Изучение влияния индуцированного мутагенеза, обусловленного действием химических мутагенов, на показатели жизнедеятельности мухи Drosophila melanogaster

Размещено на http://www.allbest.ru/

Исследовательская работа

Изучение влияния индуцированного мутагенеза, обусловленного действием химических мутагенов, на показатели жизнедеятельности мухи Drosophila melanogaster

Мигун Лидия

Москва-2017

Введение

Такие науки как химия и биология играют неоценимую роль в нашей жизни. Открывая и изучая химические вещества, ученые изобретают новые лекарства, тем самым, спасают тысячи людей от смертельных болезней. А биология дает нам знания об окружающем мире, о самой жизни.

Каждый день мы сталкиваемся с химическими веществами, не задумываясь над этим и не подозревая об их воздействии на наш организм. Зачастую оно является не самым благоприятным. Так чего же нам следует сторониться? Как химические вещества могут влиять на наше здоровье? Это мы и исследовали в нашей работе.

Целью нашей работы является изучение влияния мутагенов, химической природы, на развитие живых организмов, на примере Drosophila melanogaster. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: индуцированный мутагенез drosophila melanogaster

познакомиться с теоретическими основами индуцированного мутагенеза;

проработать литературные источники с данными по веществам, вызывающими мутагенные эффекты;

овладеть навыками работы с линейными линиями Drosophila melanogaster в лаборатории;

произвести оценку показателей жизнеспособности дрозофил, подвергшихся воздействию химических мутагенов.

Глава 1. Дрозофила как объект исследования

Дрозофимлы (лат. Drosophila от др.-греч. дсьупт -- роса, влага + цйлЭщ -- любить) -- плодовые мухи, род мелких насекомых семейства плодовых мушек (Drosophilidae) отряда двукрылых (Diptera). В природе питаются соком растений, гниющими растительными остатками. Личинки питаются также и микроорганизмами. Небольшие размеры, короткий жизненный цикл и простота культивирования позволили использовать ряд видов дрозофил как образцовые объекты генетических исследований. Дрозофила фруктовая (Drosophila melanogaster) -- наиболее важный для научных исследований вид дрозофил. Широко используется в научных целях, начиная с работ Томаса Ханта Моргана по генетике пола и хромосомной теории наследственности. Важными характеристиками D. melanogaster как модельного объекта является малое число хромосом (2n = 8), наличие политенных хромосом в ряде органов (например, слюнных железах личинки) и большое разнообразие видимых проявлений мутаций. В настоящее время D. melanogaster -- один из наиболее изученных видов живых организмов. Её геном полностью отсеквенирован. D. melanogaster используется для исследования взаимодействия генов, генетики развития, оценки негативных эффектов медицинских препаратов и поллютантов.

Глава 2. Мутагены

Мутагены (от мутация и др.-греч. геннЬщ -- рождаю) -- химические и физические факторы, вызывающие наследственные изменения -- мутации. Любые мутации могут возникнуть спонтанно или быть индуцированными. Спонтанные мутации появляются под влиянием неизвестных природных факторов и приводят к ошибкам при репликации ДНК. Индуцированные мутации возникают под воздействием специальных направленных факторов, повышающих мутационный процесс.

Классификация мутагенов

По происхождению мутагены классифицируют на эндогенные, образующиеся в процессе жизнедеятельности организма и экзогенные - все прочие факторы, в том числе и условия окружающей среды. Выделяют три основных вида мутагенов - физические, химические и биологические.

Физические мутагены

Ионизирующее излучение;

Радиоактивный распад;

Ультрафиолетовое излучение;

Чрезмерно низкая или высокая температура.

Химические мутагены

Химические мутагены являются самыми распространенными в группе. К ним относятся следующие группы соединений:

Алкалоиды;

Окислители и восстановители (нитраты, азотистая кислота и ее соли - нитриты, активные формы кислорода);

Нитропроизводные мочевины;

Алкилирующие агенты;

Пестициды;

Некоторые пищевые добавки (например, Е230);

Продукты переработки нефти;

Органические растворители;

Лекарственные препараты (например, цитостатики, препараты ртути, иммунодепрессанты).

Биологические мутагены

Продукты обмена веществ (продукты окисления липидов);

Антигены некоторых организмов

Вирусы (мутагенным фактором вирусов являются их нуклеиновые кислоты).

Глава 3. Канцерогены

Канцерогемн (от лат. cancer `рак' и др.-греч. геннЬщ `рождаю') -- факторы окружающей среды, воздействие которых на организм человека или животного повышает вероятность возникновения злокачественных опухолей.

Канцерогенными этиологическими факторами могут быть химические вещества и аэрозоли, вирусы, различные виды излучений, присутствующие в окружающей среде, или попадающие с продуктами питания и водой в организм. Росту онкологической заболеваемости может способствовать как фактор трудовой деятельности психоэмоциональный стресс.

Канцерогенные вещества могут входить в состав сырья, образовываться на промежуточных стадиях технологического процесса, содержаться в конечном продукте и/или поступать в окружающую среду в виде выбросов, сбросов и твердых отходов.

Международное агентство по изучению рака (МАИР) разработало критерии по оценке канцерогенной активности химических соединений, основанные на степени доказанности канцерогенности того или иного соединения для человека или животного.

По критериям МАИР выделены 4 группы химических веществ, соединений и смесей, производственных воздействий и процессов по степени доказанности канцерогенности для человека.

Первая группа. Факторы, в отношении которых имеются убедительные доказательства канцерогенности их для человека.

Вторая группа. Факторы, для которых имеются почти убедительные доказательства канцерогенности для человека или в отсутствие таковых - убедительные доказательства канцерогенности для животных. Разделена на 2 подгруппы: подгруппа 2 А - вероятные канцерогены; 2 Б - возможные канцерогены.

Третья группа. Включает химические соединения, их группы, производственные процесс или профессиональные воздействия, которые не могут быть классифицированы с точки зрения их канцерогенности для человека.

Четвертая группа. Факторы, воздействие которых вероятно безопасно для человека.

Вещества и продукты с доказанной для человека канцерогенностью:

4-Аминобифенил - рак мочевого пузыря;

Асбесты - рак легких, рак гортани, толстой и прямой кишок, мезотелиома плевры и брюшины;

Афлатоксины (В1, а также природная смесь афлатоксинов) - рак печени, легких;

Бензидин - рак мочевого пузыря;

Бензол - лейкемия;

Бенз(а)пирен - рак легких, кожи;

Бериллий и его соединения - рак легких;

Бисхлорметиловый и хлорметиловый эфиры - рак легких;

Винилхлорид - ангиосаркома печени, рак головного мозга, легких, лейкоз, лимфома;

Кадмий и его соединения - органы дыхания и мочевыделения, простата;

Иприт сернистый - рак легких;

Каменноугольные и нефтяные смолы, пеки и их возгоны - рак кожи, легких,

мочевого пузыря, желудка;

Неочищенные минеральные масла (нефтяные и сланцевые) - рак кожи, желудка;

Мышьяк и его неорганические соединения - рак кожи, легких;

2-нафтиламин - рак мочевого пузыря;

Никель, его соединения и смеси соединений никеля - рак легких, носовой перегородки;

Тальк, содержащий асбестоподобные волокна - рак легких, мезотелиома плевры и брюшины;

2,3,7,8-Тетрахлорбензо-пара-диоксин-хрома - рак легких;

Эрионит - мезотелиома плевры, брюшины;

Окись этилена - рак лимфатической и кроветворной ткани, желудка.

Глава 4. Тератогены

Тератогены - вещества или физические агенты, которые при воздействии на родительские организмы способны вызывать врожденные дефекты у потомства.

Тератогенное действие (от греч. фЭсбфпт-- чудовище, урод; и др.-греч. геннЬщ -- рождаю) -- нарушение эмбрионального развития под воздействием тератогенных факторов с возникновением морфологических аномалий и пороков развития.

Причинами развития врожденных пороков являются генетические факторы, неблагоприятные воздействие внешней среды, действующие непосредственно на эмбрион (тератогенез), а также сочетание тех и других причин и факторов. В настоящее время установлено, что среди различных загрязняющих окружающую среду веществ свойствами нарушать эмбриональное развитие (формировать врожденные пороки развития) обладают:

Пыль и сажа;

Тяжелые металлы;

Продукты химического производства (красители, формальдегид и т.д.);

Оксиды углерода, серы и азота, сероводорода;

Фтор и фтористые соединения.

В выбросах автотранспорта наибольшим мутагенным и канцерогенным эффектом обладает бензин, пирен.

К сожалению, этот перечень веществ определяется в атмосфере города и на многих рабочих местах предприятий.

Исследования показали, что в течение беременности каждая женщина принимает в среднем 3,8 наименования каких-либо лекарственных средств. 10-20 % беременных в США употребляют наркотики. Кроме того, беременные в быту и на работе нередко контактируют с разными вредными веществами.

Тератогенным считается химический, физический или биологический фактор, отвечающий следующим критериям:

Доказана связь между действием фактора и формированием порока развития.

Эпидемиологические данные подтверждают эту связь.

Действие повреждающего фактора совпадает с критическими периодами внутриутробного развития.

При редком воздействии повреждающего фактора характерные пороки развития формируются редко.

Основные группы тератогенных факторов:

Лекарственные средства и химические вещества;

Ионизирующее излучение;

Инфекции;

Метаболические нарушения беременной;

Вредные привычки беременной.

Инфекции:

Цитомегаловирусная инфекция;

Герпес (вирусы простого герпеса первого и второго типа);

Инфекционная эритема (парвовирусная инфекция);

Краснуха;

Сифилис;

Токсоплазмоз;

Венесуэльский лошадиный энцефалит;

Инфекции, вызванные вирусом varicella-zoster (ветряная оспа, опоясывающий лишай).

Ионизирующее излучение:

Лечение радиоактивным йодом;

Лучевая терапия.

Метаболические нарушения:

Эндемический зоб;

Дефицит фолиевой кислоты;

Длительная гипертермия;

Фенилкетонурия;

Андрогенсекретирующие опухоли;

Декомпенсированный сахарный диабет.

Вредные привычки:

Алкоголизм;

Курение;

Наркомания.

Лекарственные средства:

Лития карбонат;

Тиамазол;

Пеницилламин;

Изотретиноин;

Тетрациклины;

Талидомид;

Триметадион;

Вальпроевая кислота;

Йодиды;

Эналаприл;

Этретинат;

Диэтилстильбэстрол;

Циклофосфамид;

Антикоагулянты;

Каптоприл;

Бусульфан;

Метотрексат.

Выделяют следующие особенности влияния тератогенных факторов:

Действие тератогенных факторов имеет дозозависимый характер. У разных биологических видов дозозависимость тератогенного действия может различаться.

Для каждого тератогенного фактора существует определенная пороговая доза тератогенного действия. Обычно она на 1-3 порядка ниже летальной.

Различия тератогенного действия у различных биологических видов, а также у разных представителей одного и того же вида связаны с особенностями всасывания, метаболизма, способности вещества распространяться в организме и проникать через плаценту.

Чувствительность к разным тератогенным факторам в течение внутриутробного развития может меняться.

В случаях, когда тератогенное действие оказывают возбудители инфекций, пороговую дозу и дозозависимый характер действия тератогенного фактора оценить не удается.

Наследственные болезни обусловливают более 60% самопроизвольных абортов в I триместре беременности. Часть наследственных болезней наследуются в соответствии с законами Менделя, другие, например геномный импринтинг, митохондриальное наследование, мозаицизм, -- нет. Ведущее место в наследственной патологии человека занимают полигенные болезни, или болезни с наследственной предрасположенностью. Они обусловлены совместным действием многих генов и факторов внешней среды. Для полигенных болезней, как и для тератогенных факторов, справедлива концепция пороговой дозы. Диагностировать наследственные болезни можно уже в ранние сроки внутриутробного развития.

Генетический риск оценивают с учетом следующих факторов:

Этническая принадлежность;

Пол больного;

Тяжесть поражения;

Степень родства.

Глава 5. Экспериментальная часть

Результаты и обсуждения.

Оборудование:

Стеклянные стаканчики для разведения мух

Морилка для усыпления мух

Серный эфир для усыпления мух

Сосуд с водой для мертвых мух

Фломастеры для надписей на стаканчиках

Перышки для работы с мухами

Набор компонентов для приготовления питательной среды

Ход работы:

Приготовление питательной среды.

Рецепт

Вода ......... 350 мл

Дрожжи ....... 40 г

Манная крупа 13 г

Сахар ....... 13 г

Агар-агар ... 4,5 г

В термостойком стакане в теплой воде растворяют указанное количество агар-агара и, помешивая, доводят его до кипения. В кипящий раствор добавляют растертые дрожжи и кипятят еще 40 минут на слабом огне, помешивая. Затем в стакан добавляют манную крупу и сахар и варят еще 15 минут.

Используемые канцерогены

Формалин

формалин - водный раствор формальдегида.

Формальдегид - бесцветный газ с резким запахом, хорошо растворимый в воде и спиртах, способен денатурировать белки, и поэтому применяется в качестве дубителя в кожевенном производстве и в производстве ДСП. Обладает антисептическими свойствами, используется в консервации биологических материалов.

Формалин имеет выраженные мутагенные свойства, а также действует как серьезный аллерген и раздражитель.

Контакт человеческого организма со средой, содержащей это вещество, может привести к раку дыхательных путей и многим другим тяжелейшим заболеваниям.

Изучению токсичности для человека избыточных доз формальдегида посвящено значительное число работ, в результате которых был выявлен уровень предельно допустимой концентрации (ПДК) - 0,5 мг/м3 , которая у испытанных животных вызывает ряд изменений общетоксического и аллергического характера.
Мутагенное действие формальдегида на дрозофиле было впервые показано И.А. Рапопортом в 1946 г., а затем в работах Ауэрбах (1977), в которых было установлено, что формальдегид - мутаген, действующий по-разному при различных методах обработки. Чрезвычайно сильно выражен мутагенный эффект формальдегида, вводимого в питательную среду дрозофилы. В настоящей работе было изучено мутагенное действие формальдегида при введении его в питательную среду личинок дрозофилы.
Использовалась лабораторная линия Drosophila melanogaster дикого типа. Воздействие формальдегидом на личинку дрозофилы осуществлялось путем введения мутагена в корм, что позволяет производить обработку клеток на разных этапах личиночного развития. Готовили стандартную питательную среду, в которую добавляли мутаген в двух вариациях: 1) на 10 мл среды 26 мкл 38% формальдегида, получали 0,1% раствор формалина в смеси; 2) на 10 мл среды - 2,62 мкл формальдегида - 0,01% концентрацию формалина. Во всех вариантах использовались стандартные питательные среды.

Можно отметить ряд особенностей общетоксического действия формальдегида на дрозофилу. Введение формальдегида 0,1% концентрации в пищевой субстрат личинок сопровождается, их гибелью. В этом проявляется общетоксический эффект, который может быть обусловлен многими причинами, в том числе, в какой-то степени, поражением генетического аппарата дифференцирующихся клеток личинок.

Можно предположить, что формальдегид подавляет те или иные механизмы регуляции онтогенеза, например, осуществление первой личиночной линьки. А также, формальдегид обладает общим цитостатическим действием, блокируя пролиферацию клеток, которая, как раз, наиболее интенсивно осуществляется на начальных этапах развития личинок. В нашем эксперименте, это было выражено в том, что в при закладке первого эксперимента с формальдегидом, у всех личинок наблюдалась задержка развития, личиночная стадия была более продолжительной, по сравнению К-, а также гибелью всех личинок на ранних стадиях развития. Это позволяет в какой-то мере считать, что формальдегид обладает неспецифическим цитостатическим действием. Возможно, обусловленная блоком митотической активности, задержка развития насекомых происходит вследствие вмешательства формальдегида в метаболизм ДНК. По фенотипическому проявлению мутации можно классифицировать на летальные - приводящие к гибели организма на различных этапах развития, вредные, нейтральные и полезные мутации. Часть мутаций не приводит к видимым изменениям в фенотипе исследуемых объектов, при этом такие мутации могут значительно влиять на выживание объектов исследования или способность давать потомство. Время проявления мутаций также может различаться. Некоторые приводят к гибели организма еще на эмбриональной (личиночной) стадии развития, другие проявляют себя на поздних стадиях, в т.ч. после рождения потомства. Снижение количества откладываемых яиц D. Melanogaster, наблюдавшееся в ходе эксперимента, по сравнению с контрольной группой, не получавшей в составе питательной смеси формальдегида, может быть обусловлено накоплением вредных герминальных мутаций затрагивающих репродуктивную систему мух. Мутагенные свойства формалина показаны Раппопортом еще в первой половине 20 в., а также позднее и другими исследователями [Alderson T. 1985, Benyajati C et al 1983, Szabad J et al. 2012]. Токсический эффект от питания смесью, содержащей формальдегид, может быть исключен для поколений дрозофил F2 и F3, которые в данном эксперименте получали питательную смесь, свободную от формальдегида. Таким образом, угнетение репродуктивной функции, в сравнении с контрольной группой, которое наблюдалась также и в этих поколениях, можно считать следствием накопления вредных мутаций, передающихся по наследству (герминальных).

Этанол (этиловый спирт)

Одноатомный спирт с формулой C2H5OH, бесцветная летучая жидкость с характерным запахом и жгучим вкусом. В основном используется как растворитель или алкогольный напиток.

Этанол оказывает токсичный эффект на ряд органов. Смертность, связанная с употреблением алкоголя, составляет по данным ВОЗ 6,3% у мужчин и 1,1% у женщин. Международное агентство по изучению рака относит этанол в спиртных напитках к доказанным канцерогенам. Является типичным аутомутагеном, а именно, сам по себе мутагеном он не является. Однако в организме живых организмов, благодаря деятельности фермента альдегид дегидрогеназы (ALDH), он окисляется до ацетальдегида, а это вещество уже является мутагеном. Под действием фермента альдегидоксидазы он окисляется до укссной кислоты, которая является первым звеном Цикла Кребса (или Цикл трикарбоновых кислот). Механизм действия следующий, остаток уксусной кислоты из ацетил-КоА переносится к щавелевоуксусной кислоте (в нейтральной среде это ион оксалоацетата), в результате чего образуется лимонная кислота (точнее, цитрат-ион), а коэнзим А освобождается. Эта реакция катализируется ферментом цитратсинтазой, она необратима. В связи с тем, что в окружающей среде была повышенная концентрация этанола, метаболические процессы, происходящие в личинках, развивающихся на такой питательной среде, заметно ускорялись. Это выразилось в том, что личинки гораздо быстрее росли и окукливались.

Для эксперимента были использованы мухи линии Canton-S (дикий тип мухи Drosophila melanogaster, часто используемый для генетических исследований).

Закладка F2

Была произведена закладка 6 пробирок:

2 с этанолом (был взят спирт концентрацией 96% в объеме 0,56мкл и добавлен в 10мл питательной среды, в итоге был получен раствор этанола 5%)

2 без канцерогена (отрицательный контроль)

2 с формалином (был взят формалин концентрацией 38% в объеме 26 мкл и добавлен в 10мл питательной среды, в итоге был получен раствор формалина 0,1%)

Результаты:

В пробирках с этанолом наблюдалось повышение рождаемости в 1,5 по сравнению с отрицательным контролем, но продолжительность жизни мух снизилась.

В формалине личинки оказались нежизнеспособными.

Закладка F2

Мухи, полученные в результате первого эксперимента, были рассажены в новые пробирки без добавления мутагенов

Была произведена закладка 19 пробирок:

8 отрицательного контроля

11 с мухами из пробирок с этанолом

Повторно был заложен эксперимент над мухами(F1), помешенными в пробирки с формалином.

Итог:

Наблюдалось снижение продолжительности жизни мух в пробирках с этанолом примерно в 2-3 раза и увеличение рождаемости в 1,5 раза. В пробирках с этанолом были замечены нежизнеспособные личинки.

Выживаемость в пробирках с этанолом ниже на 20%

Формальдегид проявил себя как настоящий мутаген, вызвав в концентрации 0,1% стопроцентный летальный исход. В этом проявляется общетоксический эффект, который может быть обусловлен многими причинами, в том числе и поражением генетического аппарата дифференцирующихся клеток личинок.

В связи с тем, что в окружающей среде была повышенная концентрация этанола, метаболические процессы, происходящие в личинках, развивающихся на такой питательной среде, заметно ускорились. Причиной этого стало окисление спирта в организме личинок до уксусной кислоты, что увеличило скорость прохождения Цикла Кребса

Выводы работы

В результате исследовательской работы мы:

познакомились с теоретическими основами индуцированного мутагенеза;

проработали литературные источники с данными по веществам;

овладели навыками работы с дикой линией Drosophila melanogaster в лаборатории;

произвели оценку показателей жизнеспособности дрозофил, подвергшихся воздействию химических мутагенов.

Библиография

1. ru.rfwiki.org/wiki/Дрозофилы

2. studopedia.org

3. «Зарождение и развитие генетики». Гайсинович А.Е., Москва: Наука, 1988 г. - 424 с.

4. «Англо-русский толковый словарь генетических терминов». Арефьев В.А., Лисовенко Л.А.,

5. Москва: ВНИРО, 1995 г. - 407 с.

6. «Генетика». Иванов В.И., Москва: Академкнига, 2006 г. - 638 с.

7. «Онкология». Давыдов М.И., Ганцев Ш.Х., Москва: ГЭОТАР - Медия, 2013 г. - 920 с.

8. «Руководство к практическим занятиям по генетике». Ватти К., Тихомирова М., МОСКВА: Просвещение, 1972г., - 186 с.

9. «Генетика с основами селекции». Инге-Вечтомов С., Москва: Высшая школа., 1989г. - 582 с.

10. «Гены» Льюин Б., Москва: Мир, 1987г. - 544 с.

Размещено на Allbest.ru