Синтез дипептидного миметика нейротрофина BDNF

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

В настоящее время физиологически активные пептиды рассматриваются как “лекарства будущего”. Наряду с богатым спектром фармакологических свойств, этот класс соединений обладает такими важными преимуществами перед непептидными соединениями, как высокая активность, малая токсичность, невыраженность синдрома отмены и, как правило, мягкий модуляторный характер действия. На сегодняшний день имеется всего около 50 пептидных лекарственных препаратов. Использование биологически активных эндогенных пептидов в качестве лекарственных препаратов ограничено их низкой стабильностью в биологических средах и малой способностью проникать через гастро-интестинальный и гемато-энцефалический барьеры (ГЭБ). Чтобы избежать этих недостатков, при создании пептидных лекарственных препаратов используют различные приемы. Для увеличения энзиматической стабильности в структуру пептида часто вводят остатки пролина и глицина, D-аминокислоты или неприродные аминокислотные остатки, модифицируют пептидную связь [Н.Ф.Мясоедов и соавт., 2006, 2007; И.П.Ашмарин и др., 2003, 2005; М.И.Титов и соавт., 1984, 1987; Е.И.Чазов и соавт., 1984; В.И.Дейгин и соавт., 2003]. Наиболее радикальным приемом является создание непептидных пептидомиметиков. Для увеличения способности проникать через ГЭБ повышают липофильность пептида путем введения гидрофобных заместителей. Почти все эти подходы уменьшают описанные выше преимущества пептидных препаратов.

Принципиально другим подходом является использование коротких, преимущественно ди-тетрапептидов. Они, как правило, способны проникать через биологические барьеры как за счет пассивного, так и активного транспорта. Коротким пептидам присуща повышенная энзиматическая стабильность. Всё это позволяет в ряде случаев создавать на их основе перорально активные лекарственные препараты. В связи с важностью коротких физиологически активных пептидов как основы для создания нового поколения лекарственных веществ, развитие новых подходов к их поиску представляется актуальным.

В данной работе развивается подход, представляющий собой создание N-ацилдипептидных миметиков в-поворотных участков полипептидов.

В связи с высоким числом инсультов, сопровождающихся большим процентом смертности, для лечения и профилактики нейродегенеративных заболеваний необходимым является развитие лекарственных препаратов для их лечения, в первую очередь нейропротекторов (для уменьшения очага поражения). Эти препараты необходимы для лечения таких нейродегенеративных заболеваний, как болезни Альцгеймера и Паркинсона. Кроме того, в последние годы к нейродегенеративным заболеваниям стали относить такие расстройства, как эпилепсия, шизофрения, депрессия. Арсенал таких лекарственных средств на данный момент очень мал.

Важными эндогенными факторами, участвующими в противодействии нейродегенеративным заболеваниям, являются нейротрофины, такие как фактор роста нервов (NGF) и мозговой нейротрофический фактор (BDNF), на основе которых ряд зарубежных фирм и университетов пытаются создать современные нейропротективные средства [F.M.Longo et al., 1999, 2002, 2003; H.U.Saragovi et al., 2000, 2002, 2004; S.J.Pollack and S.J.Harper, 2002].

Поиск коротких пептидов, обладающих нейропротективной активностью, которые в дальнейшем могли бы стать базой для создания принципиально новых пептидных лекарственных препаратов, является актуальным.

1. Нейротрофины

Функционирование организма человека как единого целого обеспечивается различными интегральными системами биорегуляции и, прежде всего, системой межклеточной передачи информации, действующей посредством так называемых информонов - продуктов метаболизма клетки, выполняющих роль сигналов. Информоны способны в очень низких концентрациях (10-16 - 10-10М) оказывать многостороннее воздействие на организм, что привлекает к ним пристальное внимание учёных. Большинство из информонов по своей химической структуре являются пептидами или низкомолекулярными белками [1].

Нейротрофины (neurotrophin, греч. neuron - нерв, trophe - питание) - семейство секретируемых белков, отвечающих за рост нейритов, дифференцировку, выживаемость и апоптоидную смерть нейронов и выполняющих свои функции путем связывания с Trk-рецептором (tropomyosin receptor kinase), трансмембранным рецептором тирозин киназы.

2. Члены семейства нейротрофинов

Семейству нейротрофинов, включает в себя фактор роста нервов (NGF), мозговой нейротрофический фактор(BDNF), нейротрофин-3 и нейротрофин-4/5. Благодаря своей способности увеличивать выживаемость нейронов, нейротрофины рассматриваются как перспективные антинейродегенеративные средства. BDNF особенно привлекателен в этом отношении, так как он улучшает выживание и предупреждает дегенерацию популяций нейронов, вовлеченных в такие заболевания, как амиотрофический латеральный склероз (мотонейроны), сенсорные нейропатии (сенсорные нейроны), болезнь Альцгеймера (базальные холинергичекие нейроны переднего мозга), болезнь Паркинсона (дофаминергические нейроны черной субстанции). Кроме того, показано, что BDNF играет важную роль в этиологии болезни Гантингтона и депрессии

1) Фактор роста нервов (Nerve growth factor, NGF). NGF выделяется клетками периферической и центральной нервной системы. Основными мишенями для NGF являются холинергические нейроны переднего мозга, играющие значительную роль в таких функциях ЦНС, как внимание, обучение, память; большинство нейронов симпатической нервной системы [4-7].

2) Мозговой нейротрофический фактор (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF) [6,7,8]

BDNF способствует выживаемости нейронов дорсального спинного ганглия (ДСГ) в культуре и препятствует их гибели, если вводится in vivo эмбрионам во время периода естественной гибели нейронов. Популяциями клеток, чувствительными к BDNF, являются дофаминергические нейроны черной субстанции, мотонейроны, нейроны реснитчатого ганглия, ГАМК-ергические нейроны переднего, промежуточного мозга и стриатума, нейроны гиппокампа, некоторые сенсорные нейроны периферической нервной системы, холинергические нейроны переднего мозга.

Также было показано, что экспрессия BDNF изменяется в моделях депрессии и при обработке антидепрессантами. Экзогенное введение BDNF в дорсальный шов крыс вызывает антидепрессивное действие. Стрессы, которые вызывают депрессию, приводят к изменению экспрессии информационной РНК BDNF, а обработка антидепрессантами вызывает возрастание информационной РНК BDNF. Возможно, что правильное лечение депрессии поднимает до нормального уровня экспрессию BDNF, который, в свою очередь, вызывает рост нейронов и воспроизводство синапсов [9] Эти результаты наводят на мысль, что сам BDNF или его миметики могли бы представлять новый класс антидепрессантов.

3) Нейротрофин-3 (Neurotrophin-3, NT-3) NT-3 способствует созреванию и выживаемости дофаминергических и ГАМК-ергических нейронов среднего мозга, нейронов гиппокампа, мотонейронов спинного мозга, мышечных сенсорных нейронов.

4) Нейротрофин-4/5 (Neurotrophin-4/5, NT-4/5)

NT-4/5 воздействует на сенсорные нейроны, мотонейроны, нейроны реснитчатого ганглия.

5) Нейротрофин-6 (Neurotrophin-6, NT-6) и нейротрофин-7 (Neurotrophin-7, NT-7)

Представляют собой нейротрофины низших позвоночных, структурно и функционально подобные NGF.

Структура BDNF.

Кристаллографические исследования [10,11] показывают, что каждый протомер BDNF имеет семь в-тяжей, образующих 3 антипараллельные пары. При этом в-тяжи связаны 3-мя экспонированными наружу нерегулярными участками, называемыми петлями 1 (остатки 29-35), 2 (43-48) и 4 (92-98), а также серией из 3-х последовательных изгибов, или 3-й петлей (остатки 32-40). Рисунок 1 иллюстрирует строение молекулы BDNF [12].

Рисунок 1. Структура гетеродимера BDNF/NT-3 по данным РСА (файл 1B8M из Брукхавенской базы данных http://www.rcsb.org/pdb)

Рецепторы нейротрофинов.

Рецепторы факторов роста являются гликопротеинами, встроенными в плазматическую мембрану. Нейротрофины взаимодействуют с двумя типами рецепторов на поверхности нейронов-мишеней: тирозинкиназным и p75 рецепторами.

Тирозинкиназные рецепторы.

Хотя высокоаффинные рецепторы к NGF обычно расположены только на нейронах, они были первоначально обнаружены в клетках карциномы толстой кишки человека как часть продукта онкогена trk [13]. Аналог онкогена trk, находящийся в нормальных клетках, кодирует белок, называемый р140prototrk или просто Trk. Тирозинкиназные, Trk, рецепторы (140 kDa) являются высокоаффинными рецепторами нейротрофинов [14].

Рисунок 2. Нейротрофины и их рецепторы

Механизм передачи сигнала посредством Trk рецепторов и биологические ответы.

После связывания нейротрофинов с высокоаффинным рецептором он поступает в везикулы и путем ретроградного аксонального транспорта переносится в тело нейрона. Ретроградный аксональный транспорт белков из терминалей в тело клеток представляет собой крайне важный процесс, потому что он позволяет нейронам получать информацию о внешней среде, окружающей нервные терминали, и соответствующим образом реагировать на многочисленные внеклеточные сигналы. Нарушение аксонального транспорта является одной из причин развития нейродегенеративных патологий [19].

Механизм связывания нейротрофиновых факторов с рецепторами включает следующие процессы [19,40]:

1. Связывание лиганда с экстраклеточным доменом (рис. 3);

2. Димеризация рецептора и изменение конформации рецептора;

3. Передача сигнала на цитоплазматический домен по трансмембранному домену;

Рисунок 3. Связывание BDNF с TrkВ

4. В результате активации цитоплазматического домена путем фосфорилирования С-концевых остатков тирозина образуются участки для связывания белков-субстратов (эффекторных молекул), содержащих SH2-SH3- домены (src homology domain) и лежащих вблизи цитоплазматического домена Trk рецептора.

Таким образом, связывание нейротрофинов со своими рецепторами приводит к димеризации рецептора и самофосфорилированию.

Далее активированный рецептор инициирует дальнейшую передачу сигнала по каскадному пути с помощью системы вторичных посредников, благодаря которым сигнал достигает ядра клетки.

Рецептор р75.

Структура р75 рецептора.

Все нейротрофины связываются с относительно одинаковой и низкой аффиностью с мембранным низкоаффинным рецептором к нейротрофинам р75NTR (75 kDa) [20,21,24-26]. Этот рецептор экспрессируется как в нейрональных, так и в ненейрональных клетках.

Функция р75 до конца не установлена и является Trk-регуляторной или апоптоидной.

5. Функции BDNF

Существует большой объем данных по нейропротективным эффектам нейротрофинов в животных моделях нейродегенеративных заболеваний. Например, NGF препятствует разрушению нейронов, вызванному стрептозотоцином в моделях диабетов. Есть сведения, что NGF и BDNF вовлечены в патогенез таких заболеваний как болезни Альцгеймера и Паркинсона. BDNF продемонстрировал значительные эффекты в ряде животных моделей бокового амиотрофического склероза и ишемии. Кроме того, BDNF оказал довольно сильный положительный эффект в моделях инсульта, что является сейчас крайне важным его свойством, остро востребованным в сегодняшней фармакологической практике [23,24].

Недавно стало очевидно, что BDNF играет роль в долгосрочном потенциировании и синаптической пластичности. Предполагается, что он может играть роль в образовании памяти и извлечении, проявляет антидепрессивную активность [49-51].

Последние данные о гетерозиготном BDNF мышей наводят на мысль о возможной роли BDNF в пищевом поведении и двигательной активности в зрелой ЦНС. Мыши, экспрессирующие только одну копию гена BDNF, демонстрируют отклонения в пищевом поведении и двигательной активности. Большая часть животных со временем становится тучными, несмотря на то, что они также проявляют повышенную двигательную активность [28]. Отсюда следует, что ожирение является другой потенциальной терапевтической целью для BDNF или его миметиков.

Обобщая, можно сказать, что BDNF (или вещества с его активностью) мог бы быть полезен при лечении нейродегенеративных болезней, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, шизофрения, последствия инсульта, ишемия и т.п., депрессивных состояний, ожирения [29,30]. С помощью BDNF можно было бы также влиять на процессы памяти и двигательную активность.

Эти положительные результаты поощрили использование BDNF в клинических испытаниях. Но проведённые испытания для самого BDNF не показали значительного (а зачастую, и никакого) полезного эффекта, побочные же эффекты были весьма сильны.

Хотя испытания были основаны на положительных экспериментальных данных на животных моделях, процедуры введения соединения непосредственно в мозг неприемлемы для людей, а при системном применении белки, биологически не стабильны, не преодоливают гемато-энцефалический барьер и могут вызвать иммунную реакцию. Очень важным препятствием является крайне высокая цена BDNF - сотни тысяч долларов за грамм.

Однако, все же, так как BDNF показывает такие многообещающие перспективы, были предприняты некоторые стратегии с целью преодолеть его плохую фармакокинетику.

Первая из них включает микроинкапсулированные медленнодействующие имплантанты, клеточную терапию и генную терапию. Генная терапия включает вирусное действие нейротрофина in vivo или ex vivo в стволовых клетках, впоследствии имплантируемых в желаемый регион. Каждый из этих подходов требует хирургического вмешательства, что составляет их главную техническую трудность [31].

Другая стратегия - это модификация нейротрофина для повышения его биологической доступности и транспорта через гемато-энцефалический барьер.

Окончательно, создание низкомолекулярных миметиков нейротрофинов избавило бы от необходимости белкового фактора и всех потенциальных проблем, связанных с ним. Достоинства, такие как биологическая усвояемость при оральном применении, проницаемость через гемато-энцефалический барьер и подходящий период распада могли бы быть спроектированы в этих молекулах. Такие нейротрофиновые миметики впоследствии могли бы стать лекарственными препаратами для улучшения памяти, лечения пациентов с нейродегенеративными болезнями, депрессией.

Существует ряд путей предвидения малых молекул, которые могут влиять на нейротрофиновый сигналинг. Соединения могут активировать Trk-рецепторы непосредственно или опосредованно или каким-либо образом усиливать активацию эндогенных нейротрофинов, которые могут присутствовать в концентрациях меньших оптимальных, in vivo при нейродегенеративных заболеваниях. Альтернативно, соединения могут повышать до нормального уровня экспрессию эндогенных нейротрофинов посредством действия на соответствующие механизмы транскрипции. Наконец, соединения могут оказывать влияние на сигнальные пути, которые активирует Trk-рецепторы или по-другому активировать нейротрофиновые эффекты [31].

Существует ряд сообщений, описывающих низкомолекулярные соединения, которые способны действовать как непосредственные активаторы Trk-рецептора. Циклопептидный димерный лиганд, по структуре соответствующей аминокислотной последовательности 92-97 NGF, действовал как частичный агонист TrkА. Наблюдались также небольшие эффекты с мономерным вариантом циклического пептида. Сходные данные получены для циклического варианта последовательности 92-96 NGF. Есть также данные о пептидных миметиках NT-3, причём у них также, как и у пептидных миметиков NGF, димерный циклический вариант во всех случаях оказывался активнее мономерного. Существует ещё ряд примеров низкомолекулярных соединений - миметиков непептидной природы, обладающих активностями нейротрофинов, но, несмотря на это, ни одно из них не прошло всех испытаний, необходимых для того, чтобы стать лекарством. [31].

6. Миметики BDNF

Создание соединений с физико-химическими свойствами, отличными от нейротрофинов, но способных селективно взаимодействовать с нейротрофиновыми рецепторами рассматривается как важное направление получения препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний [17,39,40].

Таким образом, на сегодняшний день получены биологически активные низкомолекулярные миметики BDNF, представляющие собой конформационно ограниченные циклические пептидные аналоги его петлеобразных участков, способные связываться с TrkA и p75 рецепторами in vitro. Однако число полученных миметиков невелико и развитие этой области пептидной химии только началось.

3. Достижения в синтезе миметиков BDNF.

На данный момент множество учёных и лабораторий по всему миру занимаются синтезом низкомолекулярных миметиков BDNF. Однако реальных успехов достигли всего три группы.

Группой австралийских исследователей сконструирован следующий ряд миметиков: мономерные моноциклические пептиды с антагонистической активностью на основе 1-й, 2-й и 4-й петель [2,3]; димерные бициклические и трициклические пептиды на основе 2-й петли с агонистической активностью [4]; циклопентапептид на основе трипептидного фрагмента 4-й петли -Lys-Lys-Arg-, созданный как лиганд р75 рецептора и усиливающий выживаемость сенсорных нейронов in vitro [5], и его липофильные производные [6].

Наши американские коллеги [7] путем имплантации фрагментов BDNF в структуру NGF нашли участок 2-й петли, -Ser-Lys-Gly-Gln-Leu-, вовлеченный в специфичное взаимодействие BDNF с trkB. На основе этой структуры была высказана фармакофорная гипотеза и методом виртуального скрининга с её использованием было просеяно 35 миллионов описанных соединений, выявлено 1785 соединений-кандидатов, число которых было уменьшено до 14 на основе критериев молекулярного веса и доступности фармакофорной части для взаимодействия с рецептором. Из этих 14 соединений 7 было коммерчески доступными. После тестирования in vitro на клеточных моделях было отобрано одно соединение на основе 1,3,5-бензолтрикарбоновой кислоты (LM22A-4). Для последнего при интраназальном введении была показана способность восстанавливать нарушенную травмой мозга пространственную память у крыс.

Ранее в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН был получен димерный дипептидный аналог 4-й петли BDNF - ГСБ-106, дипептидный фрагмент которого соответствовал центральному фрагменту бета-изгиба 4-й петли (-Ser94-Lys95-). Он обладает in vitro нейропротективной активностью в концентрациях 10-5 - 10-8 М. Для изучения влияния природы аминокислотных остатков в структуре миметика ГСБ-106 на активность, был проведен его глициновый скан. Целью данной работы является синтез глицинсодержащего миметика нейротрофина BDNF ГТ-105.

Рисунок 4. [Suc-L-Ser-L-Lys-NH(CH2)3-]2 (ГСБ-106)

информон клеточный нейротрофический спинной

Синтез гексаметилендиамида бис-(моносукцинил-серил-глицина) (HOOC-(СН2)2-СO-Ser-Gly-NH-)2(CH2)6, ГТ-105

Рисунок 5

Boc-Gly-OH. К раствору 1.50 г (20 ммоль) Gly-OH в 15мл 2н NaOH добавляли раствор 4,2 г NaHCO3 в 40мл воды и 20мл диоксана, Затем добавляли раствор 7 г (32.11 ммоль) ди-трет-бутилпирокарбоната в 10 мл диоксана. Смесь перемешивали 3 ч при комнатной температуре, затем добавляли 50 мл воды. Избыток ди-трет-бутилпирокарбоната экстрагировали петролейным эфиром (3х40 мл). Водный раствор подкисляли 30мл раствора 3% H2SO4 (7г) и, т.к. pH не дошел до необходимого значения, равного 3 (по универсальному индикатору), то порциями добавляли кристаллическую лимонную кислоту (7 г). Затем экстрагировали продукт этилацетатом (2х30мл), высушивали над Na2SO4. Растворители удаляли в вакууме. Остаток, в виде желтого маслообразного вещества, затирали под 10 мл гексана, кристаллы отфильтровывали, сушили в вакууме. Выход 3.32 г (95%). Rf 0.74 (хлороформ-метанол-вода-уксус. к-та, 15:10:2:3). т.пл. 88-89oC - лит. [Гершкович, Кибирев, 1982] т.пл. 87-88oC. Спектр 1Н-ЯМР в ДМСО-d6, , м.д.: 1.38 (м, 9Н, (CH3)3C-O-C(O)-), 3.57 (м, 2Н, СН2 Gly), 7.07 (т, Н, -NH Gly, J3=6,6).

Побочный продукт реакции - непрореагировавший ди-трет-бутилпирокарбонат, который удаляют экстракцией петролейным эфиром. Лимонная кислота растворяется частично в этилацетате и может загрязнить продукт, её удаляют промыванием этилацетатного раствора водой.

Boc-Gly-OSu. К раствору 2.10 г Boc-Gly-OH (12 ммоль) и 2.12 г N-оксисукцинимида (18.43 ммоль) в 30 мл ТГФ добавляли при 00С 3.81 (18.49 ммоль) ДЦГК в 20 мл ТГФ. Реакционную массу перемешивали 2 ч 20 мин при 00С и оставляли на 15 ч при +4С. Образовавшийся осадок отфильтровывали, растворитель отгоняли на роторном испарителе до 1/5 первоначального объема, остаток последовательно промывали 5% NaHCO3 (2х40мл), водой (2х40мл), высушивали над Na2SO4. Осушитель отфильтровывали, растворитель удаляли в вакууме. Остаток перекристаллизовывали из изопропилового спирта. Получали 2.59 г (75%) продукта в виде белых кристаллов. Rf 0.60 (хлороформ-метанол, 9:1), т.пл. 165-167C.

Спектр 1Н-ЯМР в ДМСО-d6, , м.д.: 1.38 (м, 9Н, (CH3)3C-O-C(O)-), 2.42 (м, 8H, -CH2CH2-, Suc), 3.57 (м, 2Н, СН2 Gly), 7.07 (т, Н, -NH Gly)

Побочный продукт реакции - дициклогексилмочевина, от которой избавляются отфильтровыванием охлажденного раствора ТГФ и затем во время перекристаллизации продукта из изопропилового спирта.

(Boc-Gly-NH-)2(CH2)6. К раствору 637 мг (5.49 ммоль) гексаметилендиамина в 12 мл ДМФА прибавляли раствор 2.20 г (12.64 ммоль) Boc-Gly-OSu в 5 мл ДМФА. Реакционную массу перемешивали в течение 3 ч, после чего выдерживали 15 ч при комнатной температуре. Затем к реакционной массе прибавляли 0.5 мл DMAPA (диметиламинопропиленамин) и перемешивали в течение 30 мин, упаривали до маслообразного состояния, после чего разбавляли 100 мл этилацетата. Органическую фазу промывали нас. NaCl (2х30 мл), водные фракции объединяли и промывали 50 мл этилацетата. Этилацетатные растворы объединяли, последовательно промывали 3% H2SO4 (2х50 мл), 3% K2CO3 (2x50 мл) и нас. NaCl (2х50 мл), сушили безводным Na2SO4 и упаривали. Получали 2.16 г (85%) продукта в виде бежевого порошка. Rf 0.45 (хлороформ-метанол, 9:1). т.пл. 55-57C.