Размещено на http://www.allbest.ru/

5

ФГАОУ ВО «Волгоградский государственный университет»

Факультет естественных наук

Кафедра биоинженерии и биоинформатики

КУРСОВАЯ РАБОТА

по биохимии

Влияние солей металлов и наночастиц серебра на жизнеспособность Paramecium caudatum

Свиридова Ирина Андреевна

Научный руководитель:

к.б.н., доцент

Срослова Г.А.

Нормоконтролер:

к.б.н., доцент

Срослова Г.А.

Волгоград 2016



• Оглавление
• ВВЕДЕНИЕ
• ГЛАВА 1. Теоретические основы исследования
• 1.1. Paramecium caudatum как тест-организм
• 1.2. Обзор статей, посвященных токсическому действию металлов на инфузорий
• 1.3. Биологическая активность наночастиц
• ГЛАВА 2. Материалы и методы
• 2.1. Список использованных материалов и оборудования
• 2.2. Культивирование модельного организма
• 2.3. Приготовление растворов реагентов
• 2.4. Синтез серебряных наночастиц
• 2.5. Определение токсичности химических соединений и наночастиц по отношению к P. caudatum
• ГЛАВА 3. Результаты исследования
• 3.1. Оценка жизнеспособности инфузорий P. caudatum при воздействии растворов солей металлов
• 3.2. Оценка жизнеспособности инфузорий P. caudatum при воздействии наночастиц серебра
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• Список литературы



ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. В настоящее время существует проблема загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами. В отличие от органических загрязнителей тяжелые металлы не подвергаются биодеструкции, аккумулируются как в живых организмах, так и в субстратах. Угнетающее действие тяжелых металлов на все уровни сообществ замедляет процессы самоочистки, а в случае значительного загрязнения тяжелыми металлами снижается видовое разнообразие, что уменьшает устойчивость экосистем.

Поступление тяжелых металлов в окружающую среду связано с активной деятельностью человека. Их основные источники -- промышленность, автотранспорт, котельные, мусоросжигающие установки и сельскохозяйственное производство. К отраслям промышленности, загрязняющим окружающую среду тяжелыми металлами, относятся черная и цветная металлургия, добыча твердого и жидкого топлива, горно-обогатительные комплексы, стекольное, керамическое, электротехническое производство и др. В сельскохозяйственном производстве загрязнение почвы тяжелыми металлами связано с использованием удобрений и пестицидов.

Также угрозу экологии представляет развитие нанопромышленности. Влияние наночастиц на окружающую среду остается неизвестным, в основном из-за отсутствия научных знаний относительно возможного вреда для здоровья человека и экологических рисков, связанных с наноматериалами.

Наибольшее значение для установления баланса в окружающей среде имеют гидробионты, к которым относятся одноклеточные эукариотические организмы Paramecium caudatum (инфузория-туфелька, парамеция хвостатая). Они распространены в гидросфере и имеют ряд преимуществ в качестве тест-организмов. Инфузории являются одноклеточными эукариотами, относящимися к консументам первого порядка. Они широко распространены во всех средах обитания, что делает их подходящей моделью организма для наблюдения влияния физических и химических факторов на биологические сообщества. Более того, они быстро реагируют на токсичные и нетоксичные химические вещества, что обуславливается малым временем генерации и тонкой клеточной мембраной без внешней клеточной стенки.

Степень изученности проблемы. На данный момент проблема оценки токсичности тяжелых металлов освещена во многих работах отечественных и зарубежных авторов. Однако существует небольшое количество работ, посвященных определению токсичности тяжелых металлов на P. caudatum, так как большинство исследований проводилось на бактериях, растениях и многоклеточных животных. Также в настоящее время известна единственная работа, посвященная определению воздействия наночастиц на P. caudatum, принадлежащая авторам из университета Палацкого [13].

Объект исследования - тест - организм Paramecium caudatum.

Предмет исследования - биологическая активность солей тяжелых металлов и серебряных наночастиц, полученных методом химического восстановления.

Цель работы заключается в оценке токсического эффекта, вызываемого тяжелыми металлами и серебряными наночастицами на P. caudatum.

Задачи исследования:

1. Определение токсического эффекта солей тяжелых металлов на P. caudatum.

2. Определение токсического эффекта наночастиц серебра на P. caudatum.

Методологические основы исследования. Исследование носит экспериментальный характер. В ходе работы был разработан и оптимизирован рабочий протокол, позволяющий оценивать токсичность химических соединений и материалов по отношению к P. caudatum. Анализ применим практически к любым химическим соединениям (органические и неорганические вещества, гидрофильные и липофильные соединения), а также к наночастицам. Все эксперименты были выполнены на базе биохимической лаборатории Волгоградского государственного университета.

металл серебро наночастица токсичность инфузория



ГЛАВА 1. Теоретические основы исследования

1.1 Paramecium caudatum как тест-организм

Наиболее типичной моделью для оценки загрязнения природных вод выступают простейшие животные, в частности инфузории-туфельки. P. caudatum относится к классу Ресничных инфузорий. Это наиболее сложно устроенные простейшие, очень чувствительные к изменениям химического состава среды.

Парамеции могут быть легко культивируемы в лабораторных условиях, что делает их идеальным модельным организмом, хорошо подходящим для биологического исследования [17].

Средой обитания инфузории туфельки являются пресные водоемы со стоячей водой и наличием в воде разлагающихся органических веществ. Размеры парамеции хвостатой -- 0,2-0,3 мм. Форма тела напоминает подошву туфли. Пелликула (наружный плотный слой цитоплазмы) включает находящиеся под наружной мембраной плоские мембранные цистерны, альвеолы, микротрубочки и другие элементы цитоскелета [2].

Органами движения парамеций служат реснички (10-15 тыс.), расположенные на поверхности клетки продольными рядами. Трихоцисты - мелкие веретеновидные тельца, расположенные между ресничками, являются органоидами защиты. По стенкам ротовой впадины, или перистома, расположены реснички, собранные в две группы. Они загоняют в глотку вместе с потоком воды основную пищу инфузорий -- бактерии. Наряду с бактериями они могут заглатывать и любые другие взвешенные в воде частицы независимо от их питательности. Мелкие пищевые частицы проникают через рот в небольшую трубковидную глотку и попадают в фагосому, в которой подвергаются перевариванию. Непереваренные остатки пищи выбрасываются наружу в задней части тела через цитопиг, или порошицу. Парамеции дышат всей поверхностью клетки. Продукты азотистого обмена выводятся через поверхность клетки и частично через сократительную вакуоль. Излишки воды выводятся из клетки за счет работы сократительных вакуолей, выполняющих осморегуляторную функцию [8].

Инфузории имеют два рода ядер: большое эллипсоидальное ядро называется макронуклеус, регулирующее клеточный метаболизм и одно маленькое ядро - микронуклеус, участвующее в половом процессе.

Макронуклеусы богаты ДНК и обладают высокой плоидностью в отличие от диплоидного микронуклеуса. В макронуклеусах происходит синтез РНК. ДНК макронуклеуса способна и к репликации. В микронуклеусах же происходит лишь репликация ДНК перед делением, а синтез РНК не осуществляется.

У инфузории-туфельки есть бесполое и половое размножение. При бесполом размножении ядра делятся на две части, и в каждой новой инфузории оказывается по одному большому и по одному малому ядру. Каждая из двух дочерних получает часть органоидов, а другие образуются заново.

При недостатке пищи или изменении температуры инфузории переходят к половому размножению, а затем могут превратиться в цисту.

При половом процессе увеличения числа особей не происходит. Две инфузории временно соединяются друг с другом. На месте соприкосновения оболочка растворяется, и между животными образуется соединительный мостик. Большое ядро каждой инфузории исчезает. Малое ядро дважды делится. В каждой инфузории образуются четыре дочерних ядра. Три из них разрушаются, а четвёртое снова делится. В результате в каждой остаётся по два ядра. По цитоплазматическому мостику происходит обмен ядрами, и там сливается с оставшимся ядром. Вновь образовавшиеся ядра формируют большое и малое ядра, и инфузории расходятся. Такой половой процесс называется конъюгацией. Он длится около 12 часов. Половой процесс ведёт к обновлению, обмену между особями и перераспределению наследственного (генетического) материала, что увеличивает жизнестойкость организмов. (Рис.1)

Рис.1. Конъюгация P. caudatum

1. Соединение двух инфузорий (конъюгантов) друг с другом перистомальными областями с образованием в месте контакта цитоплазматического мостика, соединяющего обе инфузории.

2. Первое деление микронуклеуса.

3, 4. Второе деление микронуклеусов.

5. Дегенерация 3-х ядер из 4-х, деление оставшихся ядер.

6. Обмен мигрирующими ядрами, стационарные ядра остаются в клетке.

7. Слияние (оплодотворение) мигрирующих и стационарных ядер, образование синкариона, расхождение особей.

8. Деление синкариона.

9. Превращение одного из двух ядер, образовавшихся в результате деления синкариона, в макронуклеус, другого - в микронуклеус.

10. Окончание реконструкции ядерного аппарата.

Основные преимущества применения данного тест - организма:

1. Культивировать этих простейших легко, они удобны в использовании, эффективны при ограниченном времени.

2. Характерная особенность инфузорий -- относительно быстрая изменчивость, которая позволяет им адаптироваться к самым разным условиям. Они приспосабливаются и к разному минеральному и органическому составу среды, а также к присутствию растворенных газов. Paramecium caudatum может жить как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

3. В биотестах на инфузориях проще всего фиксировать изменение подвижности, гибель и скорость размножения.

4. Инфузории, как и человек, - эукариотические организмы, поэтому их реакция на токсиканты может быть сопоставлена с реакцией человека.

5. С помощью инфузорий возможна оценка токсичности не только водорастворимых соединений, но и соединений, растворимых в ряде органических растворителей;

6. Короткий жизненный цикл и скорость размножения инфузорий позволяют проследить их реакцию на воздействие токсиканта в ряду поколений.

Методологические подходы в исследованиях с использованием инфузорий многообразны и зависят от целей и задач в каждом конкретном случае. В фармацевтических, медицинских, биологических и экологических исследованиях наиболее распространены методы микроскопирования, их применяют в 90% методик. Как правило, это различные модификации подсчета клеток под микроскопом. В ряде случаев фиксируют функциональные и структурные изменения как наиболее быстрые реакции инфузорий. Данный прием удобен для установления концентраций веществ, вызывающих остановку движения ресничек или полный распад (лизис) клетки. Важнейшее преимущество использования простейших в качестве тест-объектов - большое сходство их токсико-биологической реакции с этой реакцией высших животных. Принцип подобного отображения элементарных свойств сравнительно простого живого организма в более высокоорганизованном с постепенным усложнением этих свойств известен как принцип биологического эпиморфизма. Различные организмы эпиморфно проектируются друг на друга. Например, цианид калия прерывает перенос электрона в дыхательной цепи почти у всех организмов, образующих иерархическую лестницу эволюции: от одноклеточного организма до человека.

1.2 Обзор статей, посвященных токсическому действию металлов на инфузорий

На данный момент множество исследований посвящены изучению влияния металлов на животные и растительные клетки, но тонкие механизмы их токсичности до сих пор не раскрыты [5, 14]. Характерная реакция организмов на воздействие тяжелых металлов на клеточном уровне - синтез коротких пептидов-металлотионинов. Такой ответ характерен как для позвоночных, так и беспозвоночных животных, включая инфузорий. Это позволяет говорить о неспецефичности ответа. В состав металлотионинов входит аминокислота цистеин, которая благодаря своему строению проявляет высокое сродство к ионам металлов. При достижении определенных концентраций ионы металлов нарушают структуру и функционирование ферментных систем [10].

В работе Z. L. Gong с соавторами [11] было исследовано действие Zn²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺ на протяжении 24 часов на парамеций. Авторы, основываясь на результатах исследования, выявили, что Cd²⁺ - наименее токсичный, Zn²⁺ -более токсичный и Hg²⁺ - самая токсичная. Смертность парамеций имеет тесную связь с концентрацией ионов, но реакция парамеций на различные сочетания тяжелых металлов требует дальнейших исследований.

В статье ?Physiological responses of Tetrahymena pyriformis to copper, zinc, cycloheximide and Triton X-100? [16] изучены физиологические реакции тетрахимен, являющиеся ответом на действие меди, цинка, циклогексимида и тритона Х-100 (нейтральное ПАВ) в течение 48 часов. В ходе эксперимента выяснилось, что цинк более токсичен, чем медь, но это объясняется связыванием или хелатированием меди до органических соединений, тем самым уменьшается концентрация ионной меди. Тритон Х-100 убивал тетрахимен, нарушая целостность клеточной мембраны. Циклогексимид тормозил рост и размножение инфузорий, но не являлся причиной клеточной гибели.

В статье ученых из Японии [20] рассмотрено влияние никеля на парамеций. Ионы никеля пагубно влияют на микротрубочки ресничек инфузорий, что, в свою очередь, вызывает нарушения в движении ресничек.

В работе Васина Е. А с соавторами [1] исследована токсичность солей Co, Cr, Cu, Cd, Hg, Ni, Pb, Sr в виде нитратов для парамеций. Sr оказался нетоксичен для инфузорий. Оставшиеся металлы разделились на две группы: токсичные Co и Pb и высокотоксичные Cu, Hg, Cd, Ni, Cr.

В работе ?Antibacterial activity and toxicity of silver - nanosilver versus ionic silver? [12] изучена токсичность ионного серебра и серебряных наночастиц по отношению к парамециям. Ионное серебро проявляло токсическое действие, но наночастицы серебра проявляли слаботоксические свойства.

Результаты изученных статей показывают, что наиболее токсичными являются металлы, которые не имеют биологического значения и не имеют широкого распространения в природе, менее токсичные - соли биофильных металлов. Исключение представляет Cu: несмотря на то, что медь - элемент биофильный, она оказывает токсический эффект на клетки. Предположительно, данное явление объясняется высокой проницаемостью клеточной мембраны инфузорий для ионов меди.



1.3 Биологическая активность наночастиц

Биологическая активность наночастиц может быть связана с тем, что размер частиц определяет их способность легко проникать внутрь клеток из внешней среды и распределяться внутри различных тканей и органов. Один и тот же вид наночастиц может по-разному влиять на различные организмы. Например, токсичность серебряных наночастиц против одноклеточных эукариотических организмов P. caudatum значительно ниже, чем токсичность против ранее протестированных бактериальных штаммов. Дисперсия наночастиц серебра, приготовленная с помощью того же процесса восстановления, эффективно убивает бактериальные штаммы с концентрацией серебра, примерно в 3-10 раз меньше [13].

Некоторые наночастицы могут подвергаться биодеградации, при этом изменяется их биологическая и химическая активность. Другие наночастицы не претерпевают изменений и накапливаются в живых организмах. В обоих случаях возникает угроза токсического воздействия наночастиц на экосистемы. Кроме того, было установлено, что на токсические свойства металлических наночастиц помимо размера и формы, влияют кэпирующие реагенты, входящие в состав поверхностной оболочки, а также способ модификации их поверхности [13].

Наночастицы могут представлять опасность для здоровья, и степень ее пока неизвестна. Также неизвестен уровень опасности для потребителей нанопродукции и окружающей среды [9]. Поэтому оценка экологической токсичности получаемых и используемых наночастиц является чрезвычайно важным направлением [7]. Сфера таких исследований находит свое отражение в появлении государственных программ, направленных на разработку системы технических регламентов и других нормативных документов организационно-правового обеспечения безопасности и страхования рисков в области нанотехнологий [3].

Наноматериалы обладают высокой химической и биологической активностью, и поэтому способны образовывать комплексные соединения с ранее неизвестными свойствами. Это обстоятельство увеличивает технологическую перспективность нанообъектов и в то же время заставляет с особым вниманием относиться к возможным экологическим рискам.



ГЛАВА 2. Материалы и методы

2.1 Список использованных материалов и оборудования

В работе были использованы следующие материалы: хлорид натрия NaCl (Россия), хлорид калия (Россия), гидрокарбонат натрия NaHCO₃ (Россия), магния сульфат MgCO₄ (Россия), хлорид кальция (II) CaCl₂ (Россия), нитрат серебра AgNO₃ (Россия), сульфат меди (II) СuSO₄ (Россия), бихромат калия K₂Cr₂O₇ (Россия), Цинк сернокислый 7-водный ZnSO₄?7H₂O (Россия), висмут азотнокислый 5-водный Bi(NO₃)₃?5H₂O (Россия), галлотанин (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Германия), галловая кислота (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Германия), натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный Na₂HPO₄?12H₂O (Россия), дрожжи хлебопекарные сухие «Саф-Момент» (ООО «САФ-НЕВА», Россия).

При выполнении работы были использованы следующие виды лабораторного и аналитического оборудования: автоматические дозаторы фиксированного и переменного объема производства «Ленпипет» (Россия), климатостат Энерголаб (ЗАО «Спецкомплектресурс - 2001», Россия), Термостат CH-100 («BioSan», Латвия), Спектрофотометр SmartSpec Plus («Bio Rad», США), центрифуга лабораторная Scanspeed mini (Дания), микроскоп МИКМЕД 5 LED (Россия), весы лабораторные электронные Discovery (Ohaus corporation, США). В ходе планирования экспериментов и для накопления, хранения и обработки экспериментальных данных были использованы следующие пакеты программ и программные продукты: Word и Excel из пакета Office 2010 («Microsoft», США).

2.2 Культивирование модельного организма

В рамках исследования эксперименты проводились с использованием культуры P. caudatum. Культура содержалась в оптимальном температурном режиме, с освещенностью «день-ночь» (12/12). Перед проведением эксперимента культура отмывалась. Кормление происходило 2 раза в неделю.

Культура парамеций хранится в климатостате при температуре 24-26?C, в режиме обычной освещенности, в стеклянных химических стаканах на среде Лозина-Лозинского.

В качестве корма используются дрожжи хлебопекарные сухие «Саф-Момент» навеска которых (0,07 г) растворяется в 10 мл дистиллированной воды. Кормление инфузорий происходит 2 раза в неделю.

Концентрат среды Лозина-Лозинского готовится следующим образом: в дистиллированной воде растворяют (г) NaCl - 0,1; KCl - 0,01; NaHCO₃ - 0,02; MgSO₄ - 0,01; CaCl - 0,01. Для приготовления рабочего раствора среды производится десятикратное разведение дистиллированной водой исходного концентрата.

Через каждые 1-2 недели культуру инфузорий требуется отмывать от остатков корма и продуктов метаболизма. Для этого культуру инфузорий переливают в узкогорлую колбу, которую накрывают темной тканью, оставляя открытым горлышко. Средой Лозина-Лозинского доводят до верха. Через некоторое время инфузории выплывают в верхнюю часть колбы, после чего их отбирают дозатором на 10 мл и переносят в чистый стакан, а затем снова доливают средой Лозина-Лозинского. Процедура повторяется до тех пор, пока культура не станет прозрачной. После отмывки инфузорий необходимо покормить, а на стакан с ними поставить дату.

2.3 Приготовление растворов реагентов

Приготовление раствора, содержащего 1 мМ Ag⁺. Для приготовления ионного серебра взяли навеску AgNO₃ массой 0,033974 г и разбавили с 200 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 25 мкМ Ag⁺.Взяли 100 мкл раствора, содержащего 1 мМ Ag⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 0,625 мкМ Ag⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 25 мкМ Ag⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 1 мМ Cu²⁺.Навеску CuSO₄ массой 0,025 г растворили в 100 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 25 мкМ Cu²⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 1 мМ Cu²⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 0,625 мкМ Cu²⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 25 мкМ Cu²⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 1 мМ K⁺. Навеску K₂Cr₂O₇ массой 0,0294 г растворили в 100 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 25 мкМ K⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 1 мМ K⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 0,625 мкМ K⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 25 мкМ K⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 1 мМ Zn²⁺. Навеску ZnSO₄?7H₂O массой 0,0288 г разбавили с 100 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 25 кмМ Zn²⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 1 мМ Zn⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 0,625 мкМ Zn²⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 25 мкМ Zn⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 1 мМ Bi³⁺. Навеску Bi(NO₃)₃?5H₂O массой 0,0485 растворили в 100 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 25 мкМ Bi³⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 1 мМ Bi³⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 0,625 мкМ Bi³⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 25 мкМ Bi³⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление 1 мМ раствора галлотанина (ГТ). Навеску Na₂HPO₄?12H₂O массой 2 г полностью растворили в 80 мл дистиллированной воды. Довели до объема 100 мл в мерном цилиндре. Навеску галлотанина массой 0,170 г полностью растворили в 100 мл приготовленного 2% раствора Na₂HPO₄?12H₂O.

Приготовление 8,3 мМ раствора галловой кислоты (ГК). Навеску Na2HPO4?12H2O массой 2 г полностью растворили в 80 мл дистиллированной воды. Довели до объема 100 мл в мерном цилиндре. Навеску галловой кислоты массой 0,1412 г полностью растворили в 100 мл приготовленного 2% раствора Na₂HPO₄?12H₂O.

2.4 Синтез серебряных наночастиц

Метод приготовления наночастиц был основан на химическом восстановлении солей одновалентного серебра в водных растворах [4;17].

В качестве восстановителей использовали галлотанин [18] (рис.2), галловую кислоту [15] (рис. 3).

Рис.2. Галлотанин



Рис.3. Галловая кислота

Таблица 1 Соотношение реагентов для приготовления серебряных наночастиц

Реагенты	1 образец	2 образец	3 образец	4 образец
AgNO3, 1 мМ	1 мл	1 мл	1 мл	1 мл
Н2О	-	0,1 мл	-	0,1 мл
1 мМ ГТ	0,125 мл	0,025 мл	-	-
1 мМ ГК	-	-	0,125 мл	0,025 мл

Протокол фракционирования наночастиц

1. В 4 микропробирки эппендорф добавили раствор соли серебра и проинкубировали 10 минут в термостате при 37 єС.

2. Добавили остальные реагенты по таблице.

3. Инкубировали в течение 30 минут при температуре 37 °С.

4. Полученные суспензии серебряных наночастиц центрифугировали 15 минут на скорости вращения 1200 об/мин.

5. Перенесли надосадочные жидкости в новые пробирки и подписали (1/7, 2/7, 3/7 и 4/7 соответственно).

6. Пробирки 1/7, 2/7, 3/7 и 4/7 центрифугировали 15 минут на скорости вращения 7000 об/мин.

7. Перенесли надосадочные жидкости в новые пробирки (1/13, 2/13, 3/13 и 4/13).

8. В пробирки с осадком (1/7, 2/7, 3/7 и 4/7) добавили по 1 мл дистиллированной воды в каждую и аккуратно суспендировали до полного исчезновения видимого осадка. Получили образцы для исследования.

9. Надосадочную жидкость в пробирках 1/13, 2/13, 3/13 и 4/13 центрифугировали 20 минут на скорости вращения 13500 об/мин.

10. Надосадочную жидкость из пробирок 1/13, 2/13, 3/13 и 4/13 аккуратно (не затронув осадок) отобрали и выбросили.

11. В каждую пробирку 1/13, 2/13, 3/13 и 4/13 добавили по 1 мл дистиллированной воды и аккуратно суспендировали до полного исчезновения видимого осадка. Получили образцы для исследования.

12. Для дальнейшей работы из пробирок 1/7, 3/7, 1/13 и 3/13 взяли по 200 мкл суспензии в новые пробирки (подписали также, но со звездочкой, например 1/7*) и смешали с 400 мкл дистиллированной воды. Таким образом, мы примерно выравниваем концентрацию серебра с разбавленными образцами (2 и 4).

13. Получили для работы 8 образцов - 1/7*, 2/7, 3/7*, 4/7, 1/13*, 2/13, 3/13* и 4/13.

2.5 Определение токсичности химических соединений и наночастиц по отношению к P. caudatum

В ходе работы был разработан и оптимизирован рабочий протокол, позволяющий оценивать токсичность химических соединений и материалов по отношению к P. caudatum. Анализ применим практически к любым химическим соединениям (органические и неорганические вещества, гидрофильные и липофильные соединения), а также к наночастицам. Метод отличается низкой стоимостью, не требует каких-либо специальных или дорогостоящих приборов и инструментов и может быть воспроизведен в любой минимально оборудованной лаборатории. Для оценки токсического воздействия использовали два различных показателя: подвижность инфузорий и их гибель. Анализ может быть адаптирован для оценки как острого, так и хронического (до нескольких суток) воздействия проверяемых соединений/наночастиц.

Протокол оценки токсичности химических соединений и наночастиц по отношению к P. caudatum

1. Эксперимент проводили в лунках планшеты. В лунки дозатором добавляли 1,5 мл среды Лозина-Лозинского, затем с помощью микропипетки помещали инфузорий по 10 штук в каждую лунку.

2. С помощью дозатора добавляли исследуемое вещество в различных концентрациях, для этого было сформировано 6 рядов с четырехкратной повторностью. (Таблица 2)

Таблица 2

Реагенты	Ряды
	I контроль	II	III	IV	V	IV
Среда Л-Л + 10 клеток инфузорий, мл	2	1,995	1,99	1,98	1,95	1,9
Токсикант, мкл	-	5	10	20	50	100

3. Планшеты помещались в климатостат на 2 часа, при температуре 25 єС, световом облучении 1200-2500 люкс.

4. Критерием токсичности служила неподвижность или гибель инфузорий. Подсчет клеток проводился с помощью бинокулярного микроскопа МИКМЕД-5 (увеличение 40).



ГЛАВА 3. Результаты исследования

3.1 Оценка жизнеспособности инфузорий P. caudatum при воздействии растворов солей металлов

В результате контрольного опыта, при котором в лунки планшета помещали по 10 клеток инфузорий, после чего инкубировали в течение 24 часов, в некоторых лунках количество инфузорий превысило первоначальные значения. Это объясняется тем, что парамеции при стандартных условиях культивирования делятся 1-2 раза в сутки.

Для определения подвижности инфузорий провели эксперимент, в результате которого установили количество подвижных и неподвижных клеток после добавления различных концентраций токсикантов.

Результаты экспериментов показывают, что чувствительность инфузорий P.caudatum к солям Cu²⁺ лежит в диапазоне от 0,0125 до 1 мкМ. При концентрации 1 мкм соли данного металла все инфузории были неподвижны. Ионное серебро оказалось менее токсичным, чем медь. Чувствительность P.caudatum к солям Ag⁺ начала проявляться при концентрации 0,1 мкМ, однако 100% неподвижность инфузорий наблюдалась при концентрации 0,2 мкМ.

Чувствительность парамеций к солям Zn²⁺ и Bi³⁺ начала проявляться при концентрации 8 мкМ, однако при воздействии солями цинка 100% неподвижность инфузорий наблюдалась при концентрации 20 мкМ, а при воздействии солями висмута - 40 мкМ.

При воздействии на инфузорий раствором соли K⁺ изменений в их жизнеспособности не наблюдалось. Это может быть связано с процессами биохимической адаптации в клетке, связанной с низкой скоростью инактивации ферментов, что также объясняет устойчивость инфузорий к действию Bi и Zn.



Сравнение токсичности исследуемых солей представлено на рисунке 4.

Рис.4. Сравнение токсичности исследуемых солей: А) при концентрации 0,1 мкМ; Б) при концентрации 8 мкМ.

Для более точной оценки токсичности при помощи программы Very Simple IC₅₀ Tool Kit была рассчитана полуингибирующая концентрация для подвижности инфузорий (EC₅₀) для солей, проявивших токсичные свойства (Таблица 3).



Таблица 3 Сводная таблица значений EC₅₀ для солей металлов

Токсикант	EC50(мкМ)
CuSO4	0,035 +/- 0,006
AgNO3	0,097 +/- 0,0003
ZnSO4	8,245 +/- 5,782
Bi(NO3)3	47,293 +/- 4,553

Исходя из полученных результатов, исследуемые металлы были расположены в порядке убывания их токсического воздействия на P. caudatum: Cu²⁺ > Ag⁺ > Zn²⁺> Bi³⁺.

3.2 Оценка жизнеспособности инфузорий P. caudatum при воздействии наночастиц серебра

Токсичность наночастиц серебра определяли тем же методом, что и токсичность металлов.

Образцы наночастиц, полученные с использованием в качестве восстановителя галловой кислоты 3/7*, 3/13*, не проявили токсичных свойств по отношению к парамециям на всем концентрационном ряду от 2 мкМ до 40 мкМ.

Чувствительность инфузорий к образцам наночастиц, восстановленных галлотанином (1/7*, 2/7) и галловой кислотой (4/7), и фракционированных на скорости 7000 об/мин лежит в диапазоне от 4 мкМ до 40 мкМ.

Чувствительность инфузорий к образцам наночастиц, восстановленных галлотанином (1/13*, 2/13) и галловой кислотой (4/13), и фракционированных на скорости 13500 об/мин лежит в диапазоне от 8 мкМ до 40 мкМ.

При помощи программы Very Simple IC50 Tool Kit была рассчитана полуингибирующая концентрация для подвижности инфузорий (EC₅₀) для образцов наночастиц, проявивших токсичные свойства. (Таблица 4)



Таблица 4 Сводная таблица значений EC₅₀ для наночастиц серебра

Токсикант	EC50 (мкМ)
4/7	1,882 +/- 3,616
2/7	1,882 +/- 3,616
1/7*	4,136
1/13*	4,088
4/13	12,758
2/13	40,601

Сравнение токсичности образцов наночастиц представлено на рисунке 5.

Рис.5. Сравнение токсичности образцов наночастиц: А) при концентрации 4 мкМ; Б) при концентрации 20 мкМ



С помощью спектрофотометра SmartSpec^TM Plus ("Bio-Rad", США) в диапазоне длин волн 340-700 нм были получены спектры серебряных наночастиц восстановленных галлотанином. (рис.6,7)

Рис.6. Спектры поглощения наночастиц, восстановленных галлотанином, осажденных на скорости 7000 об/мин.: А) образец 1/7*;Б) образец 2/7; В) образец 4/7.



Рис.7. Спектры поглощения наночастиц, восстановленных галлотанином, осажденных на скорости 13500 об/мин.: А) образец 1/13*; Б) образец 2/13; В) образец 4/13.



ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На данный момент диапазоны чувствительности инфузорий к токсичному действию тяжелых металлов исследованы явно недостаточно. Имеющиеся по этому вопросу работы немногочисленны, а полученные в них результаты трудно сравнимы между собой из-за разных методик проведения наблюдений и использования разных критериев токсичности.

В настоящей работе был разработан рабочий протокол теста на экотоксичность, доступный для рутинного использования практически в любой лаборатории и характеризующийся низкой стоимостью анализа в сочетании с улучшенной воспроизводимостью и робастностью.

В результате исследования был получен ряд токсичности металлов для инфузорий, соответствующий литературным данным. Такое распределение металлов в ряду токсичности можно объяснить специфичностью их действия на биохимические процессы в организме инфузорий. Однако в клетке возможны процессы биохимической адаптации, связанной с низкой скоростью инактивации ферментов, что объясняет устойчивость инфузорий к действию Bi и Zn.

Также был проведен сравнительный анализ токсичности Ag⁺ (в форме нитрата) и серебряных наночастиц (AgNPs), полученных методом химического восстановления солей одновалентного серебра в водных растворах. Растворы, содержащие Ag⁺ обладали относительно высокой токсичностью по отношению к P. caudatum. Полученные серебряные наночастицы обладали низкой токсичностью по отношению к P. caudatum в сравнении с раствором ионного серебра; часть полученных наночастиц была полностью нетоксична для P. caudatum в примененных экспериментальных условиях.



Список литературы

1.Васин, Е.А. Токсичность солей некоторых тяжелых металлов для инфузорий Paramecium caudatum в краткосрочном эксперименте /Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2009. - №1(4). - С. 804-807.

2.Класс инфузории (Infusoria, или Ciliata) // Мир животных от 24.05.16. - режим доступа: http://animalkingdom.su/books/item/f00/s00/z0000048/st017.shtml

3.Контроль наноматериалов в пищевой продукции Методические рекомендации // Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации от 24.05.16. - режим доступа: http://meganorm.ru/Data2/1/4293798/4293798756.htm

4.Крутяков, Ю.А. Синтез и свойства наночастиц серебра: достижения и перспективы / А.А. Кудринский, А.Ю. Оленин, Г.В. Лисичкин // Успехи химии. - 2008. - №3. - С. 242-269.

5.Мартин, Р. Бионеорганическая химия токсичных ионов металлов// Некоторые вопросы токсичности ионов металлов: Пер. с англ. / Под редакцией Х.Зигеля, А. Зигель. М.: Мир, 1993. - С. 25-61.

6.Методические указания по диагностике алиментарных токсикозов у рыб // Экология производства от 24.05.16. - режим доступа: http://www.ecoindustry.ru/ndocs/view/1205.html

7.Трифонова, Т. А., Экологическая безопасность наночастиц, наноматериалов и нанотехнологий : учеб. пособие / Т. А. Трифонова, Л. А. Ширкин; Владим. гос. ун-т. - Владимир: Изд-во Владим. гос. ун-та, 2009. - С. 64.

8.Шарова, И.Х. Зоология беспозвоночных. М.: ВЛАДОС, 2002. - С. 591.

9.Atiyeh, B. S. Effect of silver on burn wound infection control and healing: Review of the literature // Burns. - 2007. -№33. - P. 139-148.

10. Eriksen K.D.H Cytosolic binding of Cd, Zn, and Ni in four polychaete species /Comp. Biochem. Physiol. - 1990. - V. 95. - № 1. - P. 111-115.

11.Gong Z. Toxicity of Three Heavy Metal Pollutants of the Pharmaceutical Wastewater to Paramecium Caudatum / Advanced Materials Research. - 2014. -Vol. 937, P. 571-577.

12.Kvitek L. Antibacterial activity and toxicity of silver - nanosilver versus ionic silver / A. Panacek, R. Prucek, J. Soukupova, M. Vanickova, M. Kolar, R. Zboril// Journal of Physics. - 2011. - Vol. 304. - №1. - P. 820-829.

13.Kvitek, L. Initial Study on the Toxicity of Silver Nanoparticles (NPs) against Paramecium caudatum / M.Vanickova, A. Panacek, J. Soukupova // Phys. Chem. - 2009. - №113. - P. 4296-4300.

14. Lars, J. Hazards of heavy metal contamination /British Medical Bulletin. 2003. - V. 68. № 1. - P. 167-182.

15.Martэnez-Castanon, G. A. Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles with different sizes // Nanopart Res. - 2008. - №10. - P. 1343-1348.

16. Nicolau A. Physiological responses of Tetrahymena pyriformis to copper, zinc, cycloheximide and Triton X-100 /Mota M., Lima N. // FEMS Microbiology Ecology. - 1999. - № 30 (3). - Р. 209-216.

17. Paramecium. Protozoan genus //Encyclopaedia Britannica от 24.05.16. - Режим доступа: http://www.britannica.com/science/Paramecium

18.Shrivastava, S. R Characterization of Antiplatelet Properties of Silver Nanoparticles // ACS Nano. - 2009. - №3. - P. 1357-1364.

19.Sivaraman, S. K. A green protocol for room temperature synthesis of silver nanoparticles in seconds / I. Elango, S. Kumar, V. Santhanam // Current Scince . - 2009. - №10. - P. 1055-1059.

Takenaka Y. Identification of Two Nickel Ion-Induced Genes, NCI16 and PcGST1, in Paramecium caudatum /Eukaryot Cell. - 2014. - P. 1181-1190.

Размещено на Allbest.ru