Выявление биологической активности и иммунохимическое определение полизамещенных кетонов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Национальный исследовательский Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского

Институт химии

Кафедра органической и биоорганической химии

Выявление биологической активности и иммунохимическое определение полизамещенных кетонов

Черний Юлия Викторовна,

Зинина Евгения Александровна,

Бурыгин Геннадий Леонидович

г. Саратов

Аннотация

Исследована биологическая активность растворимых в воде соединений ряда полизамещенных кетонов по отношению к бактериям и прорастанию зерновок пшеницы сорта Саратовская 29, кресс-салата и кукурузы. Было показано наличие слабой антимикробной активности изучаемых соединений. Выявлено ингибирование прорастания зерновок пшеницы 2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метил-3-фенилциклогексаноном. Для исследуемых веществ были получены миниантитела, позволяющие проводить детектирование концентраций от 4.3 мкг/мл и выше в растворах методом иммуноферментного анализа в полистирольных планшетах.

Ключевые слова: полизамещенные кетоны, биологическая активность, фаговые миниантитела, иммуноферментный анализ.

Известно, что биологическая активность вещества, проявляющаяся как его взаимодействие с биологическим объектом, зависит от характеристик как самого объекта, так и вещества. Например, по отношению к бактериям действие химического соединения может быть бактерицидным или бактериостатическим, но для некоторых веществ при отсутствии достоверно регистрируемого влияния на рост бактериальной культуры показано изменение свойств клеток, сказывающееся на конкурентоспособности данных бактерий в природной среде [1].

Поиск новых органических соединений, обладающих определенным спектром биологической активности, является приоритетным направлением в химии. Особое внимание здесь уделяется проблеме преобладания направленного подхода к созданию новых лекарств. Существует острая необходимость скрининга соединений, потенциально обладающих биологической активностью, по многим видам возможных биологических эффектов.

Отказ от жесткой направленности в изучении новых биологически активных соединений позволило бы избежать впоследствии обнаружения побочного токсического действия лекарства, а также регистрации лечебного препарата по новому назначению [2].

В химии полизамещенных циклогексанонов к настоящему времени достигнуты значительные успехи, в том числе в области стереохимии и таутомерии, изучены реакции с N-, O-, S-содержащими моно- и полинуклеофильными реагентами [3].

Наличие обширной сырьевой базы и высокий химический потенциал дают возможность разработки на их основе регио- и стереонаправленных методов синтеза широкого круга практически значимых соединений с широким спектром биологической активности (антифаговая, антимикробная, криопротекторная и регуляторная) [4, 5].

Ключевым моментом при использовании химических соединений на практике является определение концентрации применяемых веществ в окружении и внутри клеток во времени. Одним из подходов такого мониторинга может быть выявление соединений с помощью специфических зондов (антител).

В последние годы в иммунохимии начали активно использовать фаговые миниантитела, имеющие ряд преимуществ перед "стандартными" антителами животных, таких как возможность получения антител на токсичные и низкомолекулярные вещества [6].

Целью данной работы было выявление биологической активности полизамещенных кетонов по отношению к бактериям, растениям и животным клеткам, а также использование исследуемых веществ как модельных соединений для синтеза фаговых антител.

Экспериментальная часть

В работе использованы следующие соединения: 2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метил-3-фенилциклогексанон [7] и 3-(4-гидрокси-3-метоксибензилиден)-пентан-2,4-дион [8], синтезированные по известным методикам исходя из бензальдегида и ацетилацетона, либо 4-гидрокси-3-метоксибензальдегида и ацетилацетона соответственно в условиях основного катализа[3].

Растворение соединений проводили в воде. Для улучшения растворимости использовалось понижение pH под действием 6М водного раствора HCl. Для необходимых исследований реакция растворов была доведена до нейтральной при помощи 1М водного раствора трис(гидроксиметил)аминометана.

Влияние соединений на прорастание растений определяли следующим образом: в чашке Петри на фильтровальную бумагу, смоченную водным раствором соответствующего соединения, помещались зерна пшеницы сорта Саратовская 29 (НИИСХ "Юго-Восток", г. Саратов), кресс-салата кудрявого (ООО "Агрофирма Аэлита", г. Москва) и кукурузы линии АТ-3 (СГУ, г. Саратов); чашки помещались в термостат на 24 и 72 часа (+27 ^оС) и проводился подсчет проросших семян; полученные данные выражали в процентах относительно контрольных растений (семена, пророщенные в дистиллированной воде) и подвергали статистической обработке.

Влияние на рост бактерий изучали с помощью метода внесения веществ в лунки агаризованной среды, содержащей инокулят микроорганизмов (Escherichia coli XL-1, Pseudomonas fluorescens 38a, Staphylococcus aureus 209P, Bacillus subtilis 6633). Бактериальную суспензию вносили в стерильную среду при 45 ^оС. 20 мл среды разливали в чашку Петри с диаметром 90 мм на горизонтально ровной поверхности. После застывания среды были сделаны лунки диаметром 4 мм (6 лунок на одну чашку Петри), равномерно удаленные друг от друга и от края. В лунки вносили по 20 мкл водных растворов изучаемых соединений. Чашки Петри помещались в термостат на сутки при 37 ^оС. После инкубации проводились измерения диаметра зоны ингибирования роста с точностью 0.1 мм. Все эксперименты были проведены в трех повторностях, затем определялись средний диаметр зоны ингибирования и максимальный разброс данных [9].

Влияние на дыхательную активность человеческих раковых клеток HeLa, полученных из криобанка коллекции клеточных культур лаборатории вирусологии (Саратов) научно-исследовательской ветеринарной станции РАСХН, определяли по МТТ методике. Чистую культуру клеток и клетки с добавлением препаратов инкубировали по 1.8 мл в пробирках эппендорф при 37 ^оС в течение 1 и 24 часов. Каждую пробирку с клеточными суспензиями по окончании инкубирования центрифугировали 10 минут при 1000 g. Перерастворяли полученный осадок в 500 мкл раствора нитротетразолевого синего в физрастворе и инкубировали в течение часа. После инкубации клетки перерастворяли в 500 мкл диметилсульфоксида, отбирали по 200 мкл суспензии из каждой пробирки и помещали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета. Показания оптической плотности считывали на ридере Multiskan Ascent (Thermo, Финляндия).

Получение фаговых миниантител проводили с использованием фагового дисплея мышиных вариабельных участков иммуноглобулинов, содержащего 10⁶ вариантов scFv-белков. Миниантитела получали путем специфической сорбции бактериофагов М 13 с scFv-белками на исследуемые соединения, иммобилизованные на полистироле. Сорбированные вирусы использовали для последующего инфицирования чувствительных к фагу клеток штамма Escherichia coli XL-1. Зараженную культуру кишечной палочки выращивали в течение 18 часов при температуре +37 ^оС и 18 часов при +4 ^оС до поздней стационарной фазы роста и центрифугированием (5000g, 15 минут) отделяли фаговые частицы от бактериальных клеток. Миниантитела из раствора осаждали использованием полиэтиленгликоля-6000 и хлорида натрия и растворяли в минимальном объеме дистиллированной воды. После чего проводили диализ против 2000-кратного объема дистиллированной воды в течение 16 часов. Диализат хранили при -20 ?С и использовали в качестве фаговых миниантител.

Иммуноферментный анализ (вариант ELISA) проводили по стандартной методике [10] с модификациями. Тестируемые образцы в двукратных разведениях (50 мкл) иммобилизовали на полистироле в 96-луночных планшетах ("Медполимер", г. Санкт-Петербург, Россия) за счет простой адсорбции в течение 30 минут при +20 ^оС. Для блокирования свободных связей на полистироле в лунки планшета вносили по 100 мкл 1% раствора козеина в воде в качестве балластного соединения. После удаления блокирующего раствора в лунки на 1 час вносили по 50 мкл полученных фаговых миниантител, растворенных в фосфатном буфере (КН ₂РО ₄ - 1,6 г/л, рН 7.2), содержащем 0.02% Твин-20 и 0.1% козеина (для предотвращения неспецифической сорбции антител) (раствор 1). После трехкратной промывки лунок 100 мкл фосфатным буфером, содержащим 0.02% Твин-20 (раствор 2), в течение 15 минут, на 40 минут вносили по 50 мкл раствора 1, в который были добавлены кроличьи анти-фаговые антитела. После трехкратной (по 15 минут) промывки лунок 100 мкл раствором 2, в них вносили на 40 минут по 50 мкл раствора 1, в который были добавлены меченые пероксидазой козьи анти-кроличьи антитела ("Sigma", США) (2 мкг/мл). Планшеты дважды промывали раствором 2 и в лунки вносили по 50 мкл субстрата для оценки пероксидазной активности, представляющего собой 0.03% орто-фенилендиамина и 0.02% H₂O₂ в 0.1 М натрий-цитратном буфере (рН 4.5). Реакцию останавливали внесением в лунки планшетов по 100 мкл 1Н серной кислоты. Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили при длине волны 490 нм (A₄₉₀) на иммуноферментном анализаторе Multiskan Ascent (Thermo, Финляндия). Полученные результаты подвергались статистической обработке.

Результаты и их обсуждение

Известно, что конденсация альдегидов с ацетилацетоном в мольном соотношении 1:2 в этаноле под действием пиперидина в качестве катализатора приводит к образованию 3-R-2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метил-циклогексанонов [3, 4, 7]. При мольном соотношении альдегида и ацетилацетона 1:1 образуются 3-R-пентан-2,4-дионы. Указанным путем получены 2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метил-3-фенилциклогексанон (1) и 3-(4-гидрокси-3-метоксибензилиден)-пентан-2,4-дион (2):

2 1

R = Ph (1), C₆H₃-3-OCH₃-4-OH (2)

Для дальнейших опытов были приготовлены водные растворы в концентрации 500 мкг/мл (2) и 550 мкг/мл (1).

1. Выявление биологической активности исследуемых соединений на бактерии

В тестах по влиянию исследуемых соединений на рост бактериальных культур (Escherichia coli XL-1, Pseudomonas fluorescens 38a, Staphylococcus aureus 209P, Bacillus subtilis 6633).

А Б

Рис. 1. Чашки Петри с культурами E. coli XL-1 (А) и B. subtilis (Б) 6633 после 48 часов инкубирования при добавлении в лунки соединения 1 в концентрации от 12.5 до 200 мкг/мл

Было выявлено подавление роста бактерий E. coli XL-1 соединением 1 (в концентрации 200 мкг/мл зона ингибирования роста составила 7 мм) (рис. 1).

2. Выявление биологической активности исследуемых соединений на растения

При изучении влияния соединений на прорастание семян пшеницы, кукурузы и кресс-салата было выявлено, что все исследованные соединения в высоких концентрациях влияют на процент прорастания и развитие растений (рис. 2).

Рис. 2. Влияние соединений 1, 2 на прорастание семян пшеницы (А) и кресс-салата (Б)

Наиболее выраженное воздействие оказывало соединение 1. Так, в концентрации 500 мкг/мл оно полностью останавливало развитие семян растений, а при концентрации 50 мкг/мл проросшие растения значительно уступали в развитии контрольным (рис. 3).

Рис. 3. Трехсуточные проростки пшеницы (А), кукурузы (Б) и кресс-салата (В), выращенные в присутствии соединений 1 и 2 в концентрации 50 мкг/мл

Следует отметить, что соединение 1 в концентрации 500 мкг/мл полностью ингибировало развитие уже проросших растений, что свидетельствует о его токсическом эффекте независимо от стадии развития растения (рис. 4).

Рис. 4. Двухсуточные проростки кресс-салата после суток инкубирования в присутствии соединения 1 в концентрации 500 мкг/мл

3. Выявление биологической активности исследуемых соединений на клетки животных

При определении эффекта, оказываемого исследуемыми соединениями на дыхательную активность человеческих раковых клеток HeLa, было выявлено, что при инкубации клеток в течение 1 часа в среде, содержащей 200 мкг/мл соединений, вещество 2 не влияет на дыхательную активность клеток, а 1 угнетает ее в 2 раза (рис. 5).

Рис. 5. Измерение дыхательной активности клеток после инкубации в течение 1 часа в присутствии соединений 1 и 2

В дальнейших экспериментах планируется изучить диапазон токсичных концентраций соединения 1 для клеток животных и изучить механизм действия этого вещества.

4. Получение фаговых миниантител и иммунохимическое определение соединений

Для исследованных соединений были получены фаговые миниантитела. Уже после первого раунда селекции фагового дисплея к сорбированным веществам были получены антитела, выявляющие в твердофазном иммуноферментном анализе исследуемые соединения в низких концентрациях (4.3-34.0 мкг/мл) (рис. 6), что свидетельствует о перспективности использования миниантител при оценке концентрации низкомолекулярных органических соединений.

Рис. 6. Иммуноферментное выявление кетонов 1 и 2 гомологичными миниантителами

Заключение

биологический кетон бактерия антимикробный

Таким образом, нами были получены водные растворы 2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метил-3-фенилциклогексанона (1) и 3-(4-гидрокси-3-метоксибензилиден)-пентан-2,4-диона (2); выявлена их биологическая активность по отношению к бактериям, растениям и клеткам животных; а также были получены фаговые миниантитела, пригодные для определения концентрации этих веществ иммунохимическими методами в сложных биологических средах.

Выводы:

1. Исследованные водные растворы 2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метил-3-фенилциклогек-санона (1) и 3-(4-гидрокси-3-метоксибензилиден)-пентан-2,4-диона (2) не имеют или обладают слабой антимикробной активностью.

2. Выявлено ингибирование прорастания и развития пшеницы, кукурузы и кресс-салата 2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метил-3-фенилциклогексаноном в диапазоне концентраций 50-500 мкг/мл.

3. Выявлено подавление дыхательной активности человеческих раковых клеток HeLa 2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метил-3-фенилциклогексаноном в концентрациях 200 мкг/мл.

4. Получены миниантитела, пригодные для детекции исследуемых водных растворов 2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метил-3-фенилциклогексанона (1) и 3-(4-гидрокси-3-метоксибен-зилиден)-пентан-2,4-диона (2) в сложных биологических средах.

Литература

1. Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щёголев С.Ю. Изменение антигенных свойств липополисахаридов Azospirillum brasilense при внесении в среду культивирования трис(гидроксиметил)аминометана. Прикл. биохим. и микробиол. 2002. Т.38. №3. С.292-294.

2. Филимонов Д.А., Поройков В.В. Прогноз спектра биологической активности органических соединений. Российский химический журнал. 2006. Т.50. №2. С.66-67.

3. Кривенько А.П., Сорокин В.В. Синтезы и реакции 3R-2,4-диацетил(диэтоксикарбонил)-5-гидрокси-5-метилциклогексанов и родственных веществ. (обзор). ЖОрХ. 1999. Т.35. Вып.8. С.357-397.

4. Сорокин В.В., Кривенько А.П., Григорьева Э.А. Поликарбонильные соединения циклогексанового ряда и енамины на их основе. Биологическая активность N,O,S-содержащих гетероорганических соединений. Саратов. Изд-во "Научная книга". 2004. С.33-34, 97-101.

5. Hall A.C., Griffith T.N., Tsikolia M., Kotey F.O., Gill N., Humbert D.J., Watt E.E., Yermolina Y.A., Goel S., El-Ghendy B., Hall C.D. Cyclohexanol analogues are positive modulators of GABA(A) receptor currents and act as general anaesthetics in vivo. Eur. J. Pharmacol. 2011.

6. Finlay W.J.J., Bloom L., Cunningham O. Phage display: a powerful technology for the generation of high specificity affinity reagents from alternative immune sources. Methods in Molecular Biology. 2011. Vol. 681. Part.1. P.87-101.

7. Finar I.L. The Structure of 1,5-Diketones. J. Chem. Soc. 1961. No.2. P.674-679.

8. L.-X. Pei, X.-Z. Bu, L.-Q. Gu and S. W. Ng. 3-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methylene]-2,4-pentanedione. Acta Cryst. 2005. Vol.61. P.541-543.

9. Burygin G.L., Khlebtsov B.N., Shantrokha A.N., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Khlebtsov N.G. On the enhanced antibacterial activity of gentamycine and its mixture with gold nanoparticles. Nanoscale Res. Lett. 2009. Vol.4. P.794-801.

10. Красов А.И., Попова И.А., Филипьечева Ю.А., Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю. Применение иммуноферментного анализа для выявления азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum в почвенных суспензиях. Микробиология. 2009. Т.78. №5. С.662-666.

Размещено на Allbest.ru