Культура тканей

Размещено на Allbest.ru

Области применения и историческое развитие метода

Культивирование клеток (эксплантация) - метод длительного сохранения в живом состоянии клеток, тканей, небольших органов или их частей, выделенных из организма человека, животных, бактерий или растений. 11 Большая Советская Энциклопедия. Статья «Культуры тканей».

Главным объектом с которым и работают лаборатории, используя метод культивирования клеток, это клеточные линии. Клеточные линии делятся на первичные, диплоидные и перевиваемые клеточные линии. Первичные линии, это клетки, полученные непосредственно из организма; диплоидные - способные сохранять диплоидный набор хромосом на протяжении до 100 клеточных циклов (делений), сохраняя изначальный набор хромосом22 По Хейфлику, 1965 год; перевиваемые клетки способны выдерживать неограниченно количество делений. Последний тип линий характерен преимущественно для либо опухолевых клеток, либо для одноклеточных.

Первым кто попробовал сохранять органы отдельно от организма является физиолог Рингер. Английским физиологом был разработан некий физиологический раствор, способный поддерживать биение сердец крупных животных. Однако больший вклад внес, по современным предположениям, был Вильгельм Ру, в 1885 году проводивший свои известные эксперименты по поддержанию различных органов животных, преимущественно мозга куриного эмбриона. Именно он в последствии и установил самые первые начальные принципы метода культивирования клеток.

Другой не малозначной фигурой, внесший свой крупный вклад является американский ученый Росс Гренвилл Гаррисон. Этот биолог проводил опыты зачатками нервной системы эмбрионов лягушек. В проделанном эксперименте Гаррисон поместил в кусочек лимфы зачаток нервной системы. В результате ему удалось продержать образец в пробирке несколько недель. Стоит отметить, что некоторые клетки даже начали давать нервные волокна. 33 Основано на статье «Культуры тканей» - Большая Советская Энциклопедия. Однако, как и в большинстве случаев, клетки культуры погибли.

Невольно возникает вопрос: «Почему клетки начали даже делиться, а в конечном счете все до единой погибли?» Можно подумать, что рано или поздно происходит заражение культуры из-за несовершенности методов, однако, как бы ни были хороши методы и оборудование, все нормальные клетки рано или поздно перестанут делиться и погибнут. Между прочим, по той же причине происходит старение и смерть человека.

Старение и естественная смерть заложены в генах как человека, так и всех многоклеточных организмов. Ген, активирующий выработку фермента теломеразы, отсутствует абсолютно у всех живых существ - и у растения, и у гриба. Но результат один - все эти организмы сначала перестают делиться (митоз, регенерация), стареют, ну, а после и вовсе умирают.

Сам процесс старения и апоптоза клеток называют пределом Хайфлика. А если быть точнее предел Хайфлика это количество делений, которое может пройти любая соматическая клетка. У человека предел Хайфлика равен 52. Иными словами, каждая соматическая клетка за все время жизни человека может поделиться не более пятидесяти двух раз. Эта цифра была выведена самим Хайфликом еще в 1965. Ученый отслеживал деления клеточной культуры. В его наблюдениях Хейфлик установил, что клетки, подходя к границе в 50 клеточных циклов начинают проявлять все признаки старения, а все без исключения к 52 циклу уже не делились - в последствии умирали.

Ген, вырабатывающий теломеразу активен только у ненормальных раковых клеток. Они могут делиться абсолютно неограниченно количество раз (имеется ввиду митоз, регенерация). Теоретически, люди могли бы жить абсолютно вечно, если бы удалось активировать этот ген, однако, у такой «вечной жизни» есть несколько «минусов». Если даже не думать о перенаселении, которое неизбежно случится на планете Земля, то сразу выяснится, что человек потеряет облик человека - у клеток с активированным геном теломеразы отсутствует часть естественного клеточного цикла - интерфаза. Этот период можно разделить на три условных участка: G1, S-период и G2. Во время этих этапов клетка растет и подготавливается к следующему делению, а у раковых клеток этого просто нет. Они как только разделились один раз, сразу же делятся еще раз, а после еще и еще. В результате клетки получаются ничтожно маленькими, но в невероятно большом количестве за кротчайшие сроки. Во многом из-за своей столь быстрой скорости деления раковые опухоли так и опасны.

Одним из основных методов диагностики рака у человека является именно метод культивирования клеток. Основой диагностики является способность раковых клеток делиться не только в горизонтальной плоскости, в два и более слоев в сосуде, что обусловлено отсутствием контактного торможения, в результате чего, клетки растут «друг на друге». Поэтому если взятые клетки заполняют пробирку, а не остаются только на дне, то у пациента рак того или иного органа.

Вернемся к истории. После Ру и Гаррисона метод культивирования клеток заметно был усовершенствован. Одним из ключевых открытий можно считать установление возможности выращивать клеточную культуру во взвеси, получаемую из любой твердой клеточной структуры под действием особого фермента трипсина. Этот фермент растворяет межклеточное вещество, разделяя клетки между собой. Выращивание клеток во взвешенном состоянии позволил получать линии не только в ограниченном пространстве на стенках сосудов, но и объектов прямо в растворе, состав которого теперь стал точно известен и вымерен. 44 Основано на статье из Большой Советской Энциклопедии «Культура тканей»

Позже, в середине XX века произошел сильнейший толчок, как всей медицины и фармацевтики, так и культуры клеток в частности. Причиной этому может служить общий подъем науки. Например, одним из главных фактов, повлекшим развитие данного метода является многочисленные открытия в области вирусологии.

Новые области применения, открывшиеся перед методом культивирования клеток привели к развитию данной области с новой силой. Впервые массовое выращивание клеток и вирусов стало легко достижимо, благодаря именно методу культуры клеток были получены первые чистые линии вирусного материала. А как следствие возможность проведения массовых вакцинаций населения. Первым успешным препаратом стала вакцина против полиомиелита, нашедшая огромное распространение. Ученым Эндерсу, Уэллеру и Роббинсу в последствии была присвоена Нобелевская премия, за открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей. « Помимо прочего в настоящее время выращиваются вакцины против полиомиелита, кори, эпидемического паротита, краснухи, ветрянки и многих других широко распространенных заболеваний. С недавнего времени правительство Соединенных Штатов Америки начало активное финансирование исследований по поиску лекарственных препаратов против птичьего группа H5N1 (он же HPAI A).

Помимо прочего благодаря методу удалось доказать многие законы и объяснить процессы, доказать которые ранее не удавалось. Например, многие эксперименты, требующие множество живых особей (часто человеческих), можно проводить на нескольких культурах без использования живых организмов. Помимо прочего, используя культуры возможно отслеживать не только морфологические изменения, но и биохимические, что однозначно невозможно при работе с живым человеком.

Процесс выращивания

Было бы странно говорить о методе, рассматривая только его историю и ничего не сказав о самом методе - о том как именно выращивают клетки, какие условия необходимо соблюдать и какие условия необходимы для тех или иных клеточных линий.

Все выращиваемые клетки можно разделить на две основные группы - животные и растительные. Так как происхождение и строение этих групп абсолютно разное, так же и условия и способы их выращивания тоже сильно отличаются. Для одних необходим свет - для других он абсолютно необязателен, для одних нужен один газовый баланс - для других он совсем другой и так далее. Несмотря на общую схожесть клеток одного царства, разные типы требуют различных добавок, помимо основных, которые присутствуют почти в каждой культуре, поэтому для каждой линии всегда подбирается оптимальный набор и пропорция питательных веществ и среды. Однако, можно выделить и наиболее «популярные» при культивировании вещества и добавки.

В состав питательных сред входят макро- и микроэлементы такие как натрий, фосфор, калий, кальций, сера, магний, железо, бор, цинк, медь, кобальт, марганец, йод и молибден. Другим не менее важным компонентом, добавляемым в питательные среды являются витамины. Наиболее часто используемые: В1, В6, В12, РР. В качестве питательной основы используются специальные питательные среды с продуманным составом и, зачастую, созданные под конкретную линию. В случае, когда сложная среда не требуется, могут использовать даже агар-агар с добавлением таких углеводов как сахароза, глюкоза, маннит. Для выращивания растений необходимо наличие фитогормонов (чаще всего цитокинины и ауксины в определенном соотношении).

Ауксины вызывают клеточную дедифференцировку, а цитокинины индуцируют деление дифференцированных клеток и необходимы для получения каллусных тканей - растительных не дифференцированных клеток и тканей способных дать целый организм. Большинство обучающих работ при изучении методов культивирований клеток проводятся именно на каллусных тканях - их легко получить и не особо сложно культивировать. 55 Основано на данных интернет-ресурса http://practice.biotechnolog.ru/ [ссылка действительна на 21.02.2012]

Но даже для самых простых правил всегда есть исключения. В методе культивирования клеток почти всегда этим исключением являются раковые клетки. Для них не нужны никакие гормоны. Они растут и делятся без «стимуляторов», им достаточна лишь специальная питательная среда.

Сосуды

В современных лабораториях выращивают различные виды клеток в самых разнообразных сосудах и емкостях. И конечный выбор падает обычно на наиболее характерную для аналогичных клеток среду и емкость. Наиболее часто для всех культивирований используют флаконы. Флаконы представляют собой пластиковые многогранные склянки чуть больше ладони с набором разных крышек с разными фильтрами или без таковых. Во флаконах чаще всего выращивают суспензионные культуры. Главным плюсом флаконов является достаточно большая площадь среды, заполняющей внутреннее пространство и абсолютная прозрачность сосуда, что позволяет постоянно следить за состоянием и процессами культуры используя, к примеру, инвертированный микроскоп.

Другими распространенными сосудами являются разнообразные чашки Петри. Они достаточно просты и удобны для культивирования небольших группы и отдельных клеток, что объясняет их популярность. Как и флаконы, чашки Петри имеют прозрачные дно, что удобно при отслеживании состояния культуры.

Стеклянные пробирки используются достаточно редко, однако их использование возможно для не слишком требовательных культур, не требующих регулярных пересеиваний, однако даже в таких случаях предпочитают пластиковые флаконы или чашки Петри.

Отдельная роль в методе культивирования клеток занимают так называемые фидеры («кормилки»). Обычно это сосуд на котором изначально выращивается какая-либо неприхотливая культура (например, фибропласты), а уже после того, как вырастет полноценный слой, насаждается другая, которую и необходимо вырастить. Таким образом «верхняя» культура питается не от твердой или жидкой среды, а от «нижних» клеток. Обычно эту технику применяют на раковых клетках и вирусном материале (в последнем это единственный возможный способ).

Не столько сосудом, но все же емкостью для измерения количества среды или раствора является градуированная пипетка. Она представляет собой стеклянную или чаще пластиковую трубку небольшой толщины с двумя не запаянными концами. К одному из них подключается механический или вакуумный насос, понижающий давление в трубке, что приводит к засасыванию жидкости через нижнее отверстие. Существует множество пипеток на самые разные объемы и различной точности измерений.

Питательные среды

Отдельное слово стоит сказать о питательных средах, их приготовлении и классификации.

По глобальному делению сред для культур растительного происхождения с целью дальнейшего подбора питательных сред к конкретному организму можно разделить следующим образом:

среда без глюкозы - для хлореллы, цианобактерий;

среда без витаминов и гормонов - для грибов и для ряски (Lemna) ;

среда с азотом, сахарами, витаминами и гормонами - для культивирования клеток и тканей высших растений.

Большинство сред хоть и имеют весьма «богатый» набор различных добавок и ингредиентов, но концентрации всех веществ не превышают 1, 5 грамма на литр, что очень мало, однако при приготовлении сред используют намного большие концентрации солей и прочих веществ, нежели при непосредственном пересаживании культуры на раствор. Такие рабочие растворы называются маточными (концентрированными). Объяснить необходимость высоких концентраций довольно просто. Так как нужны крайне точные концентрации ингредиентов, намного проще готовить среду при больших объемах веществ и один раз, нежели несколько раз высчитывать микродозы. Помимо этого, при больших концентрациях солей в растворах уменьшается вероятность поедания микроорганизмами питательных веществ.

Сам процесс приготовления крайне сложен. Необходимо соблюдение правильных концентраций для каждого из добавляемых веществ. А так как в большинстве своем все вещества поставляются в совершенно разных тарах и соотношениях с другими, то процесс может занимать достаточно длительное время. Стоит заострить внимание, что некоторые компоненты хранятся в разных агрегатных состояниях и совершенно разных температурах. Например, витамины хранят в сильно замороженном виде, а фитогормоны хранятся при температуре около 2-4 oC в холодильнике.

Другим параметром для выращивания растительной культуры клеток может стать агрегатное состояние среды. Ясно, что в газообразном виде культуру выращивать невозможно, а вот в жидкой или на твердой это сделать вполне реально. Основной разницей для этих двух разных путей является необходимость культуры «перемещаться» в случае с жидкостью - культуры нужно постоянно перемешивать для циркуляции кислорода и питательных веществ по сосуду. В противном случае все культура погибнет.

Несмотря на большинство просчитанных ингредиентов, многие культуры не делятся в привычных условиях. Поэтому довольно часто в стандартные среды, подобранные для культивирования, уже в лабораториях добавляют различные антибиотики, соли, элементы и прочие примеси. Поэтому иногда лаборатория при работе с малоизученным типом клеток чем-то похожа на кухню - стоит добавлять ингредиенты «по-вкусу».

Мелкие особенности

Для изучения процессов обмена веществами между организмами и средой часто используют радиоактивно-окрашенные изотопы. Особо часто применяется метод радиоактивного окрашивания при изучении скорости и путей синтезирования белков, РНК и ДНК. Процессы самого окрашивания и измерения особо сложны, что требует написания отдельной работы, что не требуется ибо на настоящий момент существует достаточно материала по данному вопросу.

Стерилизация

Особое внимание стоит отнести процессам стерилизации оборудования и питательных сред. Зачастую это является чуть ли не важнейшим аспектом в выращивании клеточных линий и культур.

Стерилизация (от лат. sterilis - бесплодный) - полное освобождение от микроорганизмов различных веществ и предметов. Осуществляется действием высоких температур, химических антисептических веществ (сулема, окись этилена и др.), ионизирующих излучений (лучевая стерилизация) и др. способами. 66 По определению из Современного толкового словаря

Существуют разные методы стерилизации, дающие разные эффекты и уничтожающие различные микроораганизмы с разной эффективностью. Основными методами являются стерилизация с помощью влажного пара, сухого пара, с использованием облучения ультрафиолетовыми лучами, обработки химическими веществами и микрофильтрации.

Одним из наиболее популярных способов обработки сред, не выдерживающих высоких температур (более 100 oC), является дробная стерилизация. Главной особенностью данного метода является сравнительная простота идеи стерилизации - высокая температура. Проводить подобную стерилизацию можно даже не в специальном оборудовании, а в простой пароварке. Минусом данного метода является неспособность подобных температур уничтожать все стадии роста живых организмов, а именно споры. Споры легко переносят термическую обработку и могут заметно испортить будущую культуру, что недопустимо, поэтому дробную стерилизацию повторяют несколько раз с промежутком в день. Зачем это нужно? Споры, оставшиеся после первичной обработки, начинают прорастать, что позволяет уничтожить их в прорастающем виде на следующий день. Для надежности процедуру повторяют не менее трех раз.

Другим популярным способом является автоклавирование. Обработка материалов происходит в специальном аппарате, способном создавать различное давление и комбинировать обработку горячим паром с повышенным давлением. В результате при такой обработке, соматические клетки растений и животных гибнут уже через 10 минут при температуре в 60 oC, а споры грибов через 15 минут при температуре в 120 oC. В принципе, казалось бы, автоклавирование продолжать чем больше, тем лучше, однако это совсем не так. Для всех физических объектов характерна так называемая теплоемкость. Величина, определяющая количество энергии, которое тело способно принять. Именно этот показатель зачастую ограничивает продолжительность и температуру автоклавирования на весьма низкие единицы.

Для посуды без каких-либо нужных веществ характерны комплексные процедуры очистки. Для начала каждый предмет моется с использованием того или иного детергента (мыло, моющее средство и т. д.), далее очищают с добавлением двухромовокислого калия (дихромат калия) в серной кислоте. Далее происходит очистка водой разной степени очистки, после чего все приборы сушатся в сушильном шкафу длительное время. После всех этих процедур предметы подготавливают к стерилизации. В качестве способов избежания заражения и оседания вредных организмов на стенках и дне сосудов, их заворачивают в плотную бумагу, затыкают плотными ватными пробками и заворачивают в фольгу. И только потом следуют вышеупомянутые способы стерилизации, иногда комбинированные и дополняющие друг друга. Иными словами, только на одну очистку посуды уходит огромное количество времени и сил.

Помимо посуды, необходимо стерилизовать и весь набор инструментов, одежду, рабочие материалы (вату, марлю и т. д.), питательные среды и даже сами культуры. Разумеется, для всех их возможны различные способы. Например, клеточные линии настолько требовательны, что ни один из вышеупомянутых способов стерилизации для клеток не годится. Для них чаще всего используют мелкую фильтровальную бумагу с расстоянием между порами 0. 45 мкм. Данным метод используют только для объектов, не переносящих нагревания.

Для инструментов, таких как ножницы или шприцы, автоклавирование невозможно в следствии того, что горячий пар при высоком давлении быстро окисляет железо и сталь, в результате чего все металлические предметы покрываются ржавчиной и быстро затупляются, что недопустимо при высокоточных операциях. Из-за невозможности автоклавирования, дезинфекция инструментов производится в сушильном шкафу. После завершения этого этапа, непосредственно перед манипуляциями, оборудование погружают в спирт, после чего прокаливают на горелке. Последние два действия повторяют после каждого действия с культурой - в целях соблюдения стерильности, разрешено не более одной манипуляции после одного прокаливания и спиртовой стерилизации.

С одеждой, ватой, фильтровальной бумагой и прочими рабочими материалами процесс стерилизации проводится намного проще. Все эти материалы в большинстве своем нормально переносят автоклавирование, что позволяет проводит этот наиболее эффективный метод. Процесс стерилизации занимает в среднем пол часа при давлении в две атмосферы.

С питательными средами все несколько сложнее. Далеко не все они способны переносить высокое давление и высокие температуры. Даже не столько этот факт мешает проводить длительную стерилизацию в автоклаве, сколько тот факт, что время процедуры сильно зависит от количества материала в сосуде - иными словами, огромное значение в выборе режима автоклавирования зависит от количества среды, подвергаемой этому процессу. Наиболее наглядным примеров неправильно выбранного режима является «помутнение» среды.

Лабораторное оборудование

Спектр оборудования, разумеется, отличается абсолютно для каждой лаборатории, однако есть незаменимое, которое в том или ином исполнении, но есть абсолютно везде. К такому оборудованию можно отнести автоклав, ламинарный бокс, холодильник, центрифугу и инкубатор.

Наиболее часто используемый прибор для сохранения чистых условий является ламинарный бокс (он же ламинар). Основным принципом его работы является определенно направленный ток воздуха, идущий из внутренней части наружу, что в определенной мере позволяет избежать заражение культуры спорами и прочими мелкими микроорганизмами. Такой тип подачи воздуха называется ламинарным. В отличии от турбулентного, все молекулы газа направлены параллельно, что позволяет равномерно удалять объекты из зоны непосредственно наружу без вероятности осаждение на стенках и дне рабочего бокса. Помимо этого, почти всегда ламинары оборудованы ультрафиолетовыми лампами - это наиболее часто используемая методика по дезинфекации помещений и крупного оборудования.

Центрифуга есть далеко не везде, однако она необходима для разделения различных жидкостей и смесей на составляющие компоненты, различные по своей удельной массе. К таким «разделимым» жидкостям можно отнести кровь. После центрифугирования невооруженным глазом видна плазма, кровяные тельца и прочее, после чего можно легко отделить одну составляющую от другой.

В качестве холодильника чаще всего используют обычный бытовой, ибо для охлаждения и хранения клеток подобного вполне достаточно. Иногда так же используют особый низкотемпературный вариант (до -1500 С). В место холодильника для глубокой заморозки используют так же жидкий азот. В замороженном состоянии все процессы жизнедеятельности практически полностью останавливаются, клетки не стареют и не развиваются.

Инкубатор (часто называемый CO2-инкубатором). Такой инкубатор не только поддерживает однородную температуру, но и точный газовый состав. Большинство животных клеток выращиваются именно в 5% СО2-среде. Объяснить это довольно просто, во-первых, наши тела содержат те же 5% углекислого газа, что и задаваемая среда, а во-вторых, это позволяет удерживать кислотно-щелочной баланс среды, не давая ей стать слишком щелочной. Инкубатор представляет собой небольшой шкафчик с подключенным к нему баллоном с углекислым газом, который подается во внутрь как только уровень падает ниже 5%.

Особое место в лабораториях занимают всевозможные лабораторные встряхиватели. Обычно это устройства, создающие на счет электрических двигателей мощные импульсы, которые перемешивают содержимое пробирок, флаконов и прочего инвентаря, что необходимо при выращивании суспензионных и некоторых других культур.

Практическое применение

Конечно, очень интересно слушать о всей сложности и увлекательности биотехнологических манипуляций, однако, какой во всем этом смысл, если от него нет никакой пользы? Казалось бы, где и как этот метод может помочь простым смертным? Оказывается, с базой этого метода сталкивался почти каждый. Более того, в роли биотехнологов выступали люди более нескольких тысяч лет назад! Другое дело, что никто из них толком и не понимал, что он делает. Приведем самый простой пример. Все знакомы с такими ежедневными продуктами как хлеб или, например, сыр. Каждым из вас примерно представляет как сделать дрожжевой хлеб. Необходимо на основу (тесто) добавить дрожжей и немного сахара. Но что же на самом деле представляет из себя этот простейший процесс? Мы добавляем микроорганизмы и питательную среду для из жизнедеятельности - сахар. В результате окисления или глюкозы образуется углекислый газ, в результате чего тесто поднимается. Даже разобрав суть этого процесса мы не всегда понимаем, что мы сделали. А ведь мы выступили именно в роли биотехнологов, синтезирующих биоматериалы.

Собственно сам процесс брожения и является старейшим примером биотехнологий на нашей планете. Таким образом можно сказать, что биотехнология зародилась как минимум восемь тысяч лет назад! Именно в шестом тысячелетии до нашей эры была написана небольшая табличка о принципе приготовления напитка, аналога пива. Другое дело, что наверняка немногие из древних людей понимали глубину совершаемых манипуляций, но это не так важно, когда сама идея создания чего-либо за счет живых существ существует уже несколько тысяч лет. 77 Основано на идеях с интернет-ресурса http://biotehnolog.ru/ [ссылка действительна на 23.02.2012]

Здорово было бы считать что и метод культивирования клеток так же зародился многие тысячи лет назад. Однако между биотехнологией и многократно упомянутом методе есть одно очень важное отличие - для биотехнологии чаще необходимы продукты жизнедеятельности организмов, что для метода культивирования клеток - сами клетки и организмы. Из-за этой особенности метод становится значительно сложнее, нежели другие манипуляции с клетками, какие предусматривает биотехнология. С другой стороны, эти эксперименты и результаты представляют собой более сложные структуры, для выращивания которых общих биотехнологических знаний явно не хватит. Таким образом можно сказать, что метод культивирования клеток является хоть и частью биотехнологии, однако он в себе заключает и другие аспекты, не являющиеся общими для биотехнологических исследований и манипуляций.

Казалось бы, если хлеб выпекать просто и главное необходимо, то почему не получают готовые органы в промышленных масштабах? Ну, если учесть то, что сложность строения хлеба и любого, даже наиболее простого органа, несоизмеримо различны, то вопрос исчезает сам собой.

Особенности искусственных органов

В настоящее время невозможно получать огромные объемы продукции, какая необходима в данным момент. Налажен синтез различных тканей (в том числе и человека), но полноценных органов пока не получено. Возможно, в будущем все станет возможным, однако в данным момент выращивание даже одного органа требует большого количества времени и материальных средств. С другой стороны, если считать, что данным метод невозможен для общества, перестать изучать его и совершенствовать, то вряд ли удастся создавать органы, не требующие подавления иммунологической реакции, которую оказывает организм на все чужеродные объекты. А ведь из-за этой реакции иногда не удается спасать людям жизни - организм отторгает искусственные органы или органы другого человека, что ведет к чудовищным последствиям - начиная от воспалительного процесса заканчивая летальным исходом.

Используя органы, созданные с использованием данной технологии, возможно отказ от веществ подавляющих иммунологическую реакцию так как можно будет выращивать органы из генного материала самого пациента, в результате чего отторгающей реакции не будет, что несомненно позволит выращивать полноценные органы, после пересадки которых осложнения если и будут, то в минимальном количестве и не опасные для жизни пациента. Если удастся сократить расходы и поставить технологию на промышленный масштаб, то пациентов использующих временные заменители человеческих органов почти не останется, что позволит спасать жизни людям даже с серьезными генетическими и, возможно, с геномными отклонениями, что наверняка сделает мир лучшим местом.

Практическое применение

Все теоретически возможные пути применения всегда хороши, однако, от них нет никакой пользы, пока они остаются лишь мечтами. От метода должна всегда быть конкретная польза. Для данного метода она, несомненно, есть. Даже если не брать во внимание все то множество препаратов, спасших миллионы человеческих жизней, таких как вакцины от полиомиелита, кори, в настоящее время получено множество различных образцов тканей как человека, так и других животных. Получены линии клеточного материала растений, в том числе редких. Многие ферменты растений, пользующихся огромным спросом на рынке парфюмерной продукции, получают именно этим методом. Если представить, что пришлось бы отказаться от метода культивирования клеток, то многие виды редких растений были бы полностью истреблены за кротчайшие сроки, чего, к счастью, не происходит.

Многие жизненно необходимые человеческие органы уже почти полностью воссозданы, однако, пока для пересадки они не годятся, хотя бы потому, что риск проблем с малоизученным материалом может быть слишком много, что недопустимо при работе с человеком. Тем не менее, уже выращены экспериментальные образцы таких тканей как костная ткань (зуба, например), мышечное волокно, ткань легких, молочную железу, часть почки человека.

Искусственный эпидермис

Единственной полностью проработанной и неоднократно применяемой технологией по выращиванию тканей, является методика по пересадке кожи (эпидермы в частности).

В Американских клиниках производились многократные пересадки культивированных участков кожи пациентам. Считается, что заранее выращенная ткань дает намного меньше рубцов и быстрее покрывает поврежденный участок, чем естественно регенерирующая ткань человека. При особо сильных повреждениях (например, ожогах 3-4 степени), это может стать единственным способом спасти жизнь. Так как обычно выгорает не только поверхность кожи, но и толща тканей, то без капиллярной системы регенерация практически не будет происходить, а с помощью искусственно культивированной дермы возможно начать процессы восстановления почти сразу после пересадки.

При культивировании клеток кожи человека мелкий образец, полученный у пациента, сначала расслаивают, получая слой эпидермиса, потом добавляют такие ферменты как трипсин для разделения клеток. Полученные клетки «сажают» во флаконы, где они растут чуть меньше недели. Потом из сновы выделяют из флаконов, заново разделяя и снова культивируя. Так культивирование занимает от двух до трех недель, что позволяет получать не менее 100 см2 полноценной культуры кожи за неделю, составленной из донорских клеток.

Помимо попыток собрать органы или эпителиальную ткань, с помощью этого метода выращиваются штаммы вирусного материала и клетки возбудителей различных заболеваний. Таким образом необходимость «собирать» массу биологически опасных мутагенов отпадает. Достаточно создать условия для размножения того или иного микроорганизма, и он сам создаст необходимое количество себе подобных - все относительно безопасно и геном у всех организмов будет абсолютно идентичным, что является дополнительным плюсом для исследований.

Искусственное мясо

Однако данным фундаментальный метод используется не только в научных или медицинских целях. С 2001 года появилась идея попытки отказа от натуральных мышечных волокон и перехода к искусственно выращенным в пробирке. Собственно, в этом и заключается основная идея «мяса из пробирки» (in vitro meat). Главным фактором, влияющим на распространение данной технологии, является полная идентичность в строении и свойствах мяса искусственного по сравнению с натуральным, при чем для выращивания «в пробирке» клетки нужно взять всего один раз, что очень вдохновляет защитников животных.

Помимо этого, считается что этот метод позволит заметно сократить необходимое количество ресурсов. Земельные затраты вплоть до 99%, затраты энергии до 45%, до 96% меньше воды и на 78-96% меньше выбросов парниковых газов.

К сожалению, на данным момент производство слишком дорогое, чтобы начать глобальный переход, однако в ближайшее время планируется снизить цены за счет технологического прогресса и возможно уже через несколько лет люди откажутся от традиционного способа питания.

Стволовые клетки

Еще одной перспективной областью, связанной с методом культивирования клеток, является методика работы со стволовыми клетками. Интересны они своей способностью перерождаться в клетки, которые требуют регенерации. Иными словами способность быть любыми. С медицинской точки зрения, это крайне важно при различных осложнениях с жизненно-важных органах - их можно вырастить и заменить не дифференцированными стволовыми клетками.

По своему происхождению их разделяют на эмбриональные, фетальные, клетки пуповинной крови и клетки взрослого человека. В большом количестве стран введены крайне жесткие запреты на использование стволовых клеток по своему усмотрению, введены четкие границы на тип используемых клеток для лечения какой именно патологии. Наиболее часто встречаются случаи операций с клетками взрослого человека, ибо на них наложено меньше всего запретов на использование. Основной источник таких клеток в организме - красный костный мозг - концентрация стволовых клеток в нем максимальная.

Другим типом клеток, годных для теоретического (пока не возможно выращивать что-либо на практике) культивирования это эмбриональные клетки. Получают их на самых ранних стадиях развития эмбриона, чуть позже бластулы и гаструлы. Из них можно выращивать целые организмы. Они наиболее подвержены спонтанным изменениям, например, они часто склонны к внезапному перерождению в раковые, без объяснимых на данный момент причин.

Третьим видом клеток, выращиваемым в мире являются фетальные клетки. Это клетки, полученные из абортивного материала, что и является одним из главных моральных и юридических вопросов, противодействующим активному развитию именно этого типа клеток. Тем более, что убитый эмбрион теоретически может быть носителем различных вирусных заболеваний, что приведет к заражению рецепиента.

Последним, достаточно известным методом получения стволовых клеток является плацентарно-пуповинная кровь, собранная после рождения ребенка. Там имеются стволовые клетки, но в недостаточном количестве для пожизненного использования. В лучшем случае их можно использовать для лечения заболевания ребенка в первые 14 лет жизни. 88 Основано на данных с интернет-ресурса «Клеточные технологии» http://www.stemcells.ru/therapy

Данный метод все еще развивается в данный момент, несмотря на то, что подвергается жесткой критике со стороны некоторых ученых, церкви и других организаций. Во многом из-за неполного соответствия клеток естественных с клетками стволовыми, этот метод не получает достаточного развития.

Исследовательские возможности

Одним из ключевых преимуществ выращивания клеточных культур по сравнению с живым организмом при научных исследованиях, это возможность пожизненного исследования выращиваемой культуры. Если, например, при использовании организма детальное исследование возможно только после смерти организма, то с клеточными культурами можно проводить всевозможные манипуляции без вреда для всех клеток одновременно. Другим неоспоримым преимуществом является возможность поддерживать и изменять условия, что невозможно контролировать с целым организмом. Например, возможность менять кислотно-щелочной баланс и отслеживать реакцию тех или иных клеток. Помимо этого, культуры значительно снижают концентрации используемых веществ для тех или иных экспериментов, в том числе и радиоактивных или ядовитых. Количества веществ при работе с клеточными культурами значительно меньше, чем при работе с живой системой, при чем реакция ни чуть не меньше. 99 «Методы культивирования клеток для биохимиков» Р. Адамс (R.L.P. Adams) // Издательство «Мир» 1983г.

Основы цитологических процессов культивируемых клеток и способы культивации

культивирование клетка эксплантация

Для выбора правильной стратегии в выращивании клеток стоит определить каким именно способом будет выращиваться культура. Без данного шага могут возникнуть проблемы в понимании процессов, происходящих в клетках, при том или ином методе. Классифицировать все способы и типы культивирования клеток можно следующим образом:

периодическое культивирование;

продленное оптимизированное периодическое культивирование;

многоциклическое культивирование;

полунепрерывное культивирование;

непрерывно-синхронное культивирование;

непрерывное культивирование.

Периодическое культивирование

Для дальнейшего раскрытия темы стоит сказать пару слов о четырех основных фазах развития клеток при наиболее популярном периодическом культивировании.

Лаг-фаза является отрезком времени, на котором культура еще практически не делится и не растет ввиду немного отличного химического состава. Обычно продолжительность лаг-фазы зависит от предыдущей стационарной фазы, однако помимо этого важную роль играют возраст культуры, количество клеток и различия химического состава между новой и предыдущей средами.

Экспоненциальная фаза характерна скачком в количестве и/или размерах клеток, находящихся в культуре. Обычно продолжается относительно недолго, что связано с накоплением продуктов метаболизма, нехваткой питательных веществ и места в емкости.

Стационарная фаза, что следует из названия, характерна меньшей чувствительностью к физическим и химическим изменениям среды. Клетки почти не делятся, растут медленно. Им на этом этапе нужна только энергия для поддержания жизнедеятельности.

Фаза отмирания в чем-то есть противоположность экспоненциальной фазы роста - экспоненциальным отмиранием культуры. Клетки массово умирают, что связано в основном с исчерпанием запасов энергии в клетке и среде. Скорость отмирания зависит только от особенностей вида.

Клетки со временем переходят из одного отрезка в другой, при этом у них меняются не только свойства и особенности роста и деления, но и меняется химический состав, что в свою очередь несомненно повлияет на скорость прохождения следующей лаг-фазы. Во многом именно поэтому долго культивируемые культуры на одной среде с трудом перевиваются на новую.

Продленное периодическое культивирование

Этот метод во многом похож на простое периодическое культивирование, разве что питательная среда постепенно добавляется к клеточной массе, что несколько продлевает длительность некоторых циклов. При использовании именно этого метода, чуть ли не единственным лимитирующим фактором является объем среды, что несомненно дает заметные преимущества при выращивании большого количества клеток.

Одной из вариаций этого метода можно считать метод диализа. Суть метода заключается в том, что клетки отделены от всего раствора мембраной, проводящей лишь мелкие объекты. Этот метод позволяет выращивать клетки, изолируя их от продуктов жизнедеятельности, постепенно накапливающихся в сосуде. К сожалению этот метод не нашел промышленного применения ввиду сложности и низкой выходной массе продуктов. Однако его еще можно встретить в некоторых лабораториях. Основным плюсом данного метода служит способность мембраны удалять из реакционной смеси ингибиторы, мешающие делиться клеткам, что выполнить другими методами достаточно сложно.

Многоциклическое культивирование

Это процесс культивирования при многократном пересеивании, но без стерилизации емкости. Как результат можно наблюдать рост культуры, без затрат времени на очистку. Такой способ используется иногда в нескольких ферментерах, последовательно сменяющими друг друга. По своей природе не особо отличается от периодического метода, однако количество культуры в данном случае заметно выше, но вероятность заражения или загрязнения культуры выше.

Характерная особенность - автоматический слив клеточного материала и наполнение рабочей части системы питательной средой. Как следствие можно наблюдать колебательную систему, иллюстрирующую отношение количество клеток к количеству питательной среды. Частота будет зависеть от удельной скорости деления культуры, что зачастую и надо выяснить. Различные варианты полунепрерывных систем используются в производстве дрожжей, водорослей, антибиотиков и других продуктов.

Непрерывное культивирование

Обычно непрерывное выращивание происходит в открытой динамической системе, в которой устоялось равновесие, поэтому культура питается в точно вымеренных объемах, и выделяющаяся среда также должна быть всегда стабильной.

На фотографии изображен ферментер лабораторный на десять литров - один из многочисленных примеров систем динамического равновесия. В подобных системах выращиваются культуры в больших объемах, какие обычно нужны для производства или крупных биологических экспериментов, поэтому подобное сложнейшее оборудование в рядовых лабораториях практически не встречается.

Однако помимо этого непрерывная система открывает возможности для измерения реакции на те или иные факторы, ограничивающие рост. Например, можно отследить скорость и количество делений клеток при той или иной концентрации микроэлемента в среде. Для этого тот или иной лимитирующий фактор (в данном случае количество микроэлемента) искусственно изменяют, не изменяя прочих факторов. В результате получают точные биологические данные, какие получить в организме или в разовых экспериментах было бы практически невозможно. Процесс изучения влияния того или иного фактора на клетки называют хемостатным культивированием.

Стабильные открытые системы имеют управляемые постоянные условия, которые позволяют смоделировать глобальные экологические процессы, которые происходят в природе многие годы и даже столетия.

Многие эксперименты проводятся в несколько стадий с использованием нескольких последовательно соединенных ферментеров, в таких случаях процесс ферментирования называют многоступенчатым.



На схеме представлен классический трехступенчатый ферментер.

Sn - концентрации субстрата; Xn - концентрации клеток

Другой способ культивирования используется только для анаэробных условий. Он носит название систем культивирования полного вытеснения. Принципом такого культивирования служит непрерывные поток смеси среды с клетками, идущими через трубку. Как следствие, клетки постоянно растут и уже к концу их биомасса заметно увеличилась. Классический пример такого культивирования - трубчатый реактор.

Смесь из клеток и питательной смеси подаются и смешиваются непосредственно перед входом в трубку, что начинает цикл делений и роста клеток.

Так мы рассмотрели основные направления культивирования клеток бактерий. Стоит отметить, что это только основные пути, используемые при выращивании культур, далеко не ограничивающие теоретически возможные пути. Общее представление о культивировании клеток микроорганизмов можно по схеме.

Основные методы культивирования микроорганизмов

Если в истории культивирования клеток бактерий и животных основные скачки развития приходятся на конец XIX века, то с растениями ввиду сложности культивировании долгое время никаких делений не было. Первыми существенными толчками в развии этого метода стали открытия в 1922 г. В. Роббинс и Котте независимо друг от друга показавшие возможность культивирования на синтетических питательных средах клеток меристемы кончика корня томатов и кукурузы. Эти опыты положили начало применению метода культивирования изолированных клеток и органов растений.

С тех пор до 60-х годов учеными было постепенно синтезировано более 150 видов клеток растений in vitro. Итак через некоторое время Ф. Стюард, работая с культурой изолированной флоэмы моркови, получил из нее в 1958 г. целые растения.

Для растений почти всегда культивируются каллусные клетки растений. Заметно реже клетки опухолей растительного происхождения. Они практически не отличаются морфологически, но отличаются от нормальных лишь гормононезависимостью.

Заключение

В моей работе были рассмотрены основные пути выращивания культур клеток, были обозначены основные продукты, получаемые методом культуры тканей в настоящее время, были описаны несколько отраслей медицины и промышлености, в которых наиболее перспективным и интересным решением является этот метод. В настояшее время ведется относительно активное развитие этой области науки и медицины, что, возможно, уже в ближайшем будущем отразится на многих жизненных процессах: медицина сможет лечить больше травматических и хирургических недугов, бактериальных и вирусных заболеваний. Возможно, этот метод позволит коренным образом изменить нашу жизнь. Даже не смотря на всю современную сложность и непостоянность результатов, метод культуры клеток уже сейчас позволяет решать задачи различной сложности: исследовать биологические процессы, лечить и вылечивать пациентов и многое другое.

Таким образом я считаю, что большинство поставленных задач реализованы, а цель работы достигнута. Получился текст не слишком сложный для восприятия, но несущий, как я считаю, основные аспекты метода культур клеток и тканей.

Размещено на Allbest.ru