Тест-системи у діагностиці інфекційних захворювань. Види тест систем

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний університет харчових технологій

Кафедра біотехнологій та мікробіології

САМОСТІЙНА РОБОТА

з дисципліни «Основи імунології»

на тему: Тест-системи у діагностиці інфекційних захворювань. Види тест систем

Кислий Владислав

Київ - 2018

ЗМІСТ

РЕФЕРАТ

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ

ВСТУП

РОЗДІЛ 1. ТЕСТ-СИСТЕМИ В ДІАГНОСТИЦІ ІНФЕКЦІЙНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ

1.1 Експрес-діагностика інфекційних захворювань

1.2 Технологія отримання експрес-тестів

РОЗДІЛ 2. ВИДИ ТЕСТ-СИСТЕМ

РОЗДІЛ 3. ЧУТЛИВІСТЬ, СПЕЦИФІЧНІСТЬ, ДІАГНОСТИЧНА ЕФЕКТИВНІСТЬ ТЕСТ-СИСТЕМ ІМУНОАНАЛІЗІВ

3.1 Чутливість імуноаналізів

3.2 Специфічність імуноаналізів

3.3 Діагностична ефективність тестсистем

ВИСНОВКИ

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖРЕЛ



РЕФЕРАТ

Курсова робота присвячена вивченню та аналізу тест-систем у діагностиці інфекційних захворювань. Розгляду видів тест-систем та їх використання.

Курсова робота складається з вступу, трьох розділів, 5 формул та списку використаної літератури з 18 найменувань. Загальний обсяг роботи - 31 сторінка. діагностика інфекційний експрес тест

Ключові слова: інфекційні захворювання, лабораторна діагностика, тест-система.



ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ

ВІЛ - вірус імунодефіциту людини

ГРВІ - гостра респіраторна вірусна інфекція

ІА - індекс авідності

ІКБ - іксодового кліщового бореліозу

ІФА - імуноферментний аналіз

іХМП - імунодіагностичних холерних мікроплівок

НПЗ - негативна передбачувальна значимість

ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція

ППЗ - позитивна передбачувальна значимість

РІФ - імунофлюоресцентний метод

СМР - спинномозкова рідина

ЦМВІ - цитомегаловірусна інфекція

ЦНС - центральна нервова система



ВСТУП

Розширення можливостей у лікуванні і профілактиці вірусних хвороб з використанням противірусних препаратів, імуномодуляторів і вакцин з різним механізмом дії потребує швидкої і точної лабораторної діагностики. Вузька специфічність деяких противірусних препаратів також вимагає швидкої і високоспецифічної діагностики інфікуючого агента.

З'явилася необхідність в кількісних методах визначення вірусів для моніторингу противірусної терапії.

Крім встановлення етіології захворювання лабораторна діагностика має важливе значення в організації протиепідемічних заходів.

Рання діагностика перших випадків епідемічних інфекцій, що дозволяє своєчасно провести протиепідемічні заходи - карантин, госпіталізацію, вакцинацію та ін.

Реалізація програм по ліквідації інфекційних захворювань, наприклад, натуральної віспи, показала, що по мірі їх виконання зростає роль лабораторної діагностики.

Головну роль грає лабораторна діагностика в службі крові та акушерській практиці, наприклад, виявлення донорів, інфікованих вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ), вірусом гепатиту В (HBV), діагностика краснухи, цитомегаловірусної інфекції у вагітних.

Тема тест-систем у діагностиці інфекційних захворювань дуже актуальна у наш час. Так як тест-системи дають можливість за короткий термін часу встановити наявність інфекції. Це надає можливість скорішого початку лікування хворого, дозволяє своєчасно провести протиепідемічні заходи. Дає можливість обстеження більшої кількості людей і вчасно провести профілактику інфекційних захворювань.



РОЗДІЛ 1. ТЕСТ-СИСТЕМИ В ДІАГНОСТИЦІ ІНФЕКЦІЙНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ

В останні роки у зв'язку з розробкою нових лабораторних технологій, появою на світовому ринку тест-систем принципово нового напрямку значно розширилися діагностичні можливості. Необхідність їх впровадження була продиктована насамперед зміною патогенів, появою нових збудників і посиленням агресії раніше відомих умовно-патогенних мікроорганізмів (бактерій, вірусів, грибів, паразитів), які під впливом антибіотиків та противірусних препаратів стали піддаватися генетичної мінливості [1].

В даний час нові діагностичні технології дозволяють виявити етіологічні та патогенетичні причини багатьох захворювань і докорінно вплинути на результати лікування. Мабуть, найбільш вражаючі результати впровадження цих технологій в клінічну практику досягнуті в області імунології та діагностики інфекційних захворювань [2].

Використання нових методів надає також можливість проводити імунологічний моніторинг і розробляти індивідуальну програму імунореабілітації пацієнтів, що є особливо цінним у разі формування хронічного інфекційно-запального процесу.

Для ефективного використання лабораторних тестів необхідна розробка диференціально-діагностичних програм, принцип побудови яких полягає в цілеспрямованому і поетапному обстеженні різних груп ризику з урахуванням епідеміологічної ситуації, клінічних форм і критеріїв тяжкості перебігу захворювання [1].

Тест-системи на основі імуноферментного і імунохемілюмінесцентного аналізу дозволяють виявити антитіла різних класів, що значно підвищує інформативність методів клінічної, аналітичної чутливості і специфічності для діагностики інфекційних захворювань. Слід зазначити, що найбільш значні успіхи в діагностиці інфекцій пов'язані з впровадженням у лабораторну практику методу полімеразної ланцюгової реакції, який вважається «золотим стандартом» в діагностиці та оцінці ефективності проведеного лікування ряду інфекційних захворювань.

Для дослідження може бути використаний різний біологічний матеріал: сироватка, плазма крові, зішкріб, біоптат, плевральна або спинномозкова рідина (СМР). В першу чергу, методи лабораторної діагностики інфекцій спрямовані на виявлення таких захворювань, як вірусний гепатит В, С, D, цитомегаловірусна інфекція, інфекції, що передаються статевим шляхом (гонорейна, хламідійна, мікоплазменної, уреаплазменна), туберкульоз, ВІЛ-інфекція та ін [2].

Раціональне використання тест-систем на основі запропонованих принципів на окремих етапах обстеження пацієнта дозволяє уникнути непотрібних багаторазових досліджень, оскільки використання комплексного підходу до діагностики і вибір високочутливих і специфічних тестів дозволяють оперативно встановити діагноз і активність процесу [1].

1.1 Експрес-діагностика інфекційних захворювань

Методи експрес-діагностики інфекційних захворювань до недавнього часу розвивалися головним чином на основі класичних схем мікробіологічного аналізу, який зводиться до виділення збудника чистої культури з подальшою її ідентифікацією по багатьом характерним властивостям. Багатоетапність цих аналізів обумовлює їх тривалість і практично виключає експресність, що задовольняє епідеміологічну та клінічну практику. тривалість мікробіологічного аналізу становить, як мінімум, кілька днів. Серологічні методи діагностики можуть тривати від декількох годин до 2-3 діб. Експрес-індикація знаходиться на передньому краї наукового пошуку нових методів виявлення мікробів -- простих, економічних, швидких, завдяки чому лабораторна служба вдосконалюється і ефективно використовується в практиці інфекційних хвороб. Основні вимоги, що пред'являються до експресних методів діагностики інфекційних захворювань, зводяться до наступного:

- отримання результатів аналізу в максимально короткі терміни (протягом декількох годин, ідеально - хвилин);

- можливість проведення і завершення аналізу без виділення шуканого мікроорганізму в чистій культурі, при використанні нативного матеріалу, у крайньому випадку - із залученням елективних біосред для швидкого накопичення збудників;

- безперечно, висока специфічність і висока чутливість як передумови належної достовірності аналізу;

- висока продуктивність, простота, доступність і відтворюваність аналізів [3].

Інфекційні захворювання часто характеризуються високою контагіозністю, ряд з них вимагає швидкого застосування етіотропної терапії. У той же час бактеріологічні дослідження традиційно відрізняються великою тривалістю, що ускладнює прийняття рішення про призначення антимікробних препаратів. В даний час з'явилися тести, що дозволяють дати відповідь про наявність інфекції буквально за лічені хвилини. Такі тести дозволяють розгорнути «лабораторію» прямо в кабінеті лікаря [4].

Найбільш бажаним є паралельне застосування двох-трьох експрес-методів. Такий підхід значно збільшує надійність одержуваного результату. До експрес-діагностики можна віднести методи мікроскопії - виявлення збудника в досліджуваному матеріалі (правець, сибірська виразка, менінгококова інфекція, малярія, амебіаз та ін). Результат отримують протягом 1 року після забору матеріалу. частіше використовують серологічні (імунологічні) реакції для виявлення збудника або антигену. Наприклад, реакція нейтралізації холерного вібріона дозволяє отримати позитивний результат вже через 6-8 год. Вдосконалена реакція, заснована на використанні в якості тест-системи імунодіагностичних холерних мікроплівок (іХМП), дозволяє побачити позитивну реакцію (зерна агглютината, пофарбовані в зелений колір) вже через 1-3 хв. Сучасні тест-системи для експрес-діагностики забезпечені специфічними антитілами до декількох видів мікроорганізмів. Наприклад, для експрес-діагностики хворих гнійним менінгітом проводиться слайд-реакція нейтралізації; використовувана тест-система забезпечена специфічними антитілами до менінгококу, пневмокока, стафілококу. Такі ж багатокомпонентні тест-системи використовують для постановки РІФ при обстеженні хворих на грип та інші ГРВІ. Водночас удосконалюються бактеріологічні методи, що дозволяють виявити зростання патогенних мікроорганізмів протягом 24 ч. експрес-діагностика відрізняється простотою і швидкістю проведення досліджень. Велике практичне значення мають тест-системи експрес-діагностики, які не потребують для проведення дослідження апаратури і багато часу. Вони побудовані по типу тест-смужок з візуальною оцінкою результату. На таку смужку досить нанести краплю досліджуваної плазми крові -- зміна кольору смужки або поява певного малюнка вказує на наявність в організмі хворого антигену збудника або антитіл до нього. Наприклад, за таким принципом створені тест-системи для виявлення гепатиту В (гепатит В гексагон), гепатиту С (іХА-анті-ВгС-ФАКТОР) та ін. Ці методи дослідження мають більше значення при гострих інфекційних захворюваннях, однак вони не завжди точно можуть підтвердити наявність інфекційної патології при хронічному перебігу, тобто при бактеріоносійстві, коли потрібне використання інших додаткових методів [3].

1.2 Технологія отримання експрес-тестів

Класичні імуноферментні тест-системи випускаються у вигляді готових до застосування комплектів з набором реагентів для проведення досліджень було потрібне додаткове лабораторне обладнання, кваліфікований персонал з навичками роботи, особливі умови режиму роботи лабораторії. Економічно доцільно проводити, особливо при скринінгу, дослідження великої кількості зразків сироваток - до 90 зразків на одному планшеті -імуносорбенті. Стриповані планшети дозволяють проводить дослідження на одному стрипі від 1 до 3 зразків сироваток, однак витрати часу та експлуатації обладнання, практично, однозначні і в лабораторіях, як правило, проводять попереднє накопичення сироваток (не менше 60 - 90 зразків), що безсумнівно впливає на якість досліджуваного матеріалу і час отримання результату аналізу ІФА.

Проведення обстеження одиничних зразків сироватки, плазми або цільної крові на одноразових експрес-тестах більш ефективно для отримання швидкої відповіді, яка часто буває необхідна для вирішення питання щодо тактики ведення хворого. Причому це важливо не тільки для лабораторій, в яких відсутнє спеціальне обладнання, електрика, ні навченого персоналу постановки імуноферментного аналізу та імуноблоту, або можуть бути відсутні умови для забору на аналіз та оброблення крові з ліктьової вени, для отримання зразків сироваток або плазми крові . Для надання швидкої та ефективної медичної допомоги хворому експрес-аналіз на ВІЛ має значні переваги перед класичним імуноферментним аналізом за часом, а також і тим, що аналіз може бути проведений відразу, біля ліжка хворого [5].

Сучасні експрес-тести являють собою набори хімічних реактивів у вигляді таблеток, гранул, порошків або містять реактиви смужок фільтрувального паперу, з допомогою яких можна визначити наявність різних хімічних компонентів в біологічних рідинах (так званий якісний тест) або приблизно оцінити їх кількісний вміст (так званий напівкількісний тест). Таблетки, гранули і порошки зазвичай призначені для визначення будь-якого одного компонента, тобто є монотестами. Паперові смужки, що містять реактиви, мають кілька індикаторних зон, тобто являють собою політести, що дозволяють отримати результати за п'ятьма і більше параметрами хімічного складу одночасно [6].

Експрес-тести поділяються на «швидкі» і «прості».

«Прості» тести передбачають отримання результатів аналізу протягом 40 - 60 хвилин. Ці тести відрізняються від наборів для класичного ІФА відсутністю необхідності застосування додаткового обладнання для промивки планшет і зчитування результатів аналізу. У наборах простих тестів передбачено все, що необхідно для роботи.

Швидкі тести передбачають отримання результатів аналізу протягом 15 - 20 хвилин.

Для виробництва експрес-тестів застосовуються найчастіше такі технології:

- метод імунохроматографії (латеральної дифузії);

- метод імунофільтрації-мембранні пристрої для концентрації імунного матеріалу (проточні);

- метод латекс-аглютинації;

- модифікований метод ІФА (імуно-дот) [5].

Експрес-методи, що проводяться за допомогою експрес-тестів, засновані на відомих з класичних методів аналізу хімічних реакціях, в яких взаємодія субстрату і реактиву супроводжується утворенням сполук з певним забарвленням. На таблетку або на індикаторну зону паперової смужки наносять досліджувану рідину (частіше смужку занурюють в рідину) і за часом появи забарвлення, за інтенсивністю кольору чи величиною пофарбованої зони судять про наявність або відсутність досліджуваного речовини. Порівняння інтенсивності забарвлення індикаторної зони з кольоровими паперовими стандартами дозволяє приблизно оцінити кількісний вміст визначуваного субстрату в рідині [6].

Для отримання простих тестів застосовується технологія отримання сорбованих антигенами ВІЛ латекс-частинок, які використовуються для методу аглютинації частинок при зв'язуванні зі специфічними антитілами або мембранний метод, при якому ВІЛ-антигени сорбований на спеціальній мембрані, де вони зв'язуються зі специфічними антитілами.

При використанні методу латекс-аглютинації або мембранного методу в якості досліджуваного матеріалу використовується тільки плазма або сироватка крові. Результат аналізу через 60 - 90 хвилин для латекс-аглютинації та через 40 - 60 хвилин для мембранного методу. Комплекти реагентів для проведення цих тестів повинні зберігатися тільки при певному температурному режимі (від 2 до 8 С) в холодильнику.

Дот-аналіз - для концентрації антигенів ВІЛ використовують твердофазний носій і імобілізацію антитіл до ВІЛ на пористій мембрані. Проба проходить через мембрану і адсорбується на набиванні. Деякі методи здатні диференціювати ВІЛ 1 від ВІЛ 2, завдяки розміщення відповідних антигенів на різних ділянках мембрани. Аналізи виконуються в кілька етапів шляхом додавання проби, промивання буферами і сигнальним реактивом. Використовуваний матеріал плазма або сироватка крові. Комплект повинен зберігатися при певному температурному режимі в холодильнику.

Гребневі методи імунних плям (так само відноситься до мембранного методу): використовують пластикову матрицю, забезпечену скріпленими один з одним «зубцями», на яких зафіксовано ВІЛ-антиген, призначений для «захоплення» відповідних антитіл. Досліджувані проби послідовно поміщаються в лунки, кожна з яких розташована навпроти одного із зубців. Такий пристрій дозволяє досліджувати проби партіями. Результати кожної проби реєструються у вигляді плями або точки на відповідному зубці. Тривалість постановки від 30 до 50 хвилин. Використовуваний матеріал плазма або сироватка крові, необхідні певні навички виконання аналізу та визначення результатів [5].

Перспективи розвитку експрес-методів лабораторної діагностики пов'язані з розробкою і подальшим вдосконаленням систем автоматизації лабораторних досліджень, створенням нових диференційованих експрес-тестів для якісного і кількісного аналізу біологічних матеріалів, а також з удосконаленням лабораторної техніки [6].

Основною технологією для отримання «швидких» тестів є імунохроматографія. Імунохроматографічні тести є пізнішої розробкою відповідають усім вимогам і найбільш широко використовуваними в світі для отримання одноразових експрес-тестів. Постановка тесту максимально спрощена, потрібно тільки внести досліджуваний матеріал у відповідну клітинку. Реакція протікає в один етап, так як імунохроматографічна мембрана (у вигляді смужки) містить антигени ВІЛ і відповідний кон'югат для взаємодії з досліджуваною сироваткою. Результат аналізу виявляється у вигляді забарвлених смуг або плям в областях контролю реакції. Антигени ВІЛ-1 і ВІЛ-2 наносяться на різні ділянки смужки, що дозволяє диференціювати антитіла до ВІЛ-1, ВІЛ-1 групи 0 та ВІЛ-2. Більшість швидких тестів, заснованих на імунохроматографії, не вимагають ніяких додаткових пристосувань і не потребують холодильника при зберіганні і транспортуванні. Результати тесту готові протягом 15 - 20 хвилин. Для постановки реакції можна обійтися малою кількістю досліджуваного матеріалу, досить однієї краплі крові з пальця.

Враховуючи потреби експрес-діагностики найбільш перспективними і ефективними є «швидкі» тести, що дозволяють провести аналіз протягом 15-20 хвилин. Реальна можливість проведення індивідуального експрес - аналізу на ВІЛ вимагає від цих тестів високої якості щодо чутливості і специфічності виявлення специфічних антитіл у досліджуваному матеріалі - сироватці, плазмі та цільній крові людини. Принаймні ці основні показники якості у експрес-тестів повинні бути не гірше, ніж у класичних імуноферментних тест-систем [5].



РОЗДІЛ 2. ВИДИ ТЕСТ-СИСТЕМ

Винахід відноситься до медицини та біології, а саме до молекулярної діагностики. Запропоновано діагностичну тест-систему на базі зондової мікроскопії. Сукупності детектуючих молекул мобілізують на підкладку, інкубують на підкладці досліджуваний зразок рідини і за допомогою атомно-силового мікроскопа виявляють реперні ізольовані комплекси молекул, що утворилися на підкладці при інкубації. Система має підвищену чутливість на рівні одиничних молекул і дозволяє одночасно визначати кілька захворювань [7].

Сучасні тест-системи базуються на численних модифікаціях ТІФА з використанням різноманітних схем проведення реакції та великого розмаїття кон'югатів[13].

Тест-системи для визначення антитіл класу IgА до токсоплазм. Позитивний результат тесту свідчить про наявність активного процесу при токсоплазмозі, дозволяє встановити підгострий перебіг і рецидив захворювання. Його можна ефективно використовувати для ранньої діагностики як вродженого, так і набутого токсоплазмозу. Крім того, показано його важливе значення при моніторингу перебігу інфекційного процесу. Негативний результат дослідження на наявність специфічних IgА в динаміці вказує на завершення активного процесу і ефективну терапію. Разом з тим, досвід роботи показав, що у разі тривалого виявлення, що має місце у осіб з вираженим імунодефіцитом і, як правило, при мікстінфекції (активно протікає цитомегаловірусної інфекції - ЦМВІ), слід пролонгувати імунореабілітацію пацієнтів із застосуванням препаратів рослинного і тваринного походження для обмеження переходу захворювання в хронічну форму і зниження рецидивів. Найбільш часто така ситуація виникає при очній формі токсоплазмозу [1].

Діагностична тест-система для виявлення вірусних захворювань відноситься до прикладної імунології в медичній вірусології, і може бути використано для діагностики гепатитів А, В, з інфекційних та онкологічних захворювань.

В якості пристроїв, за допомогою яких проводять діагностику, можуть бути використані зондові мікроскопи (атомно-силові, близькопільні, тунельні та ін.)

Відомий метод діагностики за допомогою оптичного біосенсора.

Він дозволяє в реальному масштабі часу з моніторингу зміни коефіцієнта заломлення простежити за кінетикою взаємодії, розрахувати константу рівноваги реакції антиген/антитіло без використання міток, менш тривалим терміном виконання аналізу (до декількох хвилин).

Проте він має ряд недоліків, а саме концентраційною межею чутливості, не перевищує 10-12 M, складно проводити контроль вкладу в сигнал оптичного біосенсора від неспецифічних взаємодій компонентів біологічної рідини [8].

Тест-системи для визначення низькоавідних IgG-антитіл в сироватці крові з розрахунком індексу авідності (ІА) дозволяють встановити первинну інфекцію (припустити термін інфікування), що надзвичайно важливо для вагітних жінок в плані вироблення тактики їх ведення. Постановка даного тесту цілком виправдана в тих випадках, коли не виявляють специфічні IgM. При ІА менше 40% можна припустити зараження протягом останніх 6 місяців, і порівняти цей показник з терміном вагітності. При інфікуванні протягом останніх 3-х місяців, що передують тестуванню, ІА визначається менше 40%. ІА від 40% до 60% відноситься до числа прикордонних і може свідчити про завершення гострого, або підгострого процесу. У пацієнтів з хронічним перебігом і у інфікованих в давні терміни ІА більш високий.

При моніторингу токсоплазмозу його повторне визначення недоцільно, оскільки він залишається досить високим і не дає лікарю додаткової інформації. Використання даного тесту для оцінки ефективності лікування так само навряд чи виправдано, оскільки в результаті проведеної протипаразитарної терапії (особливо при хронічному токсоплазмозі) в результаті викиду антигену і стимуляції імунної системи відбувається утворення низькоавідних антитіл, за рахунок чого спостерігається зниження ІА і підвищення вмісту специфічних антитіл. Нерідко лікарі неправильно інтерпретують цей результат і проводять повторні курси з призначенням протипаразитарних препаратів.

Використання комбінації тестів для визначення авідності IgG і IgА дозволяє у дітей і дорослих в найкоротший час (протягом 2-3 днів) завершити обстеження і встановити в осіб, серопозитивних по IgG, первинну інфекцію, підгострий перебіг або загострення хронічної інфекції [1].

Відомий спосіб імуноферментного аналізу (ІФА) для діагностики інфекційних захворювань.

Цей спосіб має ряд істотних недоліків, а саме: тривалість постановки аналізу (2-24 години) та відсутність жорсткого контролю якості тест-систем [9].

Метод імуноблота - нове покоління підтверджуючих тестів на інфекції. Являє собою індивідуальний оціночний шаблон і має можливість автоматизації дослідження. При ВІЛ-інфекції є основним діагностичним тестом. Дозволяє визначати антитіла до окремих антигенів збудника.

Крім того, даний тест, рекомендований при вірусному гепатиті С в якості підтверджує, вже довів наявність гіпердіагностики методом ІФА, а також дозволив виділити білки діагностичної і прогностичної значимості при моніторингу захворювання і оцінки ефективності лікування [1].

Відомий спосіб ланцюгової полімеразної реакції (ЛПР) для діагностики інфекційних захворювань [10].

Полімеразна ланцюгова реакція - експериментальний метод, що дозволяє домогтися значного збільшення малих концентрацій певних фрагментів ДНК в досліджуваній пробі [11].

До недоліків відомого способу відносять високу ймовірність контамінації досліджуваних зразків і громіздкість технології [10].

Нарівні з контролем захворюваності велике значення мають методи діагностики пріонних захворювань, що дозволяють здійснювати моніторинг епізоотичної ситуації серед населення і популяцій великої рогатої худоби. Очевидно, що тільки розвиток швидких методів діагностики збудників пріонних захворювань може відповідати поставленим завданням.

В основі методу ПЛР лежить природний процес - комплементарне добудовування ДНК матриці, здійснюване за допомогою ферменту ДНК-полімерази.

Притаманна висока специфічність ПЛР аналізу обумовлена використанням для її проведення унікального фрагмента геному збудника інфекційного захворювання (а саме гена PRNP), не зустрічається в інших організмів. Важливо також, що ПЛР - прямий метод лабораторної діагностики, тобто виявлення нуклеїнової кислоти вірусу еквівалентно виявлення вірусних частинок [11].

В даному дослідженні використовувався метод, що дозволяє виявити патогенні пріонні білки з високою чутливістю і специфічністю, званий імуно-ПЛР в реальному часі.

Імуно-ПЛР поєднує в собі універсальність імуноферментного аналізу з потужністю і чутливістю ПЛР. Дана тест-система дозволяє виявити патогенний пріонний білок з використанням специфічних антитіл, мічених двохланцюгової ДНК (маркер) [12, 13]

ПЛР-тест-система дозволяє зробити як якісний, так і кількісний аналіз вмісту інфекційного прионного білка. Відмінними рисами системи є швидкість виділення ДНК і наявність спеціально підібраних високоспецифічних і унікальних праймерів.

Тест-системи для виявлення IgG в спинномозковій рідині дозволяють поряд з виявленням антитіл у спинномозковій рідині (що вже є підтвердженням діагнозу) отримати додаткову інформацію про специфічному прогресуючому ураженні мозку.

З цією метою в лабораторії проводять розрахунок індексу LSQ і CSQ (по співвідношенню антитіл в лікворі і сироватці крові з урахуванням вмісту альбуміну). При ураженні ЦНС, особливо при менінгоенцефаліті і енцефаліті у імунодефіцитних осіб, передусім ВІЛ-інфікованих, а також у новонароджених при підозрі на вроджений токсоплазмоз, тест має важливе діагностичне і прогностичне значення.

Саме в діагностиці неонатальної патології найбільше діагностичне значення мають тести, спрямовані на детекції антигенів або ДНК збудника в крові та лікворі, низькоавідних IgG-антитіл і антитіл класу IgА. У зв'язку з передачею антитіл через плаценту від матері до дитини, у останнього при народженні виявляють антитіла IgG, що ускладнює діагностику вродженого токсоплазмозу. До 4 місяців після народження їх концентрація різко знижується через розпад материнських антитіл. У разі зараження незабаром після народження концентрація IgG-антитіл, що виробляються організмом дитини, наростає, проте в першому півріччі життя «маскується» рівень материнських антитіл. Підвищення рівня IgG у другому півріччі життя можна розглядати як показник інфікування дитини, але в ряді випадків (у недоношених та імунодефіцитних дітей) навіть при появі симптомів (найчастіше з боку ЦНС) різкого підйому антитіл не спостерігається [1].

Відома діагностична тест-система для виявлення вірусу захворювання, що включає іммобілізацію фізіологічно активних біомолекул антигенів або антитіл на підкладці, інкубування на підкладку розчину, що містить маркер захворювання, та реєстрацію діагностичних показників, за якими проводять діагностику вірусу.

У відомому способі діагностики гепатитів А, В і С методом імуноферментного аналізу в лунках тест-системи ковалентно іммобілізувати антитіла.

Вони пов'язують антиген вірусу з аналита. Отримані комплекси інкубують з антитілами, міченими пероксидазою. Після додавання відповідального субстрату відбувається ферментативна реакція з утворенням продукту, що має характерний спектр поглинання, який реєструють спектрофотометрично.

Відома діагностична тест-система для виявлення вірусу захворювання має недоліки:

- велика тривалість аналізу (кілька годин);

- висока трудомісткість;

- низька порогова чутливість (порядку піконанограм / мл);

- неможливість діагностування декількох захворювань одночасно [14].

Найбільш близьким за технічною сутністю до пропонованого технічного рішення є протеїнова діагностична тест-система (біочіп), що представляє собою розташовані на твердій підкладці молекули (антитіла, антигени або їх фрагменти), з допомогою якої здійснюють діагностику шляхом ідентифікації біологічних молекул, специфічних для інфекційного захворювання (гепатит В, С, сифілісу та ін).

Відомий спосіб має недоліки, а саме:

- Неможливістю реєстрації кожної окремої молекули, тобто не можна досягти чутливість реєстрації на рівні одиничних молекул через використання концентраційного детектора, яким проводять реєстрацію з отримання, тобто оптичного детектора, який реєструє випромінювання не від одиничної молекули, а випромінювання від великої кількості молекул.

- Поодинокі молекули у відомому способі не можна бачити, так як чутливість концентраційних оптичних детекторів дуже невисока.

Завданням, що вирішується пропонованим винаходом, є створення діагностичної системи з розширеними функціональними можливостями, яка дозволяє:

- значно зменшити тривалість аналізу (близько декількох хвилин),

- підвищити чутливість системи на рівні одиничних молекул і визначати одночасно кілька захворювань [15].

Запропонована тест-система призначена для зондової мікроскопії, а саме для атомно-силового мікроскопа. Технічний результат у пропонованому винаході досягають створенням діагностичної тест-системи для виявлення захворювання, що включає іммобілізацію поля молекул на підкладку, інкубування на підкладці розчину, що містить маркер захворювання, та реєстрацію діагностичних показників, за якими проводять діагностику захворювання, в якій згідно винаходу іммобілізацію на підкладку роблять окремо розташованих одиничних макромолекул, в якості яких використовують або антитіла та/або антигени, що утворюють специфічні комплекси з маркерними молекулами захворювань, та/або утворених ними моношарів, причому кожен тип молекул мобілізують у вигляді окремих сукупностей, які разом формують поле, а реєстрацію проводять шляхом визначення наявності реперних ізольованих комплексів молекул у полі під-ложки, утворених на підкладці при інкубації, і за наявності їх визначають наявність захворювання.

Пропонований винахід проводить кілька діагностик захворювань одночасно, за рахунок чого скорочується час аналізу, а використання поля однакових сукупностей підвищує статистичну достовірність діагностики.

Винахід характеризується також тим, що реєстрацію виробляють або одночасно всіх сукупностей на полі або послідовно.

Це також скорочує час аналізу за рахунок використання однієї і тієї ж підкладки, і зменшення числа маніпуляцій [7].

Запропонована діагностична тест-система для виявлення вірусу захворювання дозволяє підвищити чутливість реєстрації з 0,1 нг/мл (ІФА) до рівня одиничних молекул і дає можливість визначати одночасно кілька захворювань.

Використання поля іммобілізованих молекул дозволяє підвищити швидкість аналізу відразу декількох захворювань за рахунок одночасної реєстрації сигналу в декількох вимірювальних каналах від декількох годин до близько десяти хвилин.

Запропонована діагностична тест-система для виявлення вірусу захворювання може бути здійснена за допомогою зондового мікроскопа.

Розглянемо здійснення пропонованого винаходу на прикладі використання атомно-силового мікроскопа для діагностики гепатитів В і С.

Таке дослідження може бути проведено як окремо для кожного типу захворювання, так і одночасно. Різниця і проведення діагностики полягатиме у тому, які типи макромолекул будуть іммобілізовані на підкладку: одна сукупність або у вигляді декількох сукупностей.

Наприклад, на підкладці інкубують тільки антитіла до антигенів вірусу гепатиту В, тоді ми проводимо діагностику тільки захворювання гепатитом В.

Розглянемо приклад, коли на підкладку наносять різні макромолекули.

В цьому випадку використовують, наприклад, окремі слюдяні або скляні підкладки з іммобілізованими на них макромолекулами, в якості яких застосовані антигени HBsAg (вірусу гепатиту В) і Соге-антигени вірусу гепатиту С, а також іммобілізованими моноклональними (макромолекулами) антитілами до цих антигенів [15].

Іммобілізація за допомогою фізичної адсорбції широко відома і застосовується для іммобілізації білків.

На підкладку методом фізичної адсорбції мобілізують поодинокі антигени або антитіла, причому відстань на підкладці між молекулами може бути більше їх розмірів, що контролюється за допомогою зондового мікроскопа, що дозволяє бачити поодинокі молекули. Це залежить від технологічних можливостей апаратури.

Це необхідно для коректного визначення розмірів макромолекул і їх комплексів з маркерами захворювань.

Для підвищення адсорбційних властивостей підкладки при адсорбції антигенів або антитіл до неї виготовляють модифікацію підкладки, в тому числі ковалентно-пов'язаним рівним (тобто з нерівностями нижче розмірів іммобілізованих молекул) шаром різних типів силанів.

Потім на підкладку наносять (інкубують) розчини, що містять маркер захворювання, наприклад, антитіла до відповідних антигенів (у разі іммобілізованих антигенів) або розчини, що містять антигени (у разі іммобілізованих антитіл) з зшиваючими крос-лінкерами.

Утворення реперних ізольованих комплексів молекул супроводжується збільшенням розмірів початкових молекул.

Як аналіту, що містить маркер захворювання, використовують сироватку хворих пацієнтів. В якості контролю слід використовувати сироватку здорових людей.

У пропонованому винаході реєстрацію проводять за допомогою атомно-силового мікроскопа, що представляє собою молекулярний детектор, тобто детектор, який дозволяє відчувати одну молекулу.

У пропонованому винаході реєструють кожну окрему молекулу зондом, розмір якого може бути від декількох десятків нм (наприклад, 20 нм) до 1 нм (тобто розмір зонда і розмір макромолекули приблизно одного порядку). Тому досягають чутливості реєстрації на рівні одиничних молекул.

Теоретична межа чутливість атомно-силового мікроскопа - одна молекула в об'ємі розчину (так, при об'ємі проби 1 л - теоретична чутливість відповідає (1/6)*10-23 М).

У пропонованій діагностичній тест-системи для виявлення захворювання реєстрацію діагностичних показників можуть проводити порівняно виміряних висот, або латеральних розмірів реперних ізольованих комплексів молекул, утворених на підкладці при інкубації в аналіті підкладки з іммобілізованими макромолекулами, з висотами, або довжинами іммобілізованих ізольованих реперних одиничних макромолекул.

Запропонована діагностична тест-система для одночасного виявлення захворювання дозволяє проводити діагностику гепатиту В, С протягом 10 хв.

Це дає підставу припускати потенційну можливість широкого впровадження пропонованого винаходу в клінічну практику [17].

Запропонована діагностична тест-система для виявлення захворювання може бути застосована й для визначення одночасно декількох захворювань, наприклад, білків соматичних захворювань, зокрема, онкологічних захворювань і патології вагітності.

Були проведені експерименти з виявлення в аналіті комплексів з антитілами альфа-фетопротеїну і глікоделіну - маркерних білковоонкологічних захворювань і патології вагітності, відповідно і показано, що спостерігається збільшення висот комплексів в порівнянні з висотою ізольованих молекул як антитіл, так і альфа-фетопротеїну і глікоделіну.

Аналогічно, запропонована діагностична тест-система може бути використана для виявлення маркерів запалення сироваткового амілоїду A (SAA) (який може бути і маркером ранньої діагностики рака).

Таким чином, пропонований винахід дозволяє проводити діагностику вірусних захворювань, а також і інших захворювань, в тому числі неінфекційних.

Імунофлюоресцентний метод (РІФ). Тест-система для комплексного дослідження на респіраторні інфекції, що дозволяє протягом декількох годин окремо виявити антитіла класів IgM і IgG до вірусів грипу (серотипів), парагрипу, РС-вірусу, легіонеллам, збудників респіраторного хламідіозу і мікоплазмозу.

Імуноблот - унікальний тест, який дозволяє окремо детектувати IgM і IgG до окремих білків, стежити в динаміці за зміною білків, що має високе діагностичне і прогностичне значення. Досвід роботи свідчить про можливість його використання як при діагностиці вродженої ЦМВІ, так і придбаної форми, в тому числі у осіб з вираженим імунодефіцитом (при обмеженні синтезу антитіл або при їх поліклональних наробіток).

Використання даного тесту при обстеженні дітей, що народилися з ознаками внутрішньоутробної інфекції або від матерів, у яких в період вагітності були клінічні та/або лабораторні ознаки актиної інфекції, дозволяє встановити (виключити) внутрішньоутробну (перинатальну) інфекцію. Якщо в період новонародженості РІФ (ПЛР) дають негативні результати при дослідженні крові, а виявлення IgG (материнські антитіла) не дозволяє виставити ЦМВІ, то рекомендується поставити тест через 1,5-2 місяці. У разі інфікування з'являються антитіла класу IgM до «ранніх» білків (р65, р28) та/або з'являються IgG до нових білків («раннім» антигенів: р65, р28), що нерідко корелює з позитивними результатами РІФ і/або ПЛР і наростанням клінічних симптомів (передусім з боку ЦНС). Рекомендується консультація неонатолога і обстеження дітей, що мали вроджену ЦМВІ або признаки неясної вродженої інфекції, у віці 3-4 місяців життя перед вакцинацією, оскільки на тлі втрати материнських антитіл і слабкою напрацювання власних антитіл у цей період можлива персистенція ЦМВ, а введення вакцини може погіршити ситуацію і спровокувати розвиток патологічного процесу з розвитком гідроцефального синдрому [1].

Діагностична тест-система, що включає іммобілізацію сукупностей детектуючих молекул на підкладку, інкубування на підкладці розчину, що містить маркер захворювання, та реєстрацію діагностичних показників, за якими проводять діагностику захворювання, що відрізняється тим, що на підкладку мобілізують окремо розташовані поодинокі детектуючі молекули, а реєстрацію проводять за допомогою атомно-силового мікроскопа шляхом виявлення реперних ізольованих комплексів молекул, що утворилися на підкладці при інкубації, і за їх наявності проводять діагностику захворювання.

Діагностична тест-система, що відрізняється тим, що реєструє наявність всіх сукупностей детектуючих молекул на підкладці одночасно або послідовно [7].



РОЗДІЛ 3. ЧУТЛИВІСТЬ, СПЕЦИФІЧНІСТЬ, ДІАГНОСТИЧНА ЕФЕКТИВНІСТЬ ТЕСТ-СИСТЕМ ІМУНОАНАЛІЗІВ

3.1 Чутливість імуноаналізів

Термін «чутливість» стосовно до імуноаналізів має два різних смисла:

1. Чутливість в фізико-хімічному розумінні - визначається, даним аналізом, мінімальна концентрація шуканої речовини в пробі. Як правило, для більшості ІФА-тест-систем така чутливість становить нанограми в мілілітрі.

2. Друге розуміння терміна «чутливість» - популяційне і відноситься до діагностичних тест-систем, призначених для виявлення тих чи інших маркерів захворювань, найчастіше інфекційних.

При розробці будь-якої тест-системи користуються біологічним матеріалом, скажімо, пробами крові людей, свідомо хворих даним захворюванням (ці проби називають істинно позитивними), і людей, що завідомо не хворих даним захворюванням (ці проби називають істинно негативними).

Параметри розраховують за наведеними нижче формулами, де N - число тих чи інших конкретних результатів аналізів на біологічному матеріалі від пацієнтів з достовірно відомими діагнозами [17].

Чутливість імуноаналізу в даному випадку - це параметр, завжди прив'язаний до конкретної тест-системі, а не тільки до принципу методу. Чутливість залежить від афінності і авідності взаємодії використовуваних (або шуканих) антитіл з шуканим (або використовуваним) антигеном, від інших реагентів, включених в систему, від часу і температури інкубацій.

Оскільки зв'язування антитіл з антигенами не підпорядковується лінійними залежностями, то в цілях попадання в «зони еквівалентності» практично у всіх варіантах імуноаналізів прийнято так зване титрування сироваток або розчинів антигенів, тобто сироватки (або розчини антигенів) розводять відомим чином (дворазові, п'ятиразові, десятикратні або інші розведення) і кожне з розведень пускають в імуноаналіз. Для того щоб встановити нижню межу достовірних ознак зв'язування антитіл з антигеном (cut-off - межа відмінності негативних результатів від позитивних), в кожній постановці імуноаналізів обов'язково застосування свідомо негативних і свідомо позитивних контрольних сироваток. Якщо метою аналізу є визначення не титрів сироваток, а чисельних концентрацій шуканих антитіл або антигенів, то вдаються до калібрування. Для цього тест-система повинна мати калібрувальними розчинами (від 3 до 10 точок), що містять відомі наростання концентрації шуканої речовини, а система реєстрації результатів теж повинна бути «оцифрована», наприклад, в одиницях оптичної щільності, вимірюваних спектрофотометрично, або в одиницях флуоресцентного випромінювання, вимірюваного флюорометрами, або в одиницях числа імпульсів в хвилину, вимірюваних лічильниками радіоактивності (у разі радіоімуноаналізів). У діапазонах прямолінійності калібрувальної кривої можливе визначення шуканих концентрацій у випробовуваних біопробах.

Методи преципітації, аглютинації та імунодифузії працездатні при концентраціях шуканих речовин порядку міліграмів на мілілітр. Як правило, калібрувальні розчини мають діапазон концентрацій від 1 до 0,1 мг/мл

Твердофазні радіоімуноаналізи та імуноферментні аналізи працюють в більшості тест-систем в нанограмових діапазонах концентрацій (нанограми на мілілітр). Однак пасткові конструкції тест-систем, а також імунометричні тест-системи можуть мати істотно більш високу чутливість, наприклад, 10-12-15 г / мл. [17].



3.2 Специфічність імуноаналізів

Специфічність діагностичної тест-системи-параметр, що характеризує її розпізнавальні можливості щодо саме даного захворювання, яке вона «не плутає» з іншими. Позитивний результат у тесті з високою специфікою корисний для лікування хвороби. Випробування рідко дають позитивні результати у здорових пацієнтів. Тест з 100-відсотковою специфікою буде вважати негативним і точно виключати захворювання у всіх здорових пацієнтів. Позитивний результат означає високу ймовірність наявності захворювання

3.3 Діагностична ефективність тест-систем

Діагностична ефективність - це параметр, що характеризує можливості даної тест-системи одночасно правильно визначати позитивні проби як позитивні, а негативні проби - як негативні.

Позитивна і негативна передбачувальна значимість тест-систем. Є ще й такі характеристики діагностичних тест-систем, як позитивна передбачувальна значимість (ППЗ) і негативна передбачувальна значимість (НПЗ).

ППЗ розраховують, як частоту зустрічальності інфікованих людей серед усіх індивідуумів, визначених даною тест-системою як позитивні:

НПЗ тест-системи розраховують, як частоту неінфікованих людей серед усіх індивідуумів, визначених даною тест-системою як негативні:

Щоб користуватися даними характеристиками (і це відрізняє їх від наведених вище чутливості і специфічності), необхідно знання реальної поширеності даного інфекційного захворювання в досліджуваних популяціях населення [17].



ВИСНОВКИ

Кількість методів, що використовуються для діагностики вірусних інфекцій, безперервно зростає. Одні йдуть в минуле і мають в основному історичне значення, інші вдосконалюються.

Безсумнівно, що технічний прогрес у визначенні антитіл, білкового аналізу і генодіагностики поряд з розширенням наших знань вірусів і патогенезу вірусних інфекцій приведуть до появи нових високоспецифічних та високочутливих методів, зручних для клінічного застосування.

В даний час випускається велика кількість комерційних сертифікованих тест-систем, в тому числі і вітчизняних, для діагностики найбільш поширених і соціально значущих вірусних інфекцій.

Державний реєстр містить понад 600 діагностичних препаратів.

Однак далеко не для всіх груп вірусів є діагностичні тест-системи. Наприклад, з великої групи ентеровірусів (понад 80 членів) тільки для виявлення вірусів поліомієліту є тест-системи, в той же час для діагностики ВІЛ-інфекції випускається більше 15 різних наборів.

Тест-системи дають можливість більш швидкого аналізу на інфекційні захворювання. Це надає можливість обстежувати більш значну кількість людей и виявляти хворих. І раніше приймати протиепідемічні заходи.



СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ

1. Долгих Т.И. Современные возможности лабораторной диагностики инфекционных заболеваний (методы, алгоритмы, интерпретация результатов) Пособие для врачей - Омск 2005 УДК.

2. Методы диагностики ВИЧ-инфекции [Электронный ресурс] Официальный сайт: Фонд Елены Пинчук - 2004-2018 - Режим доступа до журн.: http://www.antiaids.org/topics/medtopic/metody-diagnostiki-vich-infekcii-10060.html - оглавление с экрана.

3. С.В. Бурова Диагностика инфекционных заболеваний - 2008. С. 118-119.

4. Лысенко А.С. Лабораторная диагностика - №1 - 2009. с.35-36.

5. Виды экспресс тестов и способы их использования [Электронный ресурс] Официальный сайт: Санитарно-эпидемические службы России - Режим доступа до журн.: http://rosoblses.ru/infektscionnye-zabolevaniya/diagnostika-infektscionnyh-zabolevanii/vidy-ekspress-testov-i-sposoby-ix-ispol-zovaniya.html - оглавление с экрана.

6. Таранов А.Г. Диагностические тест-системы(Радиоимунный и имуноферментный методы). - М.: Мокеев , 2002. - 287 с.

7. Диагностическая тест-система для выявления заболевания [Электронный ресурс] Официальный сайт: FindPatent.ru - 2012-2018 - Режим доступа до журн.: http://www.findpatent.ru/patent/236/2361215.html - оглавление с экрана.

8. Трахтенберг І.М. Альтернативні методи і тест-системи. Лікарська токсикологія - К.: Авіцена, 2008. -271 с.

9. Морозов С.Г., Иванов Ю.Д. и др. Аллергия, астма и клиническая иммунология - №9 - 2008, с.187-189.

10. George A.J.T. et al. «Tumor targeting», V.2, №5, 2016, p.245-250.

11. Иванов М.К., Порываев В.Д., Кандрушин Е.В. Особенности количественного анализа методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени\\ «От эпимологии к диагностике актуальных инфекци» (Иркутск, 2014) - с 96-102.

12. Liang H., Susan E., Kieft L. A highly sensitive immuno-PCR assay for detecting group Streptococcus // Journal of Immunological Methods. 2003. № 279. P. 101-110.

13. Christof M., Michael A., Wacke R. Immuno-PCR: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification // TRENDS in Biotechnology. 2005. V. 23. № 4. P. 208-216.

14. Патент №2065164 РФ, по кл. C01N 33/53, «диагностическая тест-система для выявления вируса гематита А» / Васильченко Н.Ф. Ефременко В.И. Гнутова И.Н. - Опубл. 10.08.2006 г. Бюл. №22.

15. CN 1373365, кл. G01N 33/68, Иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела, A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например, протеины, вообще C07K) опубл. 09.10.2002.

16. V.Yu. Kuznetsov, Y.D. Ivanov, V.A. Bykov. Atomic force microscopy detection of molecular complexes in multiprotein. P450cam-containing monooxygenase system. Proteornics. 2002, issue 12, vol.2, p.1699-1705.

17. Чувствительность, специфичность, диагностическая эффективность тест-систем иммуноанализов [Электронный ресурс] Официальный сайт: YAmedik.org - Режим доступа до журн http://yamedik.org/?p=21&c=gematologiya/immunolog_prak_k - оглавление с экрана.

18. Смердова М.А. «Серологическая диагностика иксодового клещевого боррелиоза в новом формате иммуночипа». «Клин. лаб. диагностика», 2008, № 9, с. 4.

Размещено на Allbest.ru