого мыть. Допускается заливать дезинфицирующим раствором поверхность плотных сред. Через сутки среды можно выбрасывать и посуду мыть. Неаккуратное обращение с культурами микроорганизмов приводит к возникновению бактериального аэрозоля.

Виды культивирования

Культивирование в микроанаэростате - аппарате для выращивания микроорганизмов, в котором воздух замещен газовой смесью. Наиболее часто используемая смесь имеет следующий состав: азот с 5 % СО₂ и 10 % Н₂.

Использование химических веществ, поглощающих молекулярный кислород. В качестве поглотителей молекулярного кислорода в лабораторной практике используют щелочной раствор пирогаллола, дитионит натрия (Na₂S₂O₄), металлическое железо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реактивы. Поглотители помещают на дно химического эксикатора с притертой крышкой, а также анаэробные бактерии, засеянные в колбу, пробирку или чашку Петри. При таком способе создания анаэробных условий необходимо учитывать поглощающую способность реактивов и объем замкнутого пространства, в котором выращиваются бактерии.

Использование восстанавливающих агентов, которые добавляют для снижения окислительно-восстановительного потенциала среды: тиогликолат натрия, цистеин, дитиотрейтол, аскорбиновая кислота. Удаления кислорода из среды можно добиться и в результате быстрого нагревания и кипячения среды с последующим быстрым охлаждением. Если в такую среду засеять анаэробные микроорганизмы и наслоить смесь (1:1) масла и парафина, то в подобных условиях будет наблюдаться рост нестрогих анаэробов.

Выращивание совместно с аэробными или факультативно-анаэробными бактериями. В жидкой среде с восстанавливающими агентами перед инокуляцией анаэроба проводят культивирование, например, E.coli, что приводит к удалению из среды остаточного кислорода. Перед инокуляцией анаэробов клетки E.coli убивают нагреванием.

Существует и другая модификация метода. На половине чашки Петри засевают какой-либо аэробный микроорганизм, на другой - анаэроб. Края чашки заливают парафином. Рост анаэробного микроорганизма начнется после полного использования кислорода аэробом.

Для культивирования анаэробных бактерий используют и другие методы, ограничивающие доступ воздуха к растущей культуре:

* выращивание в высоком слое среды;

* выращивание в толще плотной среды;

* культивирование в вязких средах, в которых диффузия молекулярного кислорода в среду уменьшается с увеличением ее плотности;

* заливка среды с посевом высоким слоем стерильного вазелинового масла или парафина.

3. Получение органических кислот

микроорганизм биотехнологический вакцина фермент

В настоящее время биотехнологическими способами в промышленных масштабах синтезируют ряд органических кислот. Из них лимонную, глюконовую, кетоглюконовую и итаконовую кислоты получают лишь микробиологическим способом; молочную, салициловую и уксусную - как химическим, так и микробиологическим способами, а яблочную - химическим и энзиматическим путем.

Получение уксусной кислоты. Уксусная кислота имеет наиболее важное значение среди всех органических кислот. Ее используют при выработке многих химических веществ, включая каучук, пластмассы, волокна, инсектициды. Микробиологический способ получения уксусной кислоты состоит в конверсии этанола в уксусную кислоту при участии бактерий штаммов Acetobacter и Gluconobacter:

Процесс идет в анаэробных условиях в режиме непрерывного культивирования продуцента. Для роста бактерии Acetobacteraceti используют питательные среды, содержащие 6-12% этилового спирта, 1 % бактериального гидролизата, 0,05 % дигидрофосфата калия, 0,1% гидрофосфата аммония и 0,05% сульфата магния. Максимальная удельная активность непрерывной культуры Acetobacter aceti (количество микрограммов субстрата, подвергшегося окислению 1мкг биомассы за 1 мин) достигается к 20-м суткам культивирования при концентрации спирта 7 % и составляет 3,0 ед./мг.

Получение лимонной кислоты. Лимонную кислоту широко используют в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности. Ею заменяют фосфаты в составе детергентов, так как она полностью метаболизируется живыми организмами. Лимонная кислота образует хелаты с металлами, поэтому ее применяют для их очистки. Объем мирового производства цитрата составляет 400 тыс. т/год. Самый крупный производитель лимонной кислоты США. Производство лимонной кислоты принадлежит к числу старейших промышленных микробиологических процессов: оно было организовано в 1893 г. С этого момента параллельно развитию фундаментальной микробиологии велись изыскания оптимальных продуцентов и технологических вариантов процесса ферментации. Для промышленного производства лимонной кислоты используют главным образом культуру гриба Acetobacter niger, а также Acetobacter wentii.

Среди соединений, получаемых биотехнологическими методами, аминокислоты занимают первое место по объему производства и второе место по стоимости, уступая по последнему параметру лишь антибиотикам. Объем мирового производства аминокислот составляет более 500 тыс. т в год, из которых 300 тыс. т приходится на глутамат натрия, 100 тыс. т на лизин и 140 тыс. т на метионин. Однако указанный объем -- лишь небольшая доля от требуемого количества аминокислот. По данным ВОЗ, потребность человечества всего лишь в четырех незаменимых аминокислотах составляет, млн т: для лизина - 5, метионина - 4, треонина - 3,7 и триптофана - 2.

Аминокислоты -- структурные единицы белков. Природные аминокислоты вовлечены в биосинтез ферментов, ряда гормонов, витаминов, антибиотиков, алкалоидов, токсинов и других азотсодержащих соединений (пурины, пиримидины, гем и пр.). В организме животного практически половина белковых аминокислот не синтезируется. Они называются незаменимыми аминокислотами и должны поступать в организм с пищей. Недостаток каждой из этих аминокислот в пищевом или кормовом рационе приводит к нарушению обмена веществ, замедлению роста и развития.

Введение синтетических незаменимых аминокислот в кормовые концентраты позволяет балансировать корма сельскохозяйственных животных по уровню белка. При добавлении 2-4 дефицитных аминокислот к 1 т комбикорма общий расход кормов уменьшается на 15-20 %, выход продукции увеличивается на 20 %. Добавление к кормам аминокислот способствует переводу животноводства на промышленную основу.

4. Ультрафильтрация микробных суспензий

Ультрафильтрация -- разновидность мембранной фильтрации, то есть процесса фракционирования по размеру растворенных или суспендированных компонентов путем фильтрации через мембраны с ограниченной проницаемостью. Ультрафильтрация находит широкое применение в вирусологии, микробиологии и других медицинско-биологических науках, а также в медицинской и пищевой промышленности.

При ультрафильтрации растворитель и растворенные или суспендированные в нем компоненты с размерами частиц, меньшими, чем диаметр пор мембраны фильтра, под действием избыточного давления сверху, разряжения снизу или ускорения при центрифугировании проходят через фильтр, а более крупные компоненты скапливаются над ним. В зависимости от размера пор различают ультрафильтры (диаметр пор от 0.001 до 0,05 мкм) и микропористые фильтры (диаметр пор от 0,05 мкм и более). Ультрафильтры используют для концентрирования, фракционирования и обессоливания растворов белков и других органических и неорганических полимеров с молярным весом (массой) 500 -- 300 000, а также для концентрирования вирусов. Микропористые фильтры применяют для фракционирования и концентрирования различных суспензий и для стерилизации жидкостей. Современные ультрафильтры обычно представляют собой плотные анизотропные (кожистые) мембраны из инертных полимеров, помещаемые на высокопористые подложки, и имеют форму дисков, конусов или полых волокон, собранных в жгут. Реже применяют гомогенные целлюлозные фильтры. Микропористые фильтры изготавливают также из стекла и керамики. Широкое применение в микробиологии имели керамические фильтры в виде цилиндров, так называемые свечи Шамберлана.

Наличие положительного или отрицательного давления отличает ультрафильтрацию от диализа, в основе которого лежит обычная диффузия, а направление движения молекул растворителя и мелких растворенных частиц определяется градиентом концентрации по обе стороны полупроницаемой мембраны. Однако при ультрафильтрации, как и при диализе, процесс не сопровождается увеличением концентрации низкомолекулярных веществ и повышением ионной силы раствора. Важной характеристикой ультрафильтров, часто определяющей возможность использования ультрафильтрации для решения той или иной экспериментальной или производственной задачи, является их производительность, т. е. скорость тока фильтруемой жидкости через ультрафильтр, выражаемая обычно в мл/мин/см². При прочих равных условиях величина производительности ультрафильтра возрастает с увеличением диаметра пор и их количества на единицу площади фильтра (степени порозности), уменьшением толщины ультрафильтра и возрастанием создаваемой разности давления. Однако указываемая в паспорте ультрафильтра его производительность устанавливается обычно при фильтровании абсолютно чистой воды. Эта операция дает возможность определить по скорости фильтрации пористость мембраны фильтра, так как количество воды, проходящее за единицу времени при определенном давлении через 1 см² ультрафильтра, прямо пропорционально квадрату диаметра его пор. Следует отметить, что при длительном прохождении через ультрафильтр обычной дистиллированной воды в конце концов наступает уменьшение производительности фильтра. При фильтровании биологических жидкостей, вирусных и микробных суспензий уменьшение производительности фильтра наступает значительно быстрее. Снижение производительности ультрафильтра объясняется тремя главными причинами: первичной адсорбцией, то есть молекулярной и ионной адсорбцией частиц на поверхности ультрафильтра и внутри его пор, что ведет к уменьшению их диаметра, так называемой блокировкой или кольматажем -- механической задержкой фильтрующихся частиц и особенно их агрегатов внутри пор ультрафильтра, что ведет к забиванию пор и уменьшению степени порозности фильтра, механической задержкой более крупных частиц на поверхности фильтра, в результате чего образуется слой, закрывающий рабочую поверхность ультрафильтра и плохо проходимый или совсем непроходимый для жидкости. Поверхность пор на 1 см2 лучших мембранных ультрафильтров достигает 50--100 м2, что может обусловить адсорбцию 50--500 мг белка в виде монослоя. Ионная адсорбция на ультрафильтре зависит от величины заряда материала, из которого сделан ультрафильтр. Ионная и молекулярная адсорбция помимо замедления процесса фильтрации может также обусловить значительные потери целевого материала. Первичная адсорбция на ультрафильтре, как правило, уменьшается при увеличении разности давления по обе стороны мембраны благодаря так называемому эффекту сдувания адсорбированного слоя. Такой прием, однако, не помогает устранить блокировку пор, и положительный эффект в этом случае достигается лишь добавлением поверхностно-активных веществ. Образование плохо проницаемого поверхностного слоя балластных веществ может быть замедлено или предотвращено предварительным удалением этих веществ, а также использованием предфильтров -- фильтров с большим диаметром пор, накладываемых на ультрафильтр, или созданием тока фильтруемой жидкости параллельно поверхности ультрафильтра.

Известны два варианта применения ультрафильтров. При первом из них интересующие исследователя частицы и макромолекулы проходят через ультрафильтр, а более крупные задерживаются на нем. Такой способ обеспечивает очистку и фракционирование суспензии частиц по размеру, а также стерилизацию фильтруемого раствора в случае бактериальных загрязнений, но не его концентрирование. При втором способе интересующие исследователя частицы или макромолекулы по своим размерам превосходят диаметр пор ультрафильтра, в результате чего достигается их концентрирование и очистка, но не стерилизация. Ввиду огромной поверхности пор в ультрафильтрах последние нередко используют для адсорбции из раствора макромолекул и вирусов с их последующим элюированием. В этом отношении удобны растворимые ультрафильтры, после растворения которых адсорбированное вещество переходит в раствор.

Список литературы

1. Биотехнология: Учебник для вузов. Доп. Мин.сельского хоз-ва РФ/ Тихонов И.В. и др.; Под ред. Е.С. Воронина. СПб.: ГИОРД, 2005. 792 с.

2. Егорова Т.А. и др. Основы биотехнологии: Учебное пособие для вузов. Доп.УМО/ Егорова Т.А. и др. - М.: Издат.центр «Академия», 2003. 208 с. Библиогр.: с. 205-206.

3. А.Я. Самуйленко, Ф.И. Василевич, Е.С. Воронин, И.В. Тихонов Биотехнология: Учебник. 2-ое переработанное изд. М., 2013.

4. Практикум по биотехнологии: учебное пособие / И. В. Тихонов, В. А. Гаврилов, Д. А. Девришов и др. Москва: Киселева Н. В., 2010. 329 с.

Размещено на Allbest.ru