Размещено на http://www.allbest.ru/

Вольский военный институт материального обеспечения

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ В РАМКАХ ДИСЦИПЛИНЫ «КОНЦЕПЦИИ СОВРЕМЕННОГО ЕСТЕСТВОЗНАНИЯ»

Слободчиков В.П., Кучер М.И., Френкель Е.Э.

Определения, обозначения и сокращения

Агробактериальная трансформация, агробактериальный перенос генов (agrobacterialtransformation, agrobacterium-mediatedgenetransfer) [греч. agros - поле и bacterion - палочка; лат. transformatio - превращение] - перенос чужеродных генов (ДНК) в реципиентный геном растений с помощью Agrobacteriumtumefaciens или A. Rhizogenes и их Ti-плазмид или Ri-плазмид, соответственно. Первоначально целевой ген клонируют в подходящем векторе, который содержит нуклеотидные последовательности Т-ДНК из Ti-плазмиды. Такая конструкция трансформируется в подходящий штамм E. coli, размножается и переносится в клетки агробактерий, содержащие Ti-плазмиду дикого типа или бинарную векторную плазмиду с генами вирулентности (vir-генами). С помощью рекомбинации целевой ген из векторной плазмиды переносится на Ti-плазмиду дикого типа или бинарную векторную плазмиду. При инкубации генетически модифицированных агробактерий с протопластами, листовыми дисками или другими частями растения vir-область Ti(Ri)-плазмиды активируется веществами, выделяемыми поврежденными клетками растения. В результате T-район, содержащий целевой ген, вырезается из рекомбинантной плазмиды и внедряется в геном растительной клетки.

Анаэробы - организмы, получающие энергию при отсутствии доступа кислорода путем субстратного фосфорилирования, конечные продукты неполного окисления субстрата при этом могут быть окислены с получением большего количества энергии в виде АТФ в присутствии конечного акцептора протонов организмами, осуществляющими окислительное фосфорилирование.

Бактериофамги или фамги (от др.-греч. ц?гщ - «пожираю») - вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис. Как правило, бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического материала одноцепочечной или двуцепочечной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК).

Вирусология - раздел микробиологии, изучающий вирусы (от латинского слова virus - яд).

Вирусная трансформация - специфические изменения, вызываемые в культивируемых invitro клетках вирусами, обладающими онкогенной активностью

Ген (др. греч. гЭнпт - род) - структурная и функциональная единица наследственности живых организмов. Ген представляет собой участок ДНК, задающий последовательность определённого полипептида либо функциональной РНК. Гены (точнее, аллели генов) определяют наследственные признаки организмов, передающиеся от родителей потомству при размножении. Среди некоторых организмов, в основном одноклеточных, встречается горизонтальный перенос генов, не связанный с размножением.

Генетика (от греч. Гензфщт - порождающий, происходящий от кого-то) - наука о закономерностях наследственности и изменчивости.

Генетическая инженерия (генная инженерия) - совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

Генотип - совокупность генов данного организма, которая, в отличие от понятия генофонд, характеризует особь, а не вид. Сходное понятие геном обозначает совокупность генов, содержащихся в гаплоидном (одинарном) наборе хромосом данного организма. Вместе с факторами внешней среды геном определяет фенотип организма.

Глифосамт [N-(фосфонометил) - глицин, C₃H₈NO₅P] - неселективный системный гербицид, использующийся для борьбы ссорняками, особенно многолетними. Занимает среди гербицидов первое место в мире по производству. В России известен под торговыми названиями «Раундап», «Глифор», «Торнадо» и «Ураган».

Горизонтальный перенос генов (ГПГ) - процесс, в котором организм передаёт генетический материал другому организму, не являющемуся его потомком. В отличие от горизонтального, о вертикальном переносе генов говорят, если организм получает генетический материал от своего предка. В области интересов генетики основное место занимает вертикальный перенос генов.

Дезоксирибонуклеиновая кислотам (ДНК) - макромолекула (одна из трёх основных, две другие - РНК и белки), обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. ДНК содержит информацию о структуре различных видов РНК и белков.

Метионин - алифатическая серосодержащая б-аминокислота, бесцветные кристаллы со специфическим неприятным запахом, растворимые в воде, входит в число незаменимых аминокислот. Содержится во многих белках и пептидах (метионин-энкефалин, метионин-окситоцин). Значительное количество метионина содержится в казеине.

Микробиология (греч. micros - малый, лат. вios - жизнь) - наука, предметом изучения которой являются микроскопические существа, называемые микроорганизмами или микробами, их биологические признаки, систематика, экология, взаимоотношения с другими организмами, населяющими нашу планету, животными, растениями и человеком. В область интересов микробиологии входит их систематика, морфология, физиология, биохимия, эволюция, роль в экосистемах, а также возможности практического использования.

МТО - материально-техническое обеспечение (Интендантство или военная логистика) - обеспечение (снабжение) вооруженных сил в мирное и военное время вооружением, боеприпасами, топливом, продовольствием и т. п., то есть комплекс мероприятий, направленных на удовлетворение финансовых, материально-технических, хозяйственных, противопожарных, автотранспортных, медицинских, торгово-бытовых и других потребностей ВС государства.

Нокаут гена (англ. geneknockout) - это метод молекулярной генетики, при котором из организма удаляют или делают неработоспособными определенные гены.

Оружие массового поражения (оружие массового уничтожения) - оружие большой поражающей способности, предназначенное для нанесения массовых потерь или разрушений на относительно больших площадях. Оружием массового поражения (ОМП) являются химическое, биологическое, ядерное оружие.

Полимерамзнаяцепнамя реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Рибонуклеиновая кислотам (РНК) - одна из трёх основных макромолекул (две другие - ДНК и белки), которые содержатся в клетках всех живых организмов.

Цитология (греч. кэфпт «клетка» и льгпт - «учение», «наука») - раздел биологии, изучающий живые клетки, их органоиды, их строение, функционирование, процессы клеточного размножения, старения и смерти.

Эритропоэтин (англ. erythropoietin, EPO) - один из гормонов почек. По химическому строению является гликопротеином. Используется как лечебное средство. В некоторых видах спорта является допингом.

Фототрофы (гр: ц?т, цщфьт свет, фсп?Ю - питание) - это организмы, которые используют свет для получения энергии. Они используют энергию света для поддержания различных метаболических процессов

Хемотромфы - организмы, получающие энергию в результате хемосинтеза - окислительно-восстановительных реакций, в которых они окисляют химические соединения, богатые энергией (как неорганические - например, молекулярный водород, серу, так и органические - углеводы, жиры, белки, парафины и более простые органические соединения), в отличие от фототрофов, получающих энергию в результате фотосинтеза.

Фредерик Сенгер (англ. Frederick Sanger; 13 августа 1918, Рендкомб, Глостершир - 19 ноября 2013) - английский биохимик, один из четырех человек, получивших сразу две Нобелевские премии, единственный ученый в истории, получивший две Нобелевские премии по химии - в 1958 и 1980 (совместно с У. Гилбертом и П. Бергом).

Уолтер Гилберт (англ. WalterGilbert; род. 21 марта 1932 года, Бостон, США) - американский физик, биохимик и молекулярный биолог, лауреат Нобелевской премии по химии.

Фаговая конверсия (лат. conversio изменение, превращение; син. лизогенная конверсия) - изменение фенотипа бактериальной клетки (антигенной характеристики, токсинообразования, чувствительности к другим фагам и т.п.), обусловленное включением в ее хромосому генома умеренного фага.

Фермемнты, или энзиммы (от лат. fermentum, греч. жэµз, ?нжхµпн - закваска) - обычно белковые молекулы или молекулы РНК (рибозимы) или их комплексы, ускоряющие (катализирующие) химические реакции в живых системах.

Вемрнер Амрбер (нем. Werner Arber; род. 3 июня 1929, Гренихен, Швейцария) - швейцарский микробиолог и генетик, лауреат Нобелевской премии в области медицины и физиологии 1978 года. Открыл рестрикционные ферменты.

Хамилтон Отанел Смит (англ. Hamilton Othanel Smith; 23 августа 1931, Нью-Йорк, США) - американский микробиолог, лауреат Нобелевской премии в области медицины и физиологии 1978 года.

Фредерик Гриффит (1879-1941) - английский генетик и врач. В 1928 г. поставил эксперимент, известный ныне как эксперимент Гриффита, которым показал существование «трансформирующего принципа», позднее идентифицированного как ДНК.

Электропорация - создание пор в бислойной липидной мембране под действием электрического поля. Это явление используется в биотехнологии для внедрения макромолекул (ДНК или РНК) в клетки млекопитающих, бактерий или растений.

ВВЕДЕНИЕ

Впервые генно-модифицированные продукты появились на рынке в начале 1990-х годов. В 1994 году коммерциализирован генетически модифицированный томат (Flavr Savr), продукции компании Calgene с повышенной «лёжкостью». Генетическая трансформация в этом случае не приводила к встраиванию какого-либо гена, а касалась исключительно удаления гена полигалактуроназы при помощи антисенс-технологии. В норме продукт этого гена способствует разрушению клеточных стенок плода в процессе хранения. Flavr Savr недолго просуществовал на рынке, поскольку существуют более дешевые конвенционные сорта с такими же свойствами. Большая часть современных генномодифицированных продуктов растительного происхождения. По состоянию на 2009 год, коммерциализированно и допущено к выращиванию как минимум в одной стране 33 вида трансгенных растений: соя - 1, кукуруза - 9, рапс - 4, хлопчатник - 12, сахарная свекла - 1, папайя - 2,тыква - 1, паприка - 1, томат - 1. На разных стадиях рассмотрения запросов на допуск находится ещё примерно 90 разных видов трансгенных растений в том числе картофель, слива, люцерна, фасоль, пшеница, земляной орех, горчица, цветная капуста, перец чили и другие.

По состоянию на 2009 год в мире 134 млн гектар были засеяны генетически модифицированными растениями (как пищевыми, так и кормовыми и техническими культурами). Это соответствовало 9 % всех культивированных плодородных земель (1,5 млрд га) (Табл. 1).

Таблица 1

Площади, занятые ГМ-культурами в разных странах

Всего в 2009 году ГМ-культуры официально культивировались в 25-ти странах, 10 из которых находятся в Южной Америке.

Генно-модифицированная соя составляла более чем 3/4 (77 %, 90 млн га) от всей выращиваемой в мире сои. Трансгенный хлопчатник занимал от 49 % от всей площади под хлопчатником, трансгенная кукуруза занимала четверть от площадей под кукурузой (26 %, 158 млн га), рапс - 21 %, 31 млн га.

По состоянию на 2013 год площади, занятые ГМ-культурами (как пищевыми, так и кормовыми и техническими) выросли до 175 млн гектаров (более 11 % от всех мировых посевных площадей). Генно-модифицированные растения выращивались в 27 странах, особенно широко - в США, Бразилии, Аргентине, Канаде, Индии, Китае, при этом начиная с 2012 года производство ГМ-сортов развивающимися странами превысило производство в промышленно развитых государствах. Из 18 миллионов фермерских хозяйств, выращивающих ГМкультуры, более 90 % приходилось на малые хозяйства в развивающихся странах. К концу 2013 года в 36 странах, регулирующих использование ГМкультур, было выдано 2833 разрешений на использование таких культур, из них 1321 - для употребления в пищу, и 918 - на корм скоту. Всего на рынок было допущено 27 ГМ-культур (336 сортов), основными культурами являлись: соя, кукуруза, хлопок, канола, картофель. Наиболее популярные изменения генома относились к устойчивости к гербицидам и к борьбе с насекомыми (в том числе оба изменения сразу).

В военной промышленности также идет применение генномодифицированных объектов, однако это выглядит скорее, как следствие появление ГМО продуктов на мировом рынке, а не как целенаправленное изучение и внедрение данной технологии в оборонную промышленность нашей страны.

Генетическая инженерия (генная инженерия) представляет собой совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология. Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого или генетически модифицированного организма. В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования. Примерами применения генной инженерии являются получение новых генетически модифицированных сортов зерновых культур, производство человеческого инсулина путём использования генномодифицированных бактерий, производство эритропоэтина в культуре клеток или новых пород экспериментальных мышей для научных исследований. Основой микробиологической, биосинтетической промышленности является бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых - способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение - аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту. Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Иногда нужны организмы, способные развиваться при повышенных температурах или в присутствии веществ, безусловно смертельных для других видов микроорганизмов, например, в зараженных радиацией участков местности или в местах применения противником оружия массового поражения.

Задача получения таких промышленных штаммов является актуадьной, для их видоизменения и отбора разработаны многочисленные приёмы активного воздействия на клетку - от обработки сильнодействующими ядами, до радиоактивного облучения. Цель этих приёмов одна - добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки. Их результат - получение многочисленных микробов-мутантов, из сотен и тысяч которых учёные потом стараются отобрать наиболее подходящие для той или иной цели. Создание приёмов химического или радиационного мутагенеза было выдающимся достижением биологии и широко применяется в современной биотехнологии.

Но их возможности ограничиваются природой самих микроорганизмов. Они не способны синтезировать ряд ценных веществ, которые накапливаются в растениях, прежде всего в лекарственных и эфирномасличных. Не могут синтезировать вещества, очень важные для жизнедеятельности животных и человека, ряд ферментов, пептидные гормоны, иммунные белки, интерфероны, да и многие более просто устроенные соединения, которые синтезируются в организмах животных и человека. Разумеется, возможности микроорганизмов далеко не исчерпаны. Из всего изобилия микроорганизмов использована наукой, и особенно промышленностью, лишь ничтожная доля. Для целей селекции микроорганизмов большой интерес представляют, например, бактерии анаэробы, способные жить в отсутствие кислорода, фототрофы, использующие энергию света подобно растениям, хемоавтотрофы, термофильные бактерии, способные жить при температуре, как обнаружилось недавно, около 110 C, и др.

И всё же ограниченность «природного материала» очевидна. Обойти ограничения пытались и пытаются с помощью культур клеток и тканей растений и животных. Это очень важный и перспективный путь, который также реализуется в биотехнологии. За последние несколько десятилетий учёные создали методы, благодаря которым отдельные клетки тканей растения или животного можно заставить расти и размножаться отдельно от организма, как клетки бактерий. Это было важное достижение - полученные культуры клеток используют для экспериментов и для промышленного получения некоторых веществ, которые с помощью бактериальных культур получить невозможно.

Во второй половине XX века было сделано несколько важных открытий и изобретений, лежащих в основе генной инженерии. Успешно завершились многолетние попытки «прочитать» ту биологическую информацию, которая «записана» в генах. Эта работа была начата английским учёным Ф. Сенгером и американским учёным У. Гилбертом. Как известно, в генах содержится информация-инструкция для синтеза в организме молекул РНК и белков, в том числе ферментов. Чтобы заставить клетку синтезировать новые, необычные для неё вещества, надо чтобы в ней синтезировались соответствующие наборы ферментов. А для этого необходимо или целенаправленно изменить находящиеся в ней гены, или ввести в неё новые, ранее отсутствовавшие гены. Изменения генов в живых клетках - это мутации. Они происходят под действием, например, мутагенов - химических ядов или излучений. Но такие изменения нельзя контролировать или направлять. Поэтому были сосредоточили усилия на разработке методов введения в клетку новых, совершенно определённых генов, нужных человеку.

Основные этапы решения генно-инженерной задачи:

1. Получение изолированного гена.

2. Введение гена в вектор для переноса в организм.

3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.

4. Преобразование клеток организма.

5. Отбор генетически модифицированных организмов (ГМО) и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.

Процесс синтеза генов в настоящее время разработан очень хорошо и даже в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей. Такой аппарат синтезирует отрезки ДНК длиной до 100-120 азотистых оснований (олигонуклеотиды). Получила распространение техника, позволяющая использовать для синтеза ДНК, в том числе мутантной, полимеразную. Термостабильный фермент, ДНК-полимераза, используется в ней для матричного синтеза ДНК, в качестве затравки которого применяют искусственно синтезированные кусочки нуклеиновой кислоты - олигонуклеотиды. Фермент обратная транскриптаза позволяет с использованием таких затравок (праймеров) синтезировать ДНК - на матрице, выделенной из клеток РНК. Синтезированная таким способом ДНК называется комплементарной (РНК) или кДНК. Изолированный, «химически чистый» ген может быть также получен из фаговой библиотеки. Так называется препарат бактериофага, в геном которого встроены случайные фрагменты из генома или кДНК, воспроизводимые фагом вместе со всей своей ДНК.

Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты - рестриктазы и лигазы, также являющиеся полезным инструментом генной инженерии. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор. За открытие рестриктаз Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит были удостоены Нобелевской премии (1978 г.).

Техника введения генов в бактерии была разработана после того, как Фредерик Гриффит открыл явление бактериальной трансформации. В основе этого явления лежит примитивный половой процесс, который у бактерий сопровождается обменом небольшими фрагментами нехромосомной ДНК, плазмидами. Плазмидные технологии легли в основу введения искусственных генов в бактериальные клетки.

Значительные трудности были связаны с введением готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных. Однако в природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок. Учёные исследовали особенности внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического материала в клетку. Такой процесс получил название трансфекция.

Если модификации подвергаются одноклеточные организмы или культуры клеток многоклеточных, то на этом этапе начинается клонирование, то есть отбор тех организмов и их потомков (клонов), которые подверглись модификации. Когда же поставлена задача получить многоклеточные организмы, то клетки с изменённым генотипом используют для вегетативного размножения растений или вводят в бластоцисты суррогатной матери, когда речь идёт о животных. В результате рождаются детеныши с изменённым или неизменным генотипом, среди которых отбирают и скрещивают между собой только те, которые проявляют ожидаемые изменения.

Применение в научных исследованиях. Нокаут гена. Для изучения функции того или иного гена может быть применен нокаут гена (англ. geneknockout). Так называется техника удаления одного или большего количества генов, что позволяет исследовать последствия подобной мутации. Для нокаута синтезируют такой же ген или его фрагмент, изменённый так, чтобы продукт гена потерял свою функцию. Основные методы реализации: цинковый палец, морфолино и TALEN. Для получения нокаутных мышей полученную генно-инженерную конструкцию вводят в эмбриональные стволовые клетки, где конструкция подвергается соматической рекомбинации и замещает нормальный ген, а измененные клетки имплантируют в бластоцисту суррогатной матери. У плодовой мушки дрозофилы мутации инициируют в большой популяции, в которой затем ищут потомство с нужной мутацией. Сходным способом получают нокаут у растений и микроорганизмов.

Искусственная экспрессия. Логичным дополнением нокаута является искусственная экспрессия, то есть добавление в организм гена, которого у него ранее не было. Этот способ генной инженерии также можно использовать для исследования функции генов. Процесс введения дополнительных генов таков же, как и при нокауте, но существующие гены не замещаются и не повреждаются.

Визуализация продуктов генов. Используется, когда задачей является изучение локализации продукта гена. Одним из способов мечения является замещение нормального гена на слитый с репортёрным элементом, например, с геном зелёного флуоресцентного белка (GFP). Этот белок, флуоресцирующий в голубом свете, используется для визуализации продукта генной модификации. Хотя такая техника удобна и полезна, ее побочными следствиями может быть частичная или полная потеря функции исследуемого белка. Более изощрённым, хотя и не столь удобным методом является добавление к изучаемому белку не столь больших олигопептидов, которые могут быть обнаружены с помощью специфических антител.

Исследование механизма экспрессии. В таких экспериментах задачей является изучение условий экспрессии гена. Особенности экспрессии зависят прежде всего от небольшого участка ДНК, расположенного перед кодирующей областью, который называется промотор и служит для связывания факторов транскрипции. Этот участок вводят в организм, поставив после него вместо собственного гена репортерный, например, GFP или фермента, катализирующего легко обнаруживаемую реакцию. Кроме того, что функционирование промотора в тканях становится хорошо заметным, такие эксперименты позволяют исследовать структуру промотора, убирая или добавляя к нему фрагменты ДНК, а также искусственно усиливать его функции.

В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.

Задача изменения генома взрослого человека несколько сложнее, чем выведение новых генноинженерных пород животных, поскольку в данном случае требуется изменить геном многочисленных клеток уже сформировавшегося организма, а не одной лишь яйцеклетки-зародыша. Для этого предлагается использовать вирусные частицы в качестве вектора. Вирусные частицы способны проникать в значительный процент клеток взрослого человека, встраивая в них свою наследственную информацию; возможно контролируемое размножение вирусных частиц в организме. При этом для уменьшения побочных эффектов учёные стараются избегать внедрения генноинженерных ДНК в клетки половых органов, тем самым избегая воздействия на будущих потомков пациента. Также стоит отметить значительную критику этой технологии в СМИ: разработка генноинженерных вирусов воспринимается многими как угроза для всего человечества.

С помощью генотерапии в будущем возможно изменение генома человека. В настоящее время эффективные методы изменения генома человека находятся на стадии разработки и испытаний на приматах. Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьёзными трудностями, однако в 2009 году эксперименты увенчались успехом: в журнале Nature появилась публикация об успешном применении генноинженерных вирусных векторов для излечения взрослого самца обезьяны от дальтонизма. В этом же году дал потомство первый генетически модифицированный примат (выращенный из модифицированной яйцеклетки) - игрунка обыкновенная.

Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.

Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем. Но если подойти в серьез к данному вопросу, то можно будет создать так называемого «солдата будущего» который будет иметь качества, которые не присуще обычному человеку. Сейчас это кажется фантастикой, однако разработки «сверхчеловека» производились в гитлеровской Германии, однако они так и не увенчались успехом.

Клеточная инженерия. Клеточная инженерия основана на культивировании растительных и животных клеток и тканей, способных вне организма производить нужные для человека вещества. Этот метод используется для клонального (бесполого) размножения ценных форм растений; для получения гибридных клеток, совмещающих свойства, например, лимфоцитов крови и опухолевых клеток, что позволяет быстро получить антитела.

Перейдем к непосредственному понятию генно-модифицированных объектов.

Генетически модифицированная пища - это продукты питания, полученные из генетически модифицированных организмов (ГМО) - растений, животных или микроорганизмов. Продукты, которые получены при помощи генетически модифицированных организмов или в состав которых входит хоть один компонент, полученный из продуктов, содержащих ГМО, также могут считаться генетически модифицированными, в зависимости от законодательства страны. Генетически модифицированные организмы получают некоторые новые свойства благодаря переносу в геном отдельных генов теоретически из любого организма (в случае трансгенеза) или из генома родственных видов (цисгенез).

Методы получения. Генетически модифицированные организмы получают методом трансформации при помощи одного из способов: агробактериальный перенос, баллистическая трансформация, электропорация или вирусная трансформация. Большая часть коммерческих трансгенных растений получена при помощи агробактериального переноса или баллистической трансформацией. Обычно для переноса используют плазмиду, которая содержит ген, работа которого придает организму заданные свойства, промотор, который регулирует включение этого гена, терминатор транскрипции, а также кассету, которая содержит селективный ген стойкости к антибиотику канамицину или гербициду. Получение трансгенных сортов нового поколения не предусматривает использование селективного гена, побочные качества которого могут рассматриваться как нежелательные. Зато генетическая конструкция может нести несколько генов, которые необходимы для комплексной работы генетической конструкции.

Цель генетического модифицирования

Генетическая модификация может давать растению и пищевому продукту, который производится из неё, целый ряд признаков. Большинство культивируемых генно-модифицированных организмов обладают устойчивостью к возбудителям болезней (к вирусам и грибам), насекомым-вредителям или к гербицидам. Это значительно облегчает культивирование, повышает шанс сохранения засевов в случае применения противником средств массового поражения или отравляющих веществ, снижает затраты на обработку ядохимикатами, а также снижает шанс не урожайности в случае неблагоприятных погодных условиях.

Экологическая война США против Вьетнама - применение армией США в ходе войны во Вьетнаме химических средств, повлёкшее многочисленные жертвы среди мирного населения и тяжёлые экологические последствия^.

За время войны армия США распылила на территории Южного Вьетнама 72 млн литров дефолиантов «Agent Orange» для уничтожения лесов, в том числе 44 млн литров, содержащих диоксин. Диоксин является стойким веществом, попадая в организм человека с водой и пищей, он вызывает различные заболевания печени и крови, массовые врождённые уродства новорожденных и нарушения нормального протекания беременности. После применения американскими военными дефолиантов уже после войны погибло несколько десятков тысяч человек. Всего во Вьетнаме насчитывается около 4,8 миллиона жертв распыления дефолиантов, в том числе три миллиона непосредственно пострадавших

Американские военные также применяли газы; вызывали искусственное облакообразование и кислотные дожди, применяя обработку облаков химикатами и закисление атмосферы; распыляли химикаты, вызывающие сильные пожары в джунглях, а также полное уничтожения засевов. Данные военные действия показывают нам, как важно исследование в области прививания качеств устойчивости растений к гербицидам и прочим различным ядохимикатам.

Большинство гербицидов действуют избирательно против нежелательных видов растений. Кроме этого существуют гербициды широкого спектра действия, которые влияют на обмен веществ всех видов растений, как, например, глифосат, глюфозинат аммония или имидазолин. Благодаря переносу гена 5енолпируват-шикимат-З-фосфатсинтазы (EPSPS) из грунтовой бактерии Agrobacteriumtumefaciens в геном растения, удалось придать признаки устойчивости к глифосату.

Перенос гена фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазы (PAT) из бактерии Streptomycesviridochromogenes обеспечил трансгенным растениям стойкость к гербициду глюфозинат аммония.

В 2008 году выращивание трансгенных растений со стойкостью к гербицидам занимало первое место в общем количестве всех выращенных трансгенных растений и составило 63 % или 79 млн из 125 млн гектаров, засеянных трансгенными растениями в мире. Подсчитано, что только выращивание трансгенной сои с устойчивостью к гербицидам с 1996 по 2007 года привело к кумулятивному уменьшению использования общего количества гербицидов на 73 тысячи тонн (4.6 %). В 2009 году стойкие к гербицидам растения потеснили сорта, устойчивые к насекомым-вредителям и несущие сразу два или три встроенных признака.

Устойчивость к насекомым. Бактериальный Bt-токсин издавна использовался в сельском хозяйстве как эффективный инсектицид. В органическом земледелии распространено использование бактериальной суспензии Bacillusthuringiensis для борьбы с насекомыми. Перенесённый в геном растения бактериальный ген cry Bt-токсина придает растению устойчивость против ряда насекомых-вредителей. Самые распространённые растения, в которые встраивают ген Bt-токсина - кукуруза (линия MON810 производства Монсанто) и хлопчатник, разработанный и предложенный Монсанто в 1996 году. Была попытка перенести ген Bt-токсина в картофель с целью борьбы с колорадским жуком, однако способ оказался неэффективным, поскольку трансгенный картофель оказался уязвимым к тле Aphidiusnigripes. Преимущество трансгенных растений в том, что внедрение генов инсектицидов непосредственно в растение не приводит к уничтожению всех насекомых (в том числе полезных) вследствие обработки полей. Недостатком является то, что инсектицид присутствует в растении перманентно, что делает невозможным его дозировку. Кроме того, в трансгенных сортах первого поколения ген экспрессируется под конститутивным промотором, поэтому продукт его гена присутствует во всех частях растения, даже в тех, которые насекомыми не поражаются. Для решения этой проблемы разрабатываются генетические конструкции под контролем специфических промоторов. В 2009 году трансгенные Bt-растения были самыми распространёнными по количеству культивированных трансгенных растений.

Устойчивость к вирусам. Не стоит исключать возможность применения противником вирусов в целях подрыва деятельности служб МТО. Вирусы вызывают целый ряд заболеваний растений и их распространение тяжело контролировать, способов химической защиты тоже не существует. Самыми эффективными способами борьбы считаются севооборот и селекция стойких сортов. Генная инженерия рассматривается как перспективная технология в разработке стойких сортов растений. Самая распространённая стратегия -косупрессия, то есть перенос в растение гена вируса, который кодирует белок его оболочки. Растение производит вирусный белок до того, как вирус в него проникнет, что стимулирует включение защитных механизмов, которые блокируют размножение вируса, в случае его проникновения в растение.

Впервые эту стратегию использовали для спасения папайной индустрии на Гавайях от вируса кольцевой папайной пятнистости. Впервые вирус был идентифицирован в 1940 году, а в 1994 он быстро распространился, в результате чего индустрия оказалась на грани полного уничтожения. В 1990 году начались интенсивные работы по трансформации папайи, которые в 1991 году увенчались успехом. Первые плоды коммерческого сорта папайи «Rainbow» были собраны в 1999 году.

Устойчивость к грибам. Нередко продукты питания подвергаются грибковым болезням и плесневению и зачастую это приводит к подрыванию боеспособности подразделений. И в этом случае генная инженерия также может решить данную проблему. Гриб Phytophthorainfestans принадлежит к группе растительных паразитов, вызывающих фитофтороз, наносящий значительные убытки при культивировании картофеля и томатов. Самый эффективный способ борьбы с фитофторой - использование фунгицидов (за сезон может требоваться до шестнадцати обработок, что серьёзно загрязняет почву) и выведение сортов, стойких к заболеванию. Методами классической селекции удалось частично перенести гены устойчивости к фитофторе в культурные сорта, однако вместе с ними переносится и ряд генов, которые кодируют нежелательные признаки.

Компания BASF разработала генно-модифицированный сорт картофеля «Fortuna», в который перенесли два гена Rpi-blb1 и Rpi-blb2 устойчивости к фитофторозу из южно-американского дикого сорта картофеля Solanumbulbocastanum. В 2006 году сорт прошёл успешное полевое испытание в Швеции, Нидерландах, Великобритании, Германии и Ирландии. В 2014 году ожидается появление этого сорта на рынке.

Устойчивость к засухе. Не всегда погодные условия оказываются благоприятными для выращивания продукции. Недостаток влаги вследствие изменения климата или отдельных засушливых периодов приводит к заметной потере урожая, особенно в регионах с неблагоприятными условиями выращивания.

Биотехнология исследует возможности для искусственной защиты растений от засухи. Например, ген cspB из особых штаммов бактерии Bacillussubtilis, устойчивых к замерзанию, также придает организму растения качество устойчивости к засухе. Компании BASF и Monsanto разработали сорта кукурузы, которые в полевых исследованиях при неблагоприятных засушливых условиях давали урожайность на 6,7-13,4 % больше, чем конвенционные сорта. Заявка на допуск подана в соответствующие инстанции стран Северной Америки, Европейского союза и Колумбии. Также эти сорта планируется привлечь к программе WaterEfficientMaizeforAfrica с 2015 до 2017 года, семенной материал фирмы будут предоставлять фермерам бесплатно.

Устойчивость к солям и алюминию. Засоление грунтов - одна из важных проблем сельскохозяйственного растениеводства. В мире около 60 млн гектаров полей имеют такие изъяны, что делает невозможным их эффективное использование. Способами генной модификации удалось получить рапс, несущий ген ионного транспортер AtNHX1 из арабидопсиса, который делает его стойким к засолению хлоридом натрия до 200 ммоль/л. Других изменений фенотипа в растении не наблюдается.

В кислых грунтах создаются благоприятные условия для освобождения из алюминиевых силикатов трёхвалентных ионов алюминия, которые являются токсичными для растений. Кислые грунты составляют до 40 % плодородных земель, что делает их непригодными для культивирования. Устойчивость к алюминию пробовали сконструировать искусственно, путём переноса в растения рапса гена митохондриальной цитрат-синтазы из арабидопсиса, но на данный момент методы по устойчивости к солям и алюминию находится в стадии научных разработок.

МОДИФИКАЦИЯ ПИЩЕВЫХ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРОДУКТА. ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВ И АМИНОКИСЛОТ

В растительной клетчатке синтез определенных аминокислот прекращается, если их концентрация достигла определенного уровня. Генно-инженерными методами в растение кукурузы перенесли бактериальный ген cordapA из Corynebacteriumglutamicum под контролем семенного промотора Glb1. Этот ген кодирует фермент лизин-нечувствительную дигидропиколинатсинтазу, которая не распознается растительными системами обратного ингибирования. Кукурузы линии LY038, разработанная компанией Монсанто, содержит увеличенное количество аминокислоты лизина, и поэтому более питательная в качестве корма для животных. Линия кукурузы LY038 коммерческая и допущена к культивированию в Австралии, Канаде, Японии, Мексике, Филиппинах и США. В Европе запрос на культивирование был подан в Нидерландах, разрешение получено в 2007 году, но в 2009 году разрешение было отозвано. Развитие данного направления позволит создать нам новые индивидуальные рационы питания, которые будут гораздо компактнее, но по своей пищевой ценности не будут уступать старым.

Изменение композиции жиров и жирных кислот. Использование незаменимых жирных кислот является важным условием для предотвращения пренатальных и неонатальных изъянов в развитии, поскольку они необходимы для нормального развития богатых молекулярными мембранами тканей головного мозга, нервной и кровеносной систем. Полинасыщенные жирные кислоты с углеродной цепочкой более 16 атомов находятся в основном в животных клетках. Например, докозагексаеновая кислота в человеческом теле не синтезируется и должна поступать в организм с едой. Производство незаменимых жирных кислот рассматривается пищевой индустрией как новый и дешевый источник питательных пищевых компонентов.

В семенах рапса в обычных условиях не присутствуют такие жирные кислоты, как арахидоновая, эйкозопентаеновая и докозагексаеновая кислота. Зато семена близкого азиатского родственника рапса - коричневой горчицы Brassicajuncea содержат линолевую и линоленовую кислоты, которые могут быть превращены за три последовательных биохимических реакции в арахидоновую и эйкозопентаеновую кислоты. Созданы трансгенные линии коричневой горчицы, в которые перенесены целые блоки (от трёх до девяти генов, которые кодируют ферменты для превращения линолевой и линоленовой кислот в арахидоновую, эйкозопентаеновую и докозагексаеновую кислоты).

Хотя урожайность этих растений, как и раньше, низкая, эти эксперименты показывают, что в принципе возможно превращение липидного метаболизма так, чтобы полиненасыщенные жирные кислоты продуцировались в масляных культурах.

Изменение композиции углеводов. Клубни картофеля содержат крахмал, находящийся в двух формах: амилозы (20-30 %) и амилопектина (70- 80 %), каждая из которых имеет свои химические и физические особенности. Амилопектин состоит из больших разветвленных молекул полисахаридов, а молекулы амилозы состоят из неразветвленных молекул. Амилопектин растворим в воде и его физические свойства больше подходят для использования в бумажной и химической промышленностях. Как правило, в производственные технологии заложены дополнительные шаги по разделению или модифицированию амилозы и амилопектин химическим, физическим или ферментативным путём.

Кампания BASF разработала технический сорт картофеля «Amflora», в котором генно-инженерным путём исключен ген грануло-связанной крахмал синтазы, которая способствует синтезу амилозы. Такой картофель накапливает в клубнях исключительно амилопектин, а поэтому технологически больше приспособлен к обработке.

Сорт «Amflora» получил допуск Европейского Союза и в 2010 году планируется засадить 20 гектаров в Германии, 80 гектаров в Швеции и 150 гектаров в Чехии.

Уменьшение аллергенности и детоксикация. Значительная часть людей имеет аллергию на определенные продукты питания, а в полевых условиях, вдали от продовольственных баз, не всегда удается создать рацион для военнослужащих умеющих аллергическую реакцию на определенные виды продуктов. Аллерген соевых бобов особо проблематичный, поскольку соевые продукты находят все более широкое использование в производстве продуктов питания в связи с высокой питательной ценностью соевых белков. Это означает, что военнослужащим с аллергией на сою все сложнее получить не аллергенные продукты питания. Кроме того, у свиней и телят, употребляющих соевые корма, также наблюдаются аллергические реакции. Пищевыми аллергенами почти всегда являются природные белки. Одним из высокоаллергенных белков семян сои является Gly-m-Bd-30-K, который составляет около 1 % от общего белка семян. Именно на этот белок реагируют больше чем 65 % аллергиков. Возможно заблокировать ген этого белка и разработать линии сои, которые не будут содержать этот аллерген.

Урожай хлопчатника на каждый килограмм волокна дает близко 1,6 кг семян, которые содержат около 20 % масла. После соевых бобов хлопчатник является вторым по количеству источником масла, пищевое применение которого ограничено высоким содержанием госсипола и других терпеноидов. Госсипол токсичен для сердца, печени, репродуктивной системы. Теоретически, 44 мегатонны семян хлопчатника ежегодно могли бы удовлетворить потребность в масле для 500 млн людей. Конвенционными методами возможно получить хлопчатник без госсипола, но в этом случае растение остается без защиты от насекомых-вредителей. Генно-инженерными методами, возможно целенаправленно прервать в семенах один из первых шагов биохимического синтеза госсипола. В этом случае содержание госсипола в семенах уменьшается на 99 %, а остальные органы растения продолжают его продуцировать, что защищает растение от насекомых.

Уменьшение аллергенности и детоксикация генно-инженерными способами находятся на стадии научных разработок.

Способы проверки на наличие ГМО. Как правило, проверка на наличие ГМО проводится при помощи способа полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР предусматривает три основных действия:

1. Искусственный синтез небольших участков ДНК, праймеров, которые комплементарны участку встроенного в организм гена, способны его химически распознать и специфически с ним связываться.

2. Когда праймеры находят целевую последовательность, запускается быстрая цепная реакция синтеза встроенного участка ДНК. Таким образом, встроенная целевая молекула ДНК копируется миллионы раз (амплифицируется).

3. Амплифицированный продукт можно обнаружить (отобразить) при помощи разных устройств. Если продукт обнаруживается, это является свидетельством, что в пробе выявлена ДНК генно-модифицированного организма.

Количественное определение на наличие ГМО: точное количество ГМО в продукте определить невозможно. Долгое время определялось только наличие ГМО в продукте: содержит продукт ГМО или нет. Относительно недавно были разработаны способы количественного определения - ПЦР в режиме реального времени, когда амплифицированный продукт помечается флуоресцентным красителем и интенсивность излучения сравнивается с откалиброванными стандартами. Однако, даже самые лучшие устройства все ещё имеют значительную погрешность.

Количественное определение на наличие ГМО возможно только тогда, когда из продукта можно выделить достаточное количество ДНК. Если возникают трудности с выделением ДНК, которая довольно неустойчивая, разрушается и теряется в процессе обработки продукта (очищение и рафинирование масла или лецитина, термическая и химическая обработка, обработка давлением), тогда количественное определение невозможно. Способы выделения ДНК в разных лабораториях могут быть разными, поэтому показатели количественного значения могут так же различаться, даже если исследуется один и тот же продукт.

Независимо от того, качественное или количественное определение используется для анализа пищевых продуктов на содержание ГМО, недостатком способа является большое количество фальш-положительных и фальшотрицательных результатов. Самые точные результаты можно получить при анализе необработанного растительного сырья.

Для качественного определения содержания ГМО иногда используют стандартизированные проверочные чип-системы. Способы определения ДНК в разных лабораториях могут отличаться, поэтому показатели количественного значения могут так же различаться, даже если анализируется один и тот же продукт, в основе чип-систем лежит принцип комплементарной гибридизации ДНК с меткой, нанесенной на чип. Ограничивающим фактором этого способа является так же эффективное выделение ДНК. Однако подобные проверочные системы не охватывают всего разнообразия ГМО и сложны их определения.

Путь к коммерциализации. В каждой стране путь к коммерциализации ГМО разный. Допуск к продаже и культивированию предусматривает разные процедуры, однако они основаны на одинаковых принципах.

Безопасность. Продукт должен быть безопасным и не представлять угрозы здоровью людей или животных. Также он должен быть безопасным для окружающей среды. Безопасность определяется согласно разработанным испытаниям, которые основываются на новейших научных знаниях и применяются с использованием современных технологических средств. Если продукт не подходит под вышеозначенные требования - он не получает разрешения на культивирование или распространение. Если с течением времени в продукте выявляются опасные свойства, он исключается с рынка.

Право выбора. Даже если ГМО получает разрешение на культивирование или распространение, потребители, фермеры и предпринимательство должны иметь право выбора - использовать его или нет. Это означает, что в перспективе должна существовать возможность производить продукцию без использования генной инженерии.

Обеспечение принципа права выбора возможно при условии соблюдения двух правил.

Маркировка. Самый важный способ для обеспечения права выбора. Где бы и каким образом ГМО не использовали, он должен быть ясно промаркирован. В таком случае потребитель имеет возможность сделать осознанный выбор.

Отслеживание. Маркировка так же необходима, даже если ГМО нельзя отследить в остаточном продукте. Это касается производителей и поставщиков продуктов. В этом случае они обязуются информировать потребителей путём выдачи ответственной документации относительно сырья.

Допуск для одной генно-модифицированной культуры в одной стране оценивается от 6 до 15 млн долларов США, сюда включены затраты на приготовление запроса, оценка молекулярных характеристик, состава и токсичности продукта, исследования на животных, характеристика белков на аллергенность, оценка агрономических качеств, разработка способов испытания, подготовка юридических документов для организации экспорта. Затраты оплачивает лицо, подающее запрос на допуск.

Риски, связанные с ГМ продуктами питания. Риск для здоровья. Установить 100% безопасность любых пищевых продуктов научно невозможно. Однако генетически-модифицированные продукты проходят подробные исследования, которые базируются на современных научных знаниях.

Пищевые аллергии, которые могут быть связаны с ГМО

Одним из возможных рисков употребления генетически модифицированной еды рассматривается её потенциальная аллергенность. Когда в геном растения встраивают новый ген, конечным результатом является синтез в растении нового белка, который может быть новым в диете. В связи с этим невозможно определить аллергенность продукта, базируясь на прошлом опыте. Теоретически, каждый протеин - потенциальный триггер аллергической реакции, если на его поверхности есть специфические места связи к IgE антителу. Антитела, являющиеся специфическими для конкретного антигена, производятся в организме индивидуума, чувствительного к аллергену. Чувствительность к аллергенам часто зависит от генетической предрасположенности, поэтому расчёты аллергического потенциала невозможно сделать с 100 %-й точностью. Новые потенциальные аллергены формируются так же в сортах конвенционной селекции, но отследить подобные аллергены очень сложно, кроме того процедура допуска конвенционных сортов к анализу на аллергенность не предусматривается.

Каждый генно-модифицированный сорт, перед тем как попасть к потребителю, проходит процедуру оценки его аллергенного потенциала. Тесты предусматривают сравнение белковой последовательности с известными аллергенами, стабильность белка во время переваривания, тесты при помощи крови от чувствительных к аллергенам индивидуумов, тесты на животных.