Разработка тест-системы генотипирования лактобактерий на основе полимеразной цепной реакции с целью видовой идентификации штаммов

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГБОУ ВПО "Кемеровский государственный сельскохозяйственный институт"

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ЛАКТОБАКТЕРИЙ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ЦЕЛЬЮ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ

Беспоместных К.В., Терещенко Н.О.

Кемерово, Россия

Развитие отрасли биотехнологии и микробиологии в мире и в России, приводит к динамическому росту коллекции промышленных микроорганизмов, выделенных специальными методами селекции из различных источников. Для правильной идентификации и отнесения их к определенному роду, виду, подвиду, штамму используют традиционные микробиологические методы. Данный этап является важным в составлении и производстве качественных и безопасных бактериальных заквасок, концентратов, бакпрепаратов. Для контроля их качества до сих пор нет четко выработанной схемы, по которой бы определялась не только технологическая пригодность, но и безопасность использования чистых культур бактерий и бактериальных заквасок. В настоящее время идентификация молочнокислых бактерий и подтверждение их видовой принадлежности осуществляются на основе изучения морфологических, физиологических и биохимических признаков, что не всегда эффективно, особенно при работе со смешанными культурами.

Идентификация молочнокислых бактерий классическими биохимическими методами затруднена, так как предусматривает выделение чистой культуры и, соответственно, занимает достаточно длительный отрезок времени (до восьми суток), в связи с этим неудобна для микробиологических лабораторий и, тем более, не удовлетворяет требованиям текущего оперативного контроля.

Актуальной проблемой также в настоящее время является индикация и идентификация пробиотических микроорганизмов, являющихся основным компонентом препаратов-пробиотиков, БАД к пище и молочных продуктов [1]. штамм молочнокислый бактерия селекция

Для преодоления описанных проблем, связанных с трудностями выявления молочнокислых бактерий, целесообразно использование тест-системы, основанной на полимеразной цепной реакции (ПЦР) для точной идентификации микроорганизмов, входящих в состав бактериальных заквасок, бактериальных концентратов и чистых культур, используемых в производстве кисломолочной продукции.

Использование метода идентификации с применением полимеразной цепной реакции основывается на выборе специфического гена микроорганизма. Самым распространенным геном молочнокислых бактерий является ген 16S рРНК. Он несет как консервативные, так и вариабельные участки нуклеотидной последовательности, что позволяет использовать его как для определения рода, так и видовой идентификации микроорганизмов.

Использование метода полимеразной цепной реакции для видовой идентификации молочнокислых бактерий получило высокую оценку зарубежных специалистов, в нашей стране это направление не нашло еще широкого практического применения. Для решения этой проблемы необходима разработка эффективных и адаптированных к различным объектам исследований тест-систем для качественного и количественного определения состава молочнокислых бактерий [2, 3].

Цель научного исследования: изучение биохимических свойств, структуры генома, разработка тест-системы для видовой идентификации лактобактерий.

Для проведения необходимых анализов и для решения поставленных задач научно-исследовательской работы, применены основные методы исследования, отвечающие требованиям:

Культивирование лактобактерий и биохимическая идентификация

Для выращивания культур бактерий рода Lactobacillus использовали модифицированные питательные среды de Man, Rogosa, Sharpe (MRS) для выделения и культивирования L. delbrueckii subsp. bulgaricus: полужидкую, содержащую 0,15 % агара (MRS-2) и плотную, содержащую 2 % агара (MRS-4). Штаммы для молекулярногенетических исследований высевали на полужидкую среду MRS-2 и инкубировали в течение 12 часов при 37 ^оС. Полученные культуры бактерий стандартизировали спектрофотометрически (D₆₀₀=1) и использовали для выделения геномной ДНК.

Лиофильно высушенные штаммы разводили в 1 см³ стерильного физиологического раствора и 0,1 - 0,15 см³ высевали на жидкую среду MRS-2. Инкубацию проводили 2 суток при 37 ^оС. Затем выполняли разведения от 10^-1 до 10^-8 в стерильном физиологическом растворе и высевали на чашки с плотной средой MRS-4. Посев выполняли с каждого разведения. Инкубировали в течение 2-3 суток при 37 ^оС в анаэробных условиях с использованием анаэростатов и газогенерирующих пакетов GasPack (BD BBL, США). Изолированные колонии, типичные для лактобацилл, пересевали на полужидкую среду MRS-2. Через 2 суток инкубации культуры из всех пробирок использовали для постановки так называемого "пестрого ряда".

В состав "пестрого ряда" входили 14 субстратов (сахаров и многоатомных спиртов): арабиноза, целлобиоза, галактоза, лактоза, мальтоза, маннит, манноза, мелибиоза, раффиноза, салицин, сахароза, трегалоза, ксилоза, сорбит.

Бульон с бромкрезоловым пурпурным засевали 2 каплями 48-часовой культуры со среды MRS-2 с последующим встряхиванием пробирки для лучшего размешивания.

После посева испытуемого микроорганизма в каждую пробирку асептически помещали по 1 диску с соответствующим углеводом. Посевы инкубировали в течение 48 часов при 35 - 37 ^оС. Результаты учитывали через 18 и 48 часов. При выращивании на бульоне с бромкрезоловым пурпурным образующаяся кислота способствует окрашиванию среды в желтый цвет, а газ скапливается в поплавке.

Отбор проб и подготовку их к анализам осуществляли в соответствии с ГОСТ 26809-86.

Ферментационную активность культур оценивали, используя обезжиренное стерилизованное при 121 ^оС молоко. В пробирки, содержащие молоко, вносили равное количество жидкой культуры бактерий и отмечали время, в течение которого культура сквашивала молоко.

Титруемую кислотность молока-сырья определяли титриметрическим методом с применением индикатора фенолфталеина по ГОСТ 26781-85, ГОСТ 3624-92.

Способность бактерий расщеплять эскулин определяли с использованием жидкой среды следующего состава: казеиновый пептон - 0,5 %, мясной экстракт - 0,3 %, цитрат железа - 0,05 %, эскулин - 0,1 %, агар - 1,5 %, рН 6,6. Бактерии выращивались в течение 24 часов при температуре 42 ^оС. О наличии данного признака судили по потемнению среды вокруг выросших колоний и потере ею способности к флуоресценции.

Рост в среде с содержанием NaCl. Для проверки роста микроорганизмов в среде, содержащей 2 и 4 % NaCl, производят посев одной петлей 12 - 24-часовой культуры в пробирки с питательной средой. Культивирование проводят при 42 - 45 ^оС в течение 2-3 дней. Наличие роста устанавливают по помутнению среды.

Определение молочнокислых бактерий в кисломолочных продуктах

Определение культурально-морфологических признаков L. delbrueckii subsp. bulgaricus, содержащихся в кисломолочных продуктах, проводили согласно ГОСТ Р 5133199 "Продукты молочные. Йогурты. Общие технические условия".

Анализ последовательности гена 16S рРНК бактерий

В работе использовали 11 нуклеотидных последовательностей гена 16S рибосомной РНК микроорганизмов, депонированных в GenBank: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus - FJ861093.1, EU483107.1, CP000412.1, EU642554.1, FJ915706.1, EU547306.1; Lactobacillus acidophilus CP000033.3; Lactobacillus casei FM878603.1; Lactobacillus plantarum DQ480531.1; Lactobacillus paracasei GU386757.1; Lactobacillus rhamnosus AM491821.1.

Анализ последовательности ДНК, кодирующей синтез 16S pPHК, является основой филогенетического анализа бактерий. Для установления различий в последовательностях и поиск гомологичных последовательностей проводили по базе NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Множественные выравнивания последовательностей Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus проводили, используя программу ClustalW (версия 2.1).

Исследования с использованием компьютерных программ

Для сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей геномных ДНК микроорганизмов, подбора и оценки праймеров для специфической амплификации ДНК лактобактерий были использованы программы "Mega 3.0", "Mega 4.0", программа OligoCalc. Для построения филогенетического дерева использована программа ClustalW.

Компьютерный анализ подбора праймеров с использованием компьютерных программ: NSBI Blast2 - определение гомологии при изучении сиквенсов с соответствующих праймеров, Oligo 6.31 - основной расчет характеристик ПЦР, возможности образования праймерами дуплексов и вторичных структур, определение мест неспецифического праймирования на матрице, Oligonucleotide Properties Calculator - определение температуры отжига праймеров и % GC состава.

Выделение ДНК из лиофилизированных культур бактерий

ДНК из высушенной культуры бактерий выделяли с помощью "Набора для выделения геномной ДНК из бактерий" компании ЗАО "Синтол" (Москва).

Для экстракции бактериальной ДНК из лиофилизированных культур брали навеску 5 - 10 мкг. Далее ресуспендировали клетки в 300 мкл буфера (10 mM Tris HCl, pH 8,0; 50 mM глюкоза, 10 mM ЭДТА), к суспензии добавляли 3 мкл лизоцима (концентрацией 10 мг/мл). Лизировали клеточную стенку при 37 ^оС 60 мин, периодически перемешивая содержимое пробирки переворачиванием, центрифугировали смесь при 13 000 об/мин в течение 3 мин.

Далее полученный осадок ресуспендировали в 300 мкл лизирующего буфера (20 mM Tris HCl, pH 8,0; 75 mM NaCl; 1 % SDS; 10mM ЭДТА), в полученную суспензию добавляли 3 мкл РНКазы А (концентрацией 10 мг/мл). Проводили инкубацию при 37 ^оС 30 мин периодически перемешивая, охлаждали пробирки во льду 1 мин. К лизату добавляли 100 мкл раствора для осаждения белков (7,5М ацетат NH₄) и перемешивали на вортексе в течение 20 сек, затем центрифугировали смесь при 13 000 об/мин 5 мин. Супернатант, содержащий ДНК, переносили в полном объеме в чистые пробирки емкостью 1,5 мл и добавляли 300 мкл изопропанола, перемешивали содержимое переворачиванием (10 - 12 раз). Затем центрифугировали смесь при 13 000 об/мин 5 мин, аккуратно сливали супернатант и помещали пробирки перевернутыми на чистую фильтровальную бумагу. После чего добавляли в пробирки по 350 мкл 70 %-ного спирта и перемешивали переворачиванием несколько раз, чтобы промыть осадок ДНК. Окончательно промытый осадок подсушивали при 37 ^оС 15 мин до полного испарения спирта. К высушенному осадку добавляли 30 - 50 мкл 1ЧТЕ буфера, перемешивали и прогревали при 65 ^оС 5 мин. до растворения ДНК. Полученный раствор ДНК хранили при ?20 ^оС.

Выделение ДНК из молочнокислых бактерий, содержащихся в кисломолочных продуктах

ДНК из молочнокислых бактерий, содержащихся в кисломолочных продуктах, выделяли с помощью "Комплекта реагентов для выделения ДНК на сорбенте" компании ЗАО "Синтол" (Москва).

В центрифужные пробирки емкостью 1,5 мл вносили 100 мкл кисломолочного продукта и добавляли 300 мкл лизирующего раствора (реагент для лизиса клеточной стенки), хорошо перемешивали на вортексе. В смесь вносили 30 мкл суспензии в каждый образец. Суспензию хорошо перемешивали на вортексе, оставляли в покое 2 мин., затем опять перемешивали и оставляли в штативе на 5 мин для сорбции ДНК. Далее смесь центрифугировали при 5 000 об/мин 30 сек. Отбирали супернатант. К осадку добавляли 300 мкл отмывочного раствора (реагент для отмывания сорбента). Хорошо перемешивали на вортексе. Центрифугировали при 5 000 об/мин 30 сек. Отбирали супернатант. К осадку добавляли 450 мкл отмывочного раствора. Смесь перемешивали на вортексе. Центрифугировали при 5 000 об/мин 30 сек. Отбирали супернатант. К осадку добавляли 300 мкл отмывочного раствора 3. Смесь хорошо перемешивали на вортексе, центрифугировали при 5 000 об/мин 30 сек. Отбирали супернатант. Сушили сорбент при 65 ^оС в течение 2 минут. Добавляли к сорбенту 60 мкл 1ЧТЕ буфера, перемешивали на вортексе и прогревали при 65 ^оС 5 мин. Полученный раствор ДНК хранили при - 20 ^оС. Допустимо кратковременное хранение раствора ДНК при +4 ^оС.

Амплификация специфического фрагмента ДНК с использованием праймеров

Для амплификации использовали "Набор реактивов для проведения ПЦР-РВ" (ЗАО "Синтол", Москва), праймеры, специально подобранные нами и синтезированные ЗАО "Синтол".

Для проведения родоспецифичной ПЦР использовали праймеры (табл. 1).

Таблица 1. Родоспецифичные праймеры

Для проведения видоспецифичной ПЦР использовали праймеры (табл. 2).

Таблица 2. Видоспецифичные праймеры

При приготовлении реакционной смеси брали следующие объемы компонентов в расчете на одну пробирку (табл. 3).

Таблица 3. Компонентный состав ПЦР-реакционной смеси

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 0,5 мкл вносили (из расчета на каждую анализируемую пробу): 10 мкл 2,5Ч реакционной смеси, 1 мкл прямого и обратного праймеров (концентрация 10 пкмоль/мкл каждого), 0,5 мкл фермента термостабильной Taqполимеразы (концентрация 5 Е/мкл). Смесь разбавляли деионизованной водой объемом 13 мкл и осторожно перемешивали на вортексе (3 - 5 сек). Реакционную смесь осаждали кратковременным центрифугированием (10 - 15 сек) на вортексе. Анализируемую ДНК вносили по 5 мкл в микроцентрифужные пробирки с реакционной смесью для ПЦР. Отдельно вносили ДНК молочнокислой бактерии, выступающей в качестве положительного контроля. При использовании амплификатора типа "Терцик-МС 2" ("ДНК-технология", Москва) без подогрева крышки в каждую микроцентрифужную пробирку с реакционной смесью вносили по 30 мкл минерального масла для предохранения реакционной смеси от испарения водной фазы при ПЦР. Все микроцентрифужные пробирки со смесями помещали в амплификатор типа "Терцик".

Проведение электрофореза и детекции продуктов ПЦР

Приготовленную суспензию агарозы в колбе доводили до кипения в СВЧ-печи, нагревали до совершенно прозрачного состояния. Расплав охлаждали до 55 - 60 ^оС, а затем прибавляли 10 мкл раствора бромистого этидия и перемешивали. Наливали расплав агарозы на столик для заливки геля, не допуская образования воздушных пузырьков, так, чтобы зубцы гребенок были погружены наполовину. Столик с готовым агарозным гелем и гребенками переносили в камеру для электрофореза, куда наливали рабочий раствор буфера для электрофореза. Извлекали гребенки, стараясь не повредить образовавшиеся карманы. Изпод слоя минерального масла отбирали 10 мкл ПЦР-смеси и осторожно переносили в карман гелевой пластины под буфер. Туда же вносили 2-3 мкл краски-ридера (бромфеноловый синий конечной концентрации 0,2 %). Включали прибор к источнику напряжения 120 V., строго соблюдая полярность электродов. Электрофорез вели при комнатной температуре, пока краска-ридер не дойдет до противоположного края геля, обозначая фронт электрофореза. По окончании электрофореза источник напряжения отключали и вынимали пластину с гелем камеры. Пластину с гелем помещали под УФ-фильтр трансиллюминатора для детекции. Производили визуализацию и регистрацию полученных результатов с помощью системы "Vitran Photo".

По завершению научных исследований планируется выпуск инновационного продукта. Тест-система будет представлена в виде готовых пробирок с реакционной смесью и необходимыми положительными и отрицательными контрольными образцами, в которые требуется только внести выделенный образец ДНК исследуемого образца. Такая форма снижает вероятность ошибок оператора и риск контаминации реактивов при приготовлении смеси, повышает воспроизводимость результатов, а также уменьшает временные затраты и трудоемкость анализа.

Использование новой высокоэффективной технологии тест-системы, основанной на полимеразной цепной реакции для идентификации штаммов лактобактерий, содержащихся в различных источниках, а также заключенная договоренность испытательной микробиологической лаборатории с торговыми сетями позволят сделать тест-систему конкурентоспособной по сравнению с аналогичными тест-системами, как зарубежного, так и отечественного производства. Договоренность формирует приемлемый порядок заказа, механизм оплаты, процедуру доставки и возврата продукции как производителем, так и потребителем, обеспечивая гарантийный срок проведения исследований со стороны испытательной микробиологической лаборатории.

Полученные результаты необходимо использовать микробиологическим лабораториям, проводящим селекцию новых видов и штаммов молочнокислых бактерий, используемых в дальнейшем для разработки новых бактериальных препаратов и заквасок, используемых для производства кисломолочных продуктов, расширения их ассортимента, снабжения населения высококачественными молочными продуктами питания. Также полученные результаты необходимо использовать при подготовке микробиологов высшей квалификации.

Список литературы

1. Ботина С.Г. Видовая идентификация и паспортизация молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования // Молочная промышленность. - 2008. - № 3. - С. 52-54.

2. Ботина С.Г. Идентификация промышленных штаммов молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического // Генетика. - 2006. - Том 42. - № 12. - С. 1621-1635.

3. Точилина А.Г. Индикация и идентификация бактерий рода Lactobacillus с использованием полимеразной цепной реакции // Микробиология, эпидемиология и иммунобиология. - 2008. - № 3. - С. 69-73.

Размещено на Allbest.ru