Радіобіологія

ЛПЕ = dE / dx

[ЛПЕ] = Дж / м

Позасистемна одиниця вимірювання - еВ/нм.

Значення ЛПЕ для іонізуючих випромінювань різних типів істотно відрізняється. Наприклад: для г-випромінювання при енергії випромінювання Е = 0,2 - 10 МеВ ЛПЕ = 0,2 - 10 еВ/нм; для б- випромінювання при енергії випромінювання Е = 8 МеВ ЛПЕ = 22 еВ/нм.

Рідко- та щільноіонізуючі випромінювання

Випромінювання з малим значенням ЛПЕ, яке індукує рідке розташування йонів, називають рідкоіонізуючим (наприклад, Х-промені, г-промені). Випромінювання з великим значенням ЛПЕ, яке індукує щільне розташування йонів, називають щільноіонізуючим (наприклад, б-промені, потік прпотонів).

Додаткові дозиметричні величини

1) Відносна біологічна ефективність випромінювання (ВБЕ) - коефіцієнт, який характеризує відносну ефективність дії радіації з різними значеннями ЛПЕ щодо певного біологічного ефекту.

ВБЕ = D_st/D_r

D_st - доза, взятих за стандарт променів, необхідна для індукування певного ефекту даної інтенсивності прояву;

D_r - доза променів іншого типу, потрібна для індукування того самого ефекту такої ж інтенсивності прояву.

Поняттю ВБЕ тотожне поняття коефіцієнт якості іонізуючого випромінювання (КЯ).

2) Еквівалентна доза (D_eq): D_eq = D_p K_z

D_p - поглинута доза;

K_z - коефіцієнт зважування - фенологічний коефіцієнт - показує, у скільки разів випромінювання даного типу ефективніше щодо біологічної дії порівняно з випромінюванням, дія якого береться за одиницю (рентгенівське або г-випромінювання).

[D_eq] = 1 Зв (Зіверт) = еквівалентній дозі, за якої добуток поглинутої дози на відповідний коефіцієнт зважування на тип вмпромінювання = 1 Дж/кг.

3) Ефективна доза D_ef = D_p K_t

K_t - коефіцієнт зважування на тканину - безрозмірний коефіцієнт, що вказує відносний внесок тої чи іншої тканини у формування радіобіологічних ефектів усього організму. [D_ef] = 1 Зв

4) Еквівалентна ефективна доза: D_eef = D_p K_t K_z

K_t K_z = K_ef - величина різна для різних тканин:

Гонади K_ef = 0,2

Кістковий мозок K_ef = 0,12

Печінка K_ef = 0,05

Шкіра K_ef = 0,01

5) Очікувана еквівалентна доза - результат сумації еквівалентних доз опромінення, які людина отримує за певний період життя. Ця величина є інтегралом по часу від потужності еквівалентної дози. Вимірюється у Зівертах.

6) Очікувана ефективна доза - результат інтегрування потужності ефективної дози по часу з тими самими часовими інтервалами, що й у випадку очікуваної еквівалентної дози. Вимірюється у Зівертах.

7) Колективна еквівалентна доза - кількісна оцінка опромінення певної популяції.

D_c = D_i N(D_i) dD_i

D_i - індивідуальна еквівалентна доза

N - число особин у популяції опромінених у дозі D_i

[D_c] = 10⁴ особин Зв

Колективна доза може нагромаджуватись протягом певного часу. Тоді її визначають:

D_ceq = P_ceq(t)dt

P_ceq - потужність колективної еквівалентної дози.

Способи передавання дози опроміненим об'єктам

1) гостре опромінення

2) гостре фракційне опромінення

3) нееквівалентне фракційне опромінення

4) хронічне опромінення з постійною потужністю дози

5) пролонговане опромінення зі змінною потужністю дози

6) пролонговане опромінення з постійною потужністю дози

7) пролонговане опромінення зі ступінчастим зростанням потужності дози

8) переривчасте опромінення

Класифікація потужностей доз опромінення

1) надвисокі - 10¹¹ - 10¹³ сГр/хв;

2) високі - 10² - 10⁶ сГр/хв;

3) низькі - 10^-1 - 10² сГр/хв;

4) дуже низькі - < 10^-1 сГр/хв.

Дози внутрішнього опромінення

Внутрішнє опромінення - опромінення, що отримує середовище або організм внаслідок розпаду радіоактивних ізотопів, що містяться в ньому.

E = N_t E^*

E - енергія частинок;

Е^*- середня енергія спектру частинок;

N_t - число атомів, що розпалися за час t

D_{t in =} K N_t E^*

D_{t in} - доза внутрішнього опромінення за час t;

K - коефіцієнт - для різного випромінювання - різний.

Загальна схема радіобіологічного ефекту

Дія радіації на клітину може бути прямою і непрямою (опосередкованою). Обидві різновидності дій викликають первинні процеси в клітині, що починаються ураженням біологічно важливих молекул. Вторинні процеси у враженій радіацією клітині можуть бути трьох різновидностей і полягати в: інактивації клітини, втраті клітиною здатності до адекватної трансдукції сигналів, формування генетичного вантажу в клітинах. Інактивація клітин приводить до загибелі клітин. Втрата клітиною здатності до адекватної трансдукції сигналів приводить до порушення морфогенезу. Формування генетичного вантажу в клітинах приводить до апоптозу та клітинної селекції.

ТЕОРІЯ МІШЕНІ

Експотенціальні дозові залежності виживання клітин

Більшість дозових залежностей виживання клітин є експотенціальними функціями. Це пояснюється тим, що ураження клітин спричинюється взаємодією гамма-фотонів або частинок зі структурами, інактивація яких супроводжується загибеллю клітини. Тобто першопричиною загибелі клітин є акт влучання частинки або фотона у відповідну її структуру, і ці влучання є випадковими, імовірнісними явищами.

Просторовий розподіл актів влучання (взаємодій випромінювання з речовиною), кожне з яких є незалежною подією, підпорядковується розподілу Пуасона. Це випливає з фізичної суті явища. Якщо для інактивації структури об'ємом v, від ушкодження якої залежить доля клітини, потрібно n актів влучання у цю структуру, то за рівнянням розподілу Пуасона імовірність влучань P(n) за дози D становитиме:

P(n) = (v D)ⁿ e^{- vD} / n !

Очевидно, якщо число влучань у чутливу структуру менше за n, тобто n - 1, то клітина не зазнає інактивації. Якщо N₀ - вихідна кількість клітин, які зазнали опромінення у дозі D, N - кількість клітин, число влучань в які не досягло n, то визначення виживання клітин має вигляд:

P = N/N₀ = e -^vD (vD)^k / k!

При n = 1 ця формула набуває вигляду:

P = N/N₀ = e -^vD

Тоді кількість клітин, що вижили буде становити:

N = N₀ e -^vD

Цей вираз є експоненціальною залежністю. Важливий аспект цього процесу: клітина гине, коли у відповідну структуру потрапляє не одна чпстинка або гамма-фотон, а певна їх кількість. В кожній живій клітині існують структури, для руйнування яких потрібно одне попадання і багато попадань - тобто існують одно- і багатоударні структури в клітині. Ці структури, влучання в які спричинює загибель клітини, називають мішенями.

Принципи теорії мішені

Теорію мішені створили і розвинули такі вчені як Темофеєв-Ресовський, Ціммер, Лі. Теорія мішені базується на трьох принципах:

1) принцип влучання;

2) принцип мішені;

3) принцип посилювача.

Принципи влучання і мішені базуються на таких аксіомах:

1) Передавання енергії іонізуючого вмпромінювання речовині характеризуються дискретністю і статичними особливостями просторового розподілу актів влучань.

2) Молекули або складні субклітинні структури, яким передається енергія випромінювання, що спричинюють їх ураження, мають неоднакове значення в життєдіяльності клітини.

Принцип влучання

Фізичною основою променевого ураження клітини є випадковий акт влучання фотона або зарядженої частинки в певну її ділянку, де відбувається дискретне передавання енергії випромінювання речовині. Таке передавання енергії здійснюється за механізмом або пружного співударяння - фотоелектричного ефекту або непружного розсіювання - ефекту Комптона. Отже, передумовою влучання є проходження крізь клітину треку гамма-фотона або зарядженої частинки і здійснення іонізації або збудження на частині треку в межах клітини. Для випромінювання з малими значеннями ЛПЕ трек може перетинати клітину, і це може не супроводжуватись актами іонізації та збудження молекул. У цьому випадку влучання не здійснюється. Така ситуація менш імовірна для випромінювання з великими значеннями ЛПЕ.

Принцип мішені

Інактивація клітини відбувається лише за умови влучання в певні її ультраструктури. Не всі молекули і складні ультраструктури клітини рівнозначні в системі клітинних процесів. Справді, будь-яка клітина характеризується дуже істотною структурно-функціональною гетерогенністю, функціональні значення окремих компонентів клітини дуже відрізняються.

Принцип посилювача

Інактивація мішені досягається в акті передавання енергії випромінювання речовині, внаслідок чого молекули зазнають іонізації або збудження. На цей процес затрачається мізерна кількість енергії. І в той же час інакивація окремих структур клітини опосередковується множинними процесами, для реалізації яких потрібні набагато більші кількості енергії. Наявна неадекватність масштабів ініціюючої і результативної події у разі дії іонізуючого випромінювання.

Основні поняття теорії мішені

1) Подія влучання - поглинання дискретної кількості енергії, яка реалізується в процесі іонізації або збудження молекули.

2) Мішень - або одиниця що реагує - молекула або надмолекулярна структура, ушкодження якої супроводжується проявом конкретного радіобіологічного ефекту, що є одиницею реакції. Найвиразнішою одиницею реакції є проліферативна загибель клітини.

3) Місце дії - ділянка мішені, в якій відбуваються зміни, зумовлені поглинанням енергії.

4) Ефективний об'єм - простір, що оточує мішень, у межах якого енергія, передана під час взаємодії випромінювання з речовиною, може мігрувати до мішені.

Унікальні та масові структури клітини

Мішенями можуть бути лише ті структури клітини, які мають унікальний характер. Під унікальністю структури розуміють те, що вона є одиничною в клітині й жодна інша структура не здатна компенсувати її функцію, крім того, вона не відтворюється по ходу метаболітичних процесів. Масові структури клітини - це багаторазово продубльовані структури, які можуть відтворюватись в клітинних процесах, а відтак, у разі їх часткової або повної загибелі вони знову з'являються внаслідок біогенезу. За теорією мішені ушкодження масових структур не може бути критичним для клітини, бо завдяки гомеостатичному характеру регуляції біосинтетичних процесів відбувається більш або менш швидке оновлення запасу втрачених внаслідок опромінення молекул шляхом їх синтезу de novo. Білки, ліпіди, вуглеводи, різні кофактори та багато інших речовин виникають по ходу біосинтетичних процесів і синтези їхніх молекул регулюються так, що у випадку виникнення дефіциту якоїсь із цих речовин, відповідно зростає інтенсивність їх синтезу. А значить, ушкодження цих масових структур не може серйозно позначитись на долі опроміненої клітини.

Зовсім інша ситуація з ДНК, молекули якої відтворюються лише один раз за клітинний цикл під час фази реплікації, а в багатьох диференційованих перманентних клітинах такого відтворення взагалі не відбувається. Окремі гени представлені унікальними послідовностями нуклеотидів, повторюються в геномі лише один раз, і ушкодження цих структур може спичинити катострофічні події в клітині. Саме тому мішені пов'язують з ядерними структурами еукаріотичних клітин або кільцевими структурами ДНК прокаріот. У РНК-вірусів мішенями є РНК. Пластиди еукаріотичної клітини мають свій геном - кільцеву прокаріотичну хромосому, і цей геном є критичною структурою, мішенню щодо конкретної пластиди. Але якщо в клітині є значна кількість пластид, то інактивація окремих із них може і не позначитись на долі клітини.

Якщо біогенез ушкодженої клітинної структури відбувається настільки повільно, що негативні явища, які ініціюються радіаційним впливом на зазначену структуру,можуть набути загрозливого для долі клітини розвитку, інактивація клітини може бути наслідком дії випромінювання на такі структури. Саме цим пояснюються причини негативного впливу на клітину ушкоджень мембран - плазмолеми і особливо ядерної мембрани. За малих швидкостей відтворення ці структури поводять себе у формуванні радіобіологічних реакцій як унікальні. У випадку гальмування біосинтетичних процесів деякі компоненти клітини, що представлені обмеженим числом іхніх молекул, також можуть поводити себе як унікальні структури.

Ефективний об'єм мішені

Прологарифмувавши рівняння одноударної інактивації клітини, дістанемо такий вираз: ln(N/N₀) = - vD

Якщо виживання клітин внаслідок опромінення в певній дозі D^* зменшиться у е разів (де е - основа натурального логарифму), то:

ln(1/e) = - vD^*

Оскільки ln(1/e) = - 1, то vD^* = 1, а значить:

V = 1/D^*

Оскільки 1/e = 0,37, то в разі опромінення в дозі D^* виживання клітин становить 37 %. Дозу D^* називають D₃₇ або D₀.

Отже об'єм мішені у випадку її одноударності обчислюється за рівнянням: V = 1/D₀

Теорію мішені логічно застосовувати до визначення розмірів реальних структур, що за своїми функціями мають бути мішенями, ураження яких супроводжується порушенням відповідної функції.

Якщо розміри мішені, які визначено за кривими залежностей доза-ефект та експериментально іншими методами, збігаються, то це, з одного боку, свідчить про евристичність теорії мішені, а з іншого - озброює новим методом структурного аналізу молекулярних і надмолекулярних структур клітини.

На прикладі різних об'єктів було показано, що значення об'єму мішені, визначені за допомогою теорії мішені і прямими вимірюваннями збігаються.

Роль опромінення ядра і цитоплазми в розвитку радіаційного ураження клітини

Для експериментальної перевірки правильності твердження про те, що саме ушкодження ядра, а не цитоплазми є визначальним в ураженні клітини застосували два методи:

1) Використання дуже колімованих пучків іонізуючого випромінювання, яке розсіюється неістотно, а тому і є змога опромінити ядро, фокусуючи на ньому пучок випромінювання. Звісно, при цьому опромінюється шар цитоплазми між клітинною оболонкою ядром по шляху пучка випромінювання. У цих експериментах найчастіше використовували б-промені або дейтрони. Результати таких експериментів свідчать про те, що в процесі ушкодження клітини визначальним є саме опромінення ядра, а не окремих ділянок цитоплазми.

2) Дослідження клітин з апопластидним геномом. Такі геноми отримують шляхом об'єднання пластид - хлоропластів та мітохондрій (у дослідах з рослинними клітинами) з однієї клітини з ядром з іншої клітини. Пластиди мають кільцеві хромосоми, сукупність усієї системи пластид утворює пластидний геном - пластом. Під час опромінення клітин іонізуюча частинка або квант може потрапити на пластом. Проте внаслідок чисельності пластид геном окремої пластиди не є унікальним, бо повторюється в інших пластидах. Якщо апопластидний геном отримували шляхом об'єднання пластому з опромінених клітин, а ядерного геному - з неопромінених клітин, то за зміною властивостей таких клітин можна оцінити внесок у радіаційне ураження клітини ушкоджень її пластому і ядерного геному. Виявилося, що іонізуюче випромінювання найістотніше впливає на ядерний геном клітини. Проте проявляється також і дія випромінювання на клітину, зумовлена радіаційним ураженням пластому. Є спостереження, які свідчать про прямо пропорційну залежність радіочутливості клітини від співвідношення об'ємів ядра і цитоплазми.

Багатоударні мішені

Для ураження клітини може виявитися достатньо одного влучання в мішень. Такі мішені, інактивацію яких спричинює лише один акт передавання енергії, називають одноударними. Криві доза-ефект для клітини з одноударними мішенями є простими експонентами:

N/N₀ = e -^vD

Якщо для інактивації клітини потрібне більш ніж одне влучання в мішень, то такі мішені називаються багатоударними. Криві доза-ефект для клітин з багатоударними мішенями мають складніший вигляд і описуються функцією: N/N₀ = e -^vD (vD)^k / k!

Для клітин з двохударними мішенями залежність доза-ефект має такий вигляд: N/N₀ = e -^vD (1 + vD)

Криві виживання клітин з багатоударними мішенями відрізняються від простої експоненти тим, що в області малих доз вони не є експонентами: у напівлогарифмічному масштабі крива виживання складається з двох частин - власне експоненти в області великих доз і криволінійного “плеча” в області малих доз.

Якщо екстраполювати експоненціальну частину кривої доза-ефект до перетину з віссю ординат, то точка перетину позначить важливий параметр кривої - екстраполяційне число, значення якого відповідає ударності мішені.

Біологічний сенс багатоударності можна вбачати в ампліфікації генів, за активністю яких судять про інактивацію мішені. У випадку диплоїдних клітин, які мають подвійний набір хромосом, для інактивації необхідне влучання в обидві алелі гена, і тому мішені цих клітин - двохударні. Для гаплоїдних клітин характерні одноударні мішені.

Інактивація клітин з багатьма мішенями

Крім одно- і багатоударних мішеней існують складніші структури, від влучання в які залежить інактивація клітини. Існують багатомішенні моделі, для інактивації яких потрібно влучання не в одну мішень, а в кілька, число яких позначимо як n. При цьому кожна з цих мішеней може бути як одно- так і багатоударною. Біологічний зміст багатомішенності можна проілюструвати поліплоїдністю клітин (наявністю в клітині кількох геномів). Тест-реакція згідно з моделлю багатомішенності проявляється за умов відповідного числа влучань у кожну з n мішеней. У випадку одноударності кожної з мішеней для інактивації клітини має здійснитися по одному акту влучань у кожну з n мішеней. У цьому випадку частота інактивацій клітин характеризується таким рівнянням: N/N₀ = 1 - (1 - e -^vD)ⁿ

За високих значень доз це рівняння набуває такого вигляду:

N/N₀ = n e -^vD

Прологарифмувавши вираз, дістанемо: Ln (N/N₀) = ln (n - vD)

З цього рівняння слідує, що у напівлогарифмічному масштабі екстраполяція прямолінійної частини кривої доза-ефект перетинає вісь ординат у точці, значення якої рівне числу мішеней. Точка перетину експоненціальної ділянки дозової кривої з віссю абсцис позначає квазіпорогову дозу D_q - параметр, що характеризує розмір “плеча” кривої. Оскільки опромінення в дозах, що належать до “плеча”, не зменшує виживання клітин, то в цих дозах N/N₀ = 1. Звідси слідує: ln 1 = ln n - v D_q

ln n = v D_q

D_q = ln n/v

Але v = 1/D₀ , тому: D_q = D₀ ln n

Значення D_q пов'язане з D₀ та з числом мішеней. Число мішеней можна обчислити за такою формулою:

n = e^DqDo

Для щільноіонізуючого випромінювання влучання в мішень може супроводжуватися кількома актами передавання енергії в межах мішені, і тому у випадку опромінення нейтронами крива доза-ефект не має “плеча”. Збільшення ЛПЕ внаслідок опромінення супроводжується перетворенням кривої з “плечем” на просту експоненту. Наявність “плеча” в кривій дозової залежності виживання може пояснюватися не тільки багатоударністю або багатомішенністю клітин, а й іншими причинами. Так, якщо за не дуже високих доз опромінення клітина здатна ліквідовувати наслідки первинних ушкоджень мішені, то на дозовій кривій виживання з'являється “плече”. За умови відновлення клітин від ураження внаслідок опромінення в малих дозах, коли кількість молекулярних ушкоджень незначна, виживання може зберігатися на рівні неопромінених клітин до такої межі дози, за якої буде вичерпана здатність клітини усувати ушкодження. У випадку подальшого зростання дози, відновлення клітин від ушкоджень уже не впливає на форму кривої доза-ефект і ця крива перетворюється на чисту експоненту. “Плече” на кривій доза-ефект відображає відновлення клітин від ушкоджень, і доза D_q і екстраполяційне число кількісно характеризують інтенсивність процесу післярадіаційного відновлення. Процес відновлення клітинних унікальних структур від радіаційних ушкоджень називають репарацією.

Таким чином, параметри D_q і екстраполяційне число мають подвійне тлумачення: з одного боку вони відображають ударність мішені або кількість мішеней, в які необхідно передати енергію, щоб інактивувати клітину, а з іншого - трактуються як кількісна характеристика репарації. Ідентифікація природи “плеча” на кривій дозової залежності виживання клітин вимагає спеціальних досліджень, пов'язаних із з'ясуванням структури геному, а також із з'ясуванням механізмів репарації. Отже, як кількісну міру радіостійкості слід використовувати значення D₀ на експоненціальній частині кривої дозової залежності. Репараційні процеси підвищують виживання лише на обмеженому інтервалі доз опромінення.

Лінійно-квадратична функція виживання клітин

Молекулярно-біологічні механізми репарації клітини, відновлення її від радіаційних ушкоджень, є визначальними в розкритті природи радіостійкості клітин. Чисельними експериментальними даними підтверджено, що критичною подією в клітині, яка спричинює її проліферативну загибель, є утворення двониткового розриву ДНК. Дійсно, однониткові розриви ДНК ефективніше відновлюються і тому відіграють менш вагому роль у загибелі клітини.

Теоретично двониткові розриви ДНК виникають за двома механізмами:

1) під час проходження однієї зарядженої частинки або гамма-фотона крізь структуру молекули ДНК (тоді в одному треці відбуваються розриви у двох опозитних нуклеотидах);

2) внаслідок зближеного розташування нуклеотидів, ушкоджених у двох треках.

Число двониткових розривів у першому випадку має бути прямо пропорційним значенню поглинутої дози - a D, в другому випадку, за законами статистики - квадрату дози - bD² (a і b - коефіцієнти, що характеризують імовірність формування подвійного розриву ДНК).

Середнє число n подвійних розривів ДНК (ПР) у випадку опромінення в дозі D становитиме:

n = aD + bD²

Беручи до уваги те, що влучання в мішень під час опромінення популяції клітин підлягають розподілу, визначимо імовірність Р проліферативної загибелі, яка залежить від числа подвійних розривів у ДНК:

P = N/N₀ = exp [- (aD + bD²)]

У напівлогарифмічному масштабі дозова крива, яка описується цим рівнянням, не є прямолінійною і називається лінійно-квадратичною. Хоча криві виживання в цьому випадку відрізняються від експонент, проте в їхній основі лежать уявлення теорії мішені.

Цитоскелет як мішень у випадку дії іонізуючого випромінювання

У будь-якій еукаріотичній клітині виявляються надмолекулярні структури білкової природи, що утворюють мережу з упорядкованих паличкоподібних елементів - мікротрубочок. Систему мікротрубочок називають цитоскелетом. Цитоскелет - це доволі динамічна структура, яка виконує низку функцій у клітині, а саме: під час поділу утворює систему, яка бере участь у розподілі хромосом між дочірніми клітинами; впорядковує рух цитоплазми; підтримує форму клітини, тощо. У еукаріот цитоскелет є і в цитоплазмі і в ядрі, де він утворює ядерний матрикс, до якого в інтерфазі приєднуються петлі хроматину. Залежно від взаємодії ядерного матриксу і хроматину здійснюються процеси транскрипції. Реанжирування цитоскелет здійснює самоскладанням спеціальних білкових молекул б- і в-тубулінів. Полімеризація і деполімеризація (руйнування) тубулінів забезпечують підтримання динамічної структурної рівноваги цитоскелету. За загальним об'ємом цитоскелет становить досить вагому структуру клітини, тому в разі опромінення іонізуючою радіацією імовірність влучань може бути великою. Проте цитоскелет не є унікальною структурою клітини, бо його складові субодиниці синтезуються і у випадку безперервного впливу радіації на цитоскелет “вмикається” механізм відновлення цієї системи клітини - синтез субодиниць та їх самоскладання в цитоскелеті, що активно фунціонує. Проте за високих доз опромінення диференційованих клітин їх дезактивація може стати наслідком ушкодження цитоскелету, який у цьому випадку виконує роль мішені.

СТРУКТУРНО-МЕТАБОЛІТИЧНА ТЕОРІЯ

На ранніх етапах становлення радіобіології, коли ще не набули розвитку ні молекулярна біологія, ні цитогенетика, застосування концепцій теорії мішені для з'ясування можливих механізмів радіобіологічних ефектів зумовило формування таких уявлень, які значно випереджали відкриття, зроблені в наступні роки. Це стосується головної доктрини сучасної молекулярної біології про унікальність ДНК та про репарацію її від молекулярних ушкоджень. Евристичні потенції теорії мішені надавали їй беззаперечної ваги як методу досліджень. Водночас із розвитком теорії мішені тривали радіобіологічні дослідження, які базувалися на суто експериментальних підходах у розкритті ушкоджень хромосомного апарату клітини та фізіологічних змін, які супроводжують опромінення організму. Формалізовані концепції теоретичної радіобіології певною мірою є самодостатніми і тому не завжди спонукають до розкриття предметної сутності процесів, які відбуваються в клітинах, тканинах, організмах, що зазнають опромінення. У формалізованих концепціях обмежуються думкою про те, що у формуванні відповіді організму на опромінення має місце інтеграція стохастичних поклітинних ефектів у дискретному прояві окремих ушкоджень до рівня променевої реакції детерміністичного характеру радіаційного синдрому в усій різноманітності його проявів. Конкретизація механізмів формування радіаційного синдрому в молекулярно-біологічних, біохімічних та фізіологічних дослідженнях процесів, причетних до реалізації початкових ушкоджень клітини, свого часу відбувалися незалежно від теорії мішені, і це започаткувало розробку альтернативних концепцій радіобіології. Радіобіолог Кузін О. М. створив теорію, яка отримала назву структурно-метаболітичної теорії. В основу цієї теорії покладено принцип багатофакторності як головної причини формування радіобіологічних ефектів. Принципом багатофакторності заперечується унітарний підхід, згідно з яким визначальним у формуванні радіобіологічного ефекту є один механізм - ураження мішені. Влучання в мішень структурно-метаболітична теорія пояснює як фізичний процес індукції різноманітних початкових молекулярних ушкоджень не тільки унікальних структур - неампліфікованих генів, а й масових структур клітини - мембран, білкових молекул, вітамінів, різних кофакторів, речовин фенольної групи та ін. Внаслідок ушкодження масових структур порушуються метаболітичні процеси, що спричинює появу аномальних метаболітів - низькомолекулярних сполук, які виявляють біологічну активність. Такі аномальні метаболіти називаються радіотоксинами. Появу радіотоксинів реєструють невдовзі після опромінення. Серед радіотоксинів особливою активністю характеризуються фенольні сполуки. Саме радіометричними властивостями радіотоксинів структурно-метаболітична теорія пояснює результати дослідів із парабіонтами - тваринами, у яких об'єднані кола кровообігу. У випадку опромінення одного з парабіонтів ознаки променевої хвороби спостерігаються і у іншого - неопроміненого парабіонта.

У структурно-метаболітичній теорії значну роль відведено антиоксидантам, хімічним агентам, які впливають на функціонування репаративних ферментів, низькомолекулярним пептидам, причетним до функціонування інгібіторів та індукторів транскрипції геному. Важливого значення ця теорія надає тригерним механізмам, які є регуляторами експресії окремих генів і підтримують гомеостаз метаболітичних процесів у клітинах. Тому у формуванні радіобіологічних ефектів мають брати участь циклічні нуклеотиди цАМФ і цГМФ.

Одне з основних положень структурно-метаболітичної теорії полягає в тому, що розвиток радіобіологічного ефекту відображає спільний вплив розладу метаболічних процесів, ушкоджень біоенергетичних систем, мембран та розладу систем клітинної регуляції. Імовірнісний характер радіобіологічних ефектів структурно-метаболітична теорія пов'язує не з імовірністю влучання в певні ультраструктури клітини, а з імовірністю різних нетипових для норми взаємодій у деформованій мережі метаболітичних процесів опроміненої клітини. Під час досліджень розвитку радіобіологічних реакцій клітин і багатоклітинних організмів окреслюються аспекти, які свідчать про певну адекватність тих або інших концепцій теоретичниї радіобіології в їх несуперечній доповнюваності. Ця несуперечність пов'язана з багатоетапністю розвитку променевого ураження клітини.

Променеве ураження клітини є складним інтегрованим процесом, який має низку етапів. Початковий етап - це первинні ефекти взаємодії випромінювань з окремими молекулами речовин, що входять до складу ультраструктур клітини. Подальші етапи охоплюють радіаційно-хімічні зміни структури молекул, а також індуковані цими змінами порушення окремих метаболітичних і регуляторних функцій, і нарешті, формування кінцевого радіобіологічного ефекту. На першому етапі реалізуються принципи теорії мішені, на наступних етапах - принципи структурно-метаболітичної теорії.

РАДІОЛІЗ

Перетворення молекул внаслідок опромінення

Радіоліз - це хімічні перетворення молекул речовин під впливом іонізуючого випромінювання. Розпочинається радіоліз під час збудження або іонізації молекул у треці заряджених частинок чи д-електронів, що виникають на шляху високоенергетичних фотонів. Подальші перетворення іонізованих і збуджених молекул істотно залежать від хімічних властивостей речовин, їхнього агрегатного стану, наявності інших сполук у середовищі, наявності і концентрації кисню, рН середовища, концентрації речовин, типу розчинника, температури і т.д.

Нестабільні хімічні форми, які виникають внаслідок взаємодії молекул і атомів з іонізуючим випромінюванням, зазнають хімічних перетворень, що можуть супроводжуватись появою нових нестабільних форм. Останні зазнають подальших перетворень і цей процес триватиме доти, доки не з'являться стабільні сполуки. Така багатостадійність індукованих опроміненням хімічних процесів дає підстави виділяти продукти радіолізу першого, другого і наступних поколінь. Щоб утворилися стабільні молекули, мають відбутися перебудови електронних конфігурацій або в самих іонізованих і збуджених молекулах, або внаслідок їх взаємодій між собою та з іншими молекулами. Реакції, які відбуваються з моменту появи первинних активних форм до утворення кінцевих стабільних молекул, називається процесом перенесення енергії внаслідок прямої дії іонізуючого випромінювання. Перенесення енергії здійснюється в реакціях кількох типів:

1) міграції низькомолекулярних вільних радикалів;

2) внутрішньомолекулярної та міжмолекулярної міграції енергії збудження;

3) термолюмінесценції - висвічування збудженими молекулами фотонів видимого діапазону.

Виділяють такі механізми перетворень нестабільних хімічних форм, що з'являються в первинних процесах радіолізу:

1) Реакції приєднання водню до вільнорадикальних сайтів опромінених молекул, які зазнали відщеплення NH₂ або невеликих фрагментів молекули:

R- NH₂ + hн > R* + NH₂* > ( + H*) > R-H

2) Реакції відщеплення водню з утворенням вільного радикала:

R-H + H* > R* + H₂

R-H + OH* > R* + H₂O

3) Дисоціація молекули:

R- NH₃⁺ + е_aq^- > R* + NH₃

R- NH₂ + H* > R* + NH₃

4) Реакція приєднання:

R-CH=CH-R + OH* + H* > R-CH₂-CHOH-R

5) Реакція димеризації:

R₁* + R₂* > R₁-R₂

R* + R* > R-R

6) Реакції диспропорціонування:

R* + R* > R-Н + Р

Де Р - стабільний продукт

7) Реакції приєднання кисню:

H* + О₂ > НО₂* > Н⁺ + О₂^-*

R* + О₂ > RО₂* > R-О-О-Н

R* + НО₂* > R-О-О-Н

8) Реакції перенесення водню:

R₁* + R₂-Н > R₁-Н + R₂*

9) Молекули, збуджені внаслідок взаємодії з випромінюванням (М^*), зазнають таких перетворень, даючи продукти першого покоління радіолізу:

М^* > R₁ + R₂ (дисоціація молекули)

М^* > М + Е_t (теплова дезактивація)

М^* > М + Е_hн (висвічування фотонів світла)

М^* + М > М-Н + М* (відщеплення водню)

М^* + М > М + М⁺ + е^- (відщеплення електрона)

М^* + М₂ > М + М₂^* (перенесення енергії)

М^* + М > М-М (сполучення)

Іонізовані молекули (М⁺) зазнають перетворень:

М⁺ > R₁⁺ + R₂ (дисоціація молекули)

Електрон може взаємодіяти з молекулами за такими механізмами:

е^- + М > М^- > R₁^- + R₂ (приєднання електрона з наступною дисоціацією)

е^- + М⁺ > М (нейтралізація)

е^- + О₂ > О₂^- (приєднання кисню)

Продукти другого покоління радіолізу зазнають таких перетворень:

R + М > R-Н + М (перенесення водню)

R + М > R-М (об'єднання продуктів перетворення)

R₁ + R₂-Н > R₁-Н + R₂ (перенесення водню)

R + е^- > R^- (приєднання електрона)

R₁ + R₂ > R₁-R₂ (сполучення)

R₁ + R₂ ^-> R₁^- + R₂ (перенесення електрона)

R₁ + R₂ ^-> R₁-R₂^- (сполучення)

R + О₂ > RОО* (приєднання кисню)

R⁺ + М^- > R + М (нейтралізація)

R^- + М > R + М^- (перенесення електрона)

R^- + М > R-М^- (сполучення)

R⁺ + М > R-Н⁺ + М_ox (перенесення водню)

R⁺ + R > R-R⁺ (сполучення)

R⁺ + е^- > R (нейтралізація)

Іонізовані атоми і молекули і їхні вільнорадикальні стани

У випадку зіткнення заряджених частинок з електроном енергія, що використовується на іонізацію, передається за механізмом, який називають ударною іонізацією. Імовірність її характеризується значенням ефективного перерізу ударної іонізації. Якщо енергія, яка передається частинкам, котрі зазнають іонізації, достатньо велика, то поряд із однозарядними йонами можуть виникати багатозарядні. Зворотним процесом до іонізації є процес рекомбінації, за якої з іонів і електронів виникають нейтральні атоми і молекули.

Ідентифікацію вільнорадикальних станів молекул здійснюють методом радіоспектрометрії електронного парамагнітного резонансу (ЕПР). Оскільки вільні радикали мають поодинокі електрони з неспареним спіном, енергетичні рівні останніх розщеплюються в магнітному полі, що дає змогу застосовувати спектроскопію в сантиметровому радіодіапазоні. Різниця енергій між підрівнями, на які розщеплюються основний енергетичний рівень у постійному магнітному полі, залежить від міжатомних взаємодій у вільному радикалі, а також від міжмолекулярних зв'язків. Тому методами ЕПР можна досліджувати локалізацію неспареного електрона у вільних радикалах. Переважно тривалість життя вільних радикалів, що утворюються внаслідок опромінення, дуже коротка. Застосовують спеціальні прилади, які дають змогу реєструвати не тільки природу радикалів, а й кінетику їх перетворень. Для вповільнення розпаду вільних радикалів часто використовують низькі температури. У деяких випадках поява вільних радикалів у хімічному середовищі ініціює полімеризацію певних мономерів. Цю обставину використовують у методі так званої прищепної полімеризації, коли в біологічний об'єкт або в хімічні розчини додають відповідні розчинні мономери з міченими атомами, і після опромінення оцінюють кількість мічених мономерів, які ввійшли до складу нерозчинного полімеру. Деякі з вільних радикалів мають такі оптичні властивості, що їх можна ідентифікувати спектральними методами.

Стан речовини в клітинах

Стан речовини в клітинах і в простих розчинах істотно відрізняються. Наявність значної кількості макромолекул полісахаридів, нуклеїнових кислот і білків, які мають гідрофільні і гідрофобні групи є передумовою кластеризації води - впорядкування структури так званої зв'язаної води. Мембрани з їхньою складною ліпідно-білковою основою забезпечують компартментальний, камерний спосіб розмежування клітинного простору. Ці особливості структурної організації цитоплазми і ядра урізноманітнюють стан будь-якої речовини в клітині. Доля первинних йонів і вільних радикалів, що виникають внаслідок опромінення, залежить від особливостей фізико-хімічних станів речовин. Зокрема, на перетворення первинних продуктів радіолізу може впливати наявність міжмолекулярних асоціантів, бо в деяких із них може відбуватися міграція електрон-збуджених станів на значні відстані, і при цьому має місце теплова дисипація енергії. Кластеризація води, прилеглої до білкових молекул, змінює умови дифузії розчинених молекул малої маси, а також катіонів і аніонів. В структурованій воді дифузні пробіги молекул зменшуються. Очевидно, під час досліджень радіаційно-хімічних процесів у живій клітині слід враховувати відмінність фізико-хімічних умов у клітинному просторі і у звичайних розчинах. До цього ж додається специфіка радіаційно-хімічних реакцій у мембранах, будова яких зумовлюється існуванням двох орієнтованих шарів ліпідів, що взаємодіють з білковими молекулами і кластеризованою водою. У ліпідних шарах елементарної мембрани радіаційно-хімічні реакції здійснюються нібито у не в тривимірному просторі (об'ємі), а в двовимірному. Це теж впливає на кінетику реакцій. Близькими до істинних розчинів у клітинному просторі є лише вакуолі рослинних клітин.

Таким чином, у живій клітині можна виділити такі стани речовини:

1) молекули одного типу в агрегованій формі;

2) молекули у водному середовищі за наявності інших молекул у високих концентраціях;

3) молекули в неводних розчинах;

4) молекули, адсорбовані на поверхні органел;

5) комплекси з молекулами іншого типу;

6) молекули, що перебувають у різних, відокремлених один від одної, частинах клітини (компартментація);

7) молекули у водних розчинах.

Кількісна оцінка радіаційно-хімічних реакцій

Основною кількісною характеристикою радіаційно-хімічних реакцій є вихід продуктів реакцій (G) на одиницю поглинутої дози, тобто число молекул, що виникли внаслідок перетворень речовин по ходу радіаційно-хімічних реакцій на 100 еВ поглинутої енергії випромінювання.

G = M/E

Де М - кількість змінених молекул

Е - поглинута енергія випромінювання.

Іншою характеристикою радіаційно-хімічних реакцій є йонний вихід (І).

I = M/N

Де N - число іонізацій.

Оскільки на акт іонізації витрачається енергія 32,5 еВ, то G_max не може перевищувати 3, бо 100 еВ/32,5 еВ ? 3. У системі СІ ця величина визначається як число молекул реакції на дозу 1 Гр. При символі G у вигляді індексу вказують продукти відповідної радіаційно-хімічної реакції. Наприклад, для продуктів радіолізу води обчислюють виходи реакцій G_H, G_e.aq, G_OH і т.д.

Величина G_x не є сталою, бо її значення залежить від дози опромінення і концентрації речовини, перетворення якої в радіаційно-хімічній реакції дає відповідний продукт х. Зі збільшенням дози опромінення, як правило, зростає і кількість перетворених молекул. Залежність виходу реакції від дози описується експоненціальними функціями. Характеристики цих експонент дають змогу кількісно описувати ефективність радіаційно-хімічних реакцій і визначити поперечний переріз реакції (у) - коефіцієнт при показнику експоненціальної функції. Якщо кількість перетворених молекул у радіаційно-хімічній реакції позначити як N, то:

N/N₀ = e^-уD

Де N₀ - початкова кількість молекул

D - доза опромінення

у - поперечний переріз реакції.

Є прямий зв'язок між значеннями G_x I у.

Радіаційно-хімічні перетворення води

Основну маси клітини становить вода, тому імовірність влучання іонізуючого випромінювання в молекули води є високою. Відповідно, значну роль у радіаційно-хімічних перетвореннях речовин у живій клітині при опроміненні відіграють продукти радіолізу води.

Внаслідок дії іонізуючого випромінювання на чисту нейтральну воду утворюються нестабільні продукти радіолізу, які зазнають подальших перетворень, формуючи різні активні хімічні форми.

Первинними продуктами взаємодії випромінювання і води є іонізовані або збуджені молекули:

H₂O + hн > H₂O⁺ + e^-

H₂O + hн > H₂O^*

Де hн - квант випромінювання.

Далі ці форми молекули води зазнають таких перетворень:

H₂O⁺ > Н⁺ + ОН*

H₂O^* > ОН* + Н*

Електрон, що піддається гідратації, стає гідратованим електроном:

е^-_aq

Йон H₂O⁺ може вступати в іонно-молекулярну реакцію:

H₂O⁺ + H₂O > H₃O⁺ + ОН*

Гідратований електрон може захоплювати молекулу води:

H₂O + е^-_aq > Н* + ОН^-

Між радикалами може відбуватися реакція:

Н* + Н* > Н₂

ОН* + ОН* > H₂O₂

Якщо в середовищі є кисень, то реакції радіолізу ускладнюються:

е^-_aq + O₂ > O₂^-*

Н* + O₂ > НO₂*

ОН^- + НO₂* > Н₂О + O₂^-*

При наявності в середовищі карбоксильних груп:

ОН* + НСОО^- > СО₂^-* + Н₂О

СО₂^-* + O₂ > СО₂ + O₂^-*

Найвищою реакційною здатністю характеризуються радикали: е^-_aq , Н*, ОН*.

Гідратований електрон оточений чотирма молекулами води, орієнтованими згідно їхньої дипольної природи. Гідратований електрон є ефективним відновником. Гідроксильний радикал є ефективним окисником. Радикал водню є відновником. Гідроперекисні радикали поводять себе або як окисники, і тоді в середовищі з'являється перекис водню, або як відновники, що супроводжується утворенням кисню. Ці радикали зазнають рекомбінації:

2 НО₂* > H₂O₂ + O₂

НО₂* + O₂^- + Н⁺ > H₂O + O₂

Перекис водню є одним із первинних продуктів радіолізу води. Роль перекису водню в радіаційно-хімічних перетвореннях речовин не вважається дуже важливою за малих доз опромінення, бо порівняно з іншими продуктами радіолізу (ОН*, Н*, е^-_aq ) ця сполука менш активна. Але за високих доз опромінення, коли концентрація перекису водню досягає істотних значень, його роль у перетвореннях речовин в опроміненому середовищі зростає.

Закон Дейла

Фундаментальні радіобіологічні ефекти важко пояснити з позицій існуючих уявлень про механізми первинних радіаційно-хімічних реакцій. До таких ефектів належать:

1) наявність максимуму в кривій залежності ВБЕ від ЛПЕ в області 1 ев/нм;

2) висока радіочутливість деяких видів організмів, які гинуть при опроміненні в малих дозах (одиниці грей);

3) ефективність деяких радіопротекторів, що розглядаються як перехоплювачі вільнорадикальних станів.

Тому потрібні були нові підходи до дослідження радіологічних явищ. Було зроблено припущення про те, що в первинній біологічній дії іонізуючого випромінювання значну роль може відігравати різке підвищення концентрації водневих йонів у треках заряджених частинок. Показано, що в треках б-частинок, протонів віддачі і важких прискорених ядер початкова концентрація йону Н⁺ досягає значення 10^-2 моль. Таке істотне підвищення локальної концентрації йону Н⁺ на кілька порядків досягає межі, при якій може відбуватися денатурація біологічних макромолекул. Час існування підвищеної внутрішньотрекової концентрації йонів Н⁺ залежить від швидкості дифузії цього йону у об'ємі розчину та швидкості реакцій рекомбінацій йону Н⁺ з гідратованим електроном. Радіаційно-хімічний вихід реакцій для розчинених речовин залежить від їх концентрації. Із збільшенням концентрації речовини G зростає і досягає плато, що відповідає широкому діапазону високих концентрацій. Цю залежність виходу радіаційно-хімічних реакцій від концентрації речовин було вперше описано В. Дейлом, що назвав її ефектом розведення або як зараз називають законом Дейла.

У розбавлених розчинах концентрації ОН*, Н*, е^-_aq вищі за концентрацію розчиненої речовини, а тому лише частина продуктів радіолізу води може реагувати з її молекулами. Якщо ж концентрація речовини зростає, то відповідно збільшується частота взаємодій її молекул з продуктами радіолізу води. За певних значень концентрації речовини цей процес досягає свого насичення.

Радіаційно-хімічні ушкодження ДНК

Ушкодження ДНК можуть бути:

1) пов'язані з розривом у каркасі молекул - розрив глікозильного зв'язку - між першим вуглецевим атомом пентози та першим атомом азоту піримідину або дев'ятим атомом азоту пурину;

2) пов'язані з перетворенням азотистих основ, що може приводити до локальних порушень подвійної спіралі.

Якщо в середовищі є кисень, то вихід продуктів радіолізу всіх видів становить 1-2 ушкоджені основи на 100 еВ поглинутої енергії випромінювання. Половина продуктів радіолізу є гідропероксидами. Вільні основи і продукти їх радіолізу відокремлюються від полінуклеотидного ланцюга у вигляді дрібних фрагментів, частково модифіковані основи лишаються в макромолекулі.

Внаслідок опромінення В-конформація ДНК може перетворитися у Z-конформацію.

Транскрипційно активні послідовності ДНК у 6 разів чутливіші до дії опромінення порівняно з транскрипційно неактивними. Тому вихід ушкоджень ДНК при опроміненні залежить від стану хроматину.

Під час опромінення може відбуватися міграція заряду в молекулі ДНК. Справа в тому, що ДНК виявляє напівпровідникові властивості. Опромінення іонізуючою радіацією індукує електропровідність ДНК. Заряд переноситься у формі негідратованого електрона або протона.

Внаслідок опромінення можуть відбуватися транзиції і трансверсії. Радіаційно-хімічні перетворення азотистих основ ДНК можуть супроводжуватись змінами характеру спарювання опозитних основ. Так, одна пуринова основа може замінитись іншою пуриновою або ж одна піримідинова основа іншою піримідиновою. Така заміна пурину пурином чи піримідину піримідином називається транзицією. Якщо пуринова основа заміняється піримідиновою, то відбувається зміна орієнтації пари пурин-піримідин. Цей тип заміни називається трансверсією.

Однониткові розриви ДНК

Існування ланцюга ДНК обумовлюється цілісністю міжвуглецевих зв'язків С₃^/-С₄^/-С₅^/ і фосфодіефірних С₃^/-ОРО-С₅^/. Внаслідок радіаційно-хімічних реакцій розриваються цукро-фосфатні зв'язки і у молекулі з'являються однониткові розриви. Як правило, розриви ДНК є наслідком атакування зазначених зв'язків радикалами, які виникають під час радіолізу води.

Найімовірнішими варіантами розриву є:

- розрив фосфоефірного зв'язку з утворенням 3^/-ОН і 5^/-РО₄ кінців;

- розрив фосфоефірного зв'язку з утворенням 3^/-РО₄ і 5^/- ОН кінців;

- розрив фосфоефірних зв'язків з відщепленням аніону ортофосфату і утворенням 3^/- ОН і 5^/- ОН кінців;

- розрив міжвуглецевого зв'язку відщепленням малонового альдегіду і основи, утворення 5^/-РО₄ і 3^/-алкілфосфатних кінців;

- розриви двох фосфоефірних зв'язків із відщепленням нуклеозиду і утворенням 5^/-РО₄ і 3^/-РО₄ кінців;

- розриви двох фосфоефірних зв'язків із відщепленням нуклеозиду і утворенням 5^/-РО₄ і 3^/-ОН кінців.

Двониткові розриви ДНК

Із виникненням двониткових розривів пов'язана найбільша небезпека для клітини. Двониткові розриви з'являються як результат нагромадження однониткових розривів у опозитних нитках подвійної спіралі, коли зростає імовірність появи дуже зближених між собою пар однониткових розривів у обох нитках. За таких умов формування двониткових розривів слід було б очікувати, що вихід їх мав би бути пропорційний квадрату дози. Проте така залежність спостерігається не завжди. Часом вихід двониткових розривів залежить від D^1,2. Це зумовлено тим, що дуже чутливими до дії продуктів радіолізу води є основи ДНК, і їх ушкодження можуть спричинити розриви молекули ДНК. Отже, двониткові розриви в подвійній спіралі ДНК формуються внаслідок появи однониткових розривів у зонах опозитних нуклеотидів. Це може статися в двох випадках: 1) однониткові розриви індукуються вздовж одного треку; 2) появи зближених однониткових розривів від двох треків. Відповідно говорять про одно- та двотрекові дволанцюгові розриви ДНК. Розпад подвійної спіралі ДНК є наслідком денатурації сегмента ДНК між розривами в опозитних нитках. Визначено, що двонитковий розрив з'являється тоді, коли на відстані до 4 нм локалізується від двох до п'яти іонізацій. Під час моделювання структури треку розглядаються кластери відкладення енергії. Важливе значення при цьому надається множинним місцям ушкоджень, що виникають в ДНК внаслідок дії іонізуючого випромінювання. Це поняття базується на уявленнях радіаційної хімії і особливостях просторового розподілу вільних радикалів у найперші моменти після опромінення. Кластерова природа ушкоджень ДНК ускладнює репарацію.