Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московской области Государственный университет "Дубна"

Кафедра химии, новых технологий и материалов

Использование атомно-эмиссионного анализатора КИР-Майя для анализа биологических проб сложного фазового состава

Антоненко Алина Валерьевна

Руководители:

Ягов Владимир Викторович

Зуев Борис Константинович

Содержание

• Введение
• 1. Слюна. Состав слюны
• 2. Методы клинического анализа слюны
• 3. Микроэлементное содержание биологической жидкости
• 4. Методика исследования
• 5. Результаты и их обсуждение
• Заключение
• Cписок литературы


Введение

До недавнего времени использование слюны в диагностических целях было затруднено. Существует несколько причин этого: во-первых, низкий уровень определения, во-вторых, сложность обнаружения, в -третьих, не всегда получаемые показатели коррелируют с таковыми в плазме крови, и в- четвертых, отсутствует точная методика сбора и хранения проб данного материала до проведения анализа. На сегодняшний день эти проблемы в большей мере устранены в результате тщательного изучения секреции и физиологии слюнных желез, а так же методологии забора и обработки образцов слюны.

Слюна легко собирается и хранится, а так же идеально подходит для диагностики. Возрастает интерес к использованию слюны и других образцов из полости рта для диагностики системных заболеваний и заболеваний полости рта. Это очень важно для ряда популяций, для обследования детей и престарелых. Так же очень выгоден такой объект анализа при ограниченном доступе медицинской помощи в удаленных географических районах, где забор крови невозможен.

Целью данной работы являлось использование атомно-эмиссионного анализатора КИР-Майя для определения щелочных и щелочноземельных металлов в малых объемах проб сложного фазового состава(ротовая жидкость), созданного Яговым В.В., Коротковым А.С. и Погониным В.И. в лаборатории Химических сенсоров ГЕОХИ РАН под руководством Б.К. Зуева.

1. Слюна. Состав слюны

Слюна - сложный по составу биологический материал. На количество и состав слюны влияют различные факторы: обще состояние организма, функциональная активность слюнных желез, вязкость слюны, консистентный состав употребляемой пищи, наличие пищевых остатков, гигиеническое состояние полости рта.

За сутки выделяется от 0,5 до 2,2 л слюны, рН слюны варьируется от 5,5 до 8,0. Так же слюна выполняет важные функции, такие как: пищеварительную, минерализующую, защитную, регуляторную и буферную.[1]

На 98,5 % слюна состоит из воды, содержит соли различных кислот, микроэлементы и катионы щелочных металлов, ферменты и некоторые витамины. Белки - основное органическое вещество слюны, которое синтезируется в слюнных железах.

Основные белки: альбумины, глобулины, муцин, иммуноглобулины, ферменты [2]

Химический состав слюны подвержен суточным колебаниям, он также зависит от возраста (у пожилых людей, например, значительно повышается количество кальция, что имеет значение для образования зубного и слюнного камня). Изменения в составе слюны могут быть связаны с приемом лекарственных веществ и интоксикациями. Уменьшение слюноотделения и изменения в составе слюны приводят к нарушениям пищеварения, заболеваниям зубов.[3]

Слюна как основной источник поступления в эмаль зуба кальция, фосфора и других минеральных элементов влияет на ее физические и химические свойства, в т.ч. на резистентность к кариесу. [4]

2. Методы клинического анализа слюны

В настоящий момент существуют различные анализы где главным объектов исследования является слюна.

* Анализ слюны для экспертизы ДНК на основе ПРЦ.

В данном анализе берут мазок полости рта, при исследовании которого можно получить дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) образца. Это используется в судебномедицинских исследованиях. [5]

С подробными результатами анализа слюны для экспертизы ДНК можно ознакомиться в работе Aki.K., Izumi A. и Hosoi E. [6]

* Определение гормонов в слюне методом иммуноферментного анализа

В массовых исследованиях наиболее распространено определение кортизола в слюне. Кортизол - стероидный гормон, который синтезируется в пучковой зоне коры надпочечников.

Определение свободного биологически активного кортизола в слюне производится методом иммуноферментного анализа.[7]

С подробными результатами определения картизола в слюне можно ознакомиться в работе Gerritsen L,. Geeerlings M.I.,Beekman A.I. [8]

* Биомаркеры слюны для диагностики инфекционных заболеваний

Часто молекулы, полученные из слюны используются в качестве диагностических биомаркеров заболеваний полости рта, вызванные грибками (Candida), вирусами папилломы человека (ВПЧ),вирус Эпштейна - Барр (ВЭБ), а так же бактериями (некоторые из них участвуют в заболеваниях пародонта и кариеса).

Наличие распространенного заболевания полости рта, вызванного ВПЧ, такого как вирус простого герпеса 1 и 2 типа, вирус ветряной оспы, вирус герпеса человека, говорят нам о иммунодефиците у человека (ВИЧ).

Благодаря существованию биомаркеров слюны при сборе анализа крови возможно свести к минимуму заражение ВИЧ.

Экспериментально обнаружен ВПЧ в образцах слюны с помощью ПЦР и ознакомиться с полученными результатами можно в работе Adamopoulou M., VAiraktaris E., Panis V.[9]

Используя мммуноферментный метод в стоматологии определяют биомаркеры заболеваний полости рта инфекционно-воспалительной природы. В частности, при заболеваниях периодонта методом ИФА определяют содержание таких биомаркеров, как цитокины, протеогликаны, пептидные продукты тканевой деструкции. Этот принцип используется в стоматологии и в качестве экспресс-метода диагностирования ВИЧинфекции с использованием проб из десневого содержимого [10].

* Масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой

Все вышеописанные методы не позволяют определить содержание в биологическом образце отдельных элементов, что порой так необходимо при анализе. Одним из таких методов является масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой.

В работе Рувинской Г.Р. [11] Результаты исследования приведены в таблице 1.

Таблица 1. Концентрация химических элементов в ротовой жидкости

Существует так же методика дугового атомно-эмиссионного спектрального анализа жидких биопроб.

В работе Савинова С.С.[12 ] рассмотрен принцип данного анализа и заключается он в следующем: на торец подготовленного (обожженного и с нанесенной защитной пленкой) нижнего угольного электрода наносится с помощью микрошприца жидкая проба в виде капли объемом 10 мкл, которая высушивается под инфракрасной лампой. Далее наносится капля водного раствора NaCl - спектрального буфера, которая так же высушивается. Затем электрод в паре с верхним (заточенным на конус) электродом устанавливается в штативе камеры дугового разряда (рис. 1)

Рис. 1. Блок-схема спектральной установки

Принцип действия источника заключается в преобразовании электрической энергии в импульсы разрядного тока, возбуждающие между электродами аналитического промежутка низкотемпературную плазму.

В анализе последовательно наносилось 15 капель (каждая объемом 10 мкл) слюны, которые выпаривались под ИК-лампой. После определения концентраций элементов по указанному выше способу полученные данные были подвергнуты статистическому анализу. Данные представлены в табл. 2

Табл. 2. Содержание элементов в слюне [12]

Для нас особый интерес при анализе биологической пробы представляют 4 электролита, обоснование этого представлено ниже.

3. Микроэлементное содержание биологической жидкости

Основные катионы организма - натрий, калий, кальций, магний. Анионы - хлор, гидрокарбонат, фосфаты, сульфат. Концентрацию электролитов в Международной системе единиц (СИ) выражают в ммоль/л. Имеются значительные различия в количественном распределении электролитов между внутри- и внеклеточной жидкостями.

Во внеклеточной жидкости представлены в основном ионы натрия, хлора, гидрокарбоната. Во внутриклеточной жидкости - более высокие концентрации ионов калия, магния, фосфатов и сульфата. Электролиты выполняют в организме следующие функции: отвечают за осмолярность жидкостей тела, образуют биоэлектрический потенциал, катализируют процессы обмена веществ, определяют рН жидкостей тела, стабилизируют костную ткань, служат в качестве "энергетического депо" и участвуют в свертывании крови

4. Экспериментальная часть

Аппаратура. На рис. 2 приведена блок-схема прибора созданного Яговым В.В., Коротковым А.С. и Погониным В.И. в лаборатории Химических сенсоров ГЕОХИ РАН под руководством Б.К. Зуева. Источником эмиссионных спектров является электрический разряд между верхним мениском капли пробы (1) и нижним мениском жидкой линзы (2). Пробу в виде капли наносят пипет-дозатором (3) на торец толстостенной фторопластовой трубки (4), в которую плотно вставлен катод в виде проволоки из нержавеющей стали диаметром 1,5 мм. Катод соединен с отрицательным полюсом высоковольтного источника питания ВС-22. Раствор, образующий жидкую линзу, поступает из верхней части ячейки (5) со скоростью 1 капля/ 35-40 сек, падение каждой капли сопровождается замыканием цепи и электрическим разрядом вызывающим распыление, атомизацию и возбуждение компонентов анализируемого раствора. Торец кварцевого световода (6) никогда не остается сухим, поскольку жидкость постоянно подается через кольцевой зазор между корпусом световодного жгута и внешней стеклянной трубкой.

Для возбуждения капельно-искрового разряда электроды соединены с источником постоянного тока, конденсатором (2,2 кВ, 3 мкФ) через балластное сопротивление 1 кОм. Времяразрешенный сигнал - силу тока, напряжение и интенсивность света - регистрировали с помощью платы ввода-вывода L154 (L-Card, Россия). Для регистрации излучения, возникающего в момент разряда, использовали оптическую систему, состоящую из кварцевого световода (светопропускание в области 180-900 нм), монохроматора МДР-3 с дифракционными решетками 600 и 1200 штрихов на мм

(спектральная ширина 0,1-0,5 нм) и фотоприемного модуля Н 8249 (Hamamatsu,, Япония). Общее управление прибором и математическую обработку результатов выполняет разработанная авторами программаpackage.exe, работающая в среде Windows.

Рис. 2. Схема микроплазменного анализатора. 1 - капля пробы, 2 - жидкая линза, 3 - пипетка, 4 - фторопластовая трубка с металлическим катодом, 5 - система подачи кислоты, 6 - световод

Растворители и реагенты. Использовали дистиллированную воду, кальций (1 мг/мл ГСО), магний (1 мг/мл ГСО), калий (1 мг/мл), натрий (1 мг/мл ГСО) и хлороводородную кислоту, ОС.Ч. ("Химмед", Россия).

Растворы готовили непосредственно перед проведением эксперимента. Аликвотные части отбирали при помощи набора микропипеток ThermoScience (диапазоны объемов 1-20, 20-200, 100-1000 и 1000-10000 мкл, точность отбора аликвотной части ±1.5%). Для измерения массы использованы весы Extended ED Sartorius AG, Германия.

4. Методика исследования

Подготовка пробы к анализу

В пробирку из полиэтилентерефталата вносили 1 г ротовой жидкости, добавляли 50 мкл хлороводородной кислоты и интенсивно встряхивали 1 мин, после чего отстаивали не менее 15 мин. Затем аликвотную часть отбирали пипет-дозатором и разбавляли хлороводородной кислотой 3:100 в 20 раз.

Методика определения элементов

Верхнюю часть ячейки (5) заполняли 0,3М HCl, устанавливали скорость падения 1капля/35-40 с. За время между разрядами с торца фторопластовой трубки (4) удаляли жидкость, оставшуюся от предыдущего измерения, а затем наносилипипет-дозатором пробу объемом 25 мкл в виде "купола" (1). Аналитическим сигналом служила интегральная интенсивность свечения на соответствующей длине волны за первые 20 мс разряда. Металлы определяли по наиболее интенсивным атомным линиям:Na - 589,0 нм, K - 766,5 нм, Ca - 422,7 нм, Mg - 518 нм.

Определение содержания элементов осуществляли методом добавок, добиваясь по возможности равенства исходного и добавочного сигналов. Для определения предела обнаружения использован 3у-критерий, а для расчета диапазона определяемых содержаний --критерий s_r<0.33.

5. Результаты и их обсуждение

Определение натрия, калия, кальция и магния в реальных объектах и обработка данных

Проведено определение указанных элементов в ротовой жидкости. Пробы представляли собой мутные вязкие жидкости, склонные к расслаиванию при хранении. После подкисления и гомогенизации их разбавляли в 20 раз согласно методике и вводили добавки в уже разбавленные растворы. Найденные по методу добавок концентрации элементов в образцах приведены в табл.3.Объем пробы составляли 25 мкл (n=5, P=0,95).В данных экспериментах добавка составляла 2,5 ppm для Na⁺, 5 ppm для K⁺ и Mg²⁺, 10 ppm для Ca²⁺.

Таблица 3. Концентрации ионов калия, кальция, магния и натрия в ротовой жидкости, определенная на микроплазменном анализаторе КИР-Майя.

Так же мы осуществили эксперимент, в котором прослеживалась динамика содержания электролитов в ротовой жидкости после употребления жвачки `Orbit' спустя 1 мин., 20 мин. и 60 мин.

Данные представлены на рис 3. Объем пробы составляли 25 мкл (n=5). В данных экспериментах добавка составляла 2,5 ppm для Na⁺, 5 ppm для K⁺ и Mg²⁺, 10 ppm для Ca²⁺.

Рис. 3. Сравнительная гистограмма содержания электролитов в ротовой жидкости

Обработку полученных результатов мы совершали с помощью программы package.exe. Программа "выдавала" файлы cdr, которые представляют собой текстовые файлы, которые можно смотреть и редактировать блокнотом. Первые строки отведены под комментарии; далее следует две колонки чисел: длина волны и значение интенсивности (счеты, counts) рис.3. Это первичные данные, записанные спектрометром.

Нулю соответствует значение около 2700, максимальное допустимое значение - 64000. Появление этого числа в файле означает, что на какой-то из длин волн достигнуто превышение максимальной интенсивности и соответствующее значение не может быть использовано в расчете концентрации.

Файлы cdr можно обрабатывать любыми программами, в комплекте с прибором для этой цели прилагается программа package.exe.

Рис.4. Файл cdr, показывающий длину волны и значение интенсивности

Заключение

слюна клинический микроэлементный металл

В современной клинической диагностике реализуется одновременное определение нескольких значимых электролитов (Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺) с помощью пламенных фотомеров, но при таком анализе необходим большой расход пробы. При клинической диагностике биологических жидкостей такой фактор как объем пробы играет важную роль, так как, например, плазма крови легкодоступна в относительно больших количествах, а спинномозговая жидкость и экссудат трудно получить в количествах, превышающих несколько миллиграмм. В микроплазменном АЭС определение проводится в единственной капле образца. В данной работе мы проанализировали ротовую жидкость, экссудат и лимфу(см. Приложение) в объеме 25 мкл, что существенно расширяет сферу применения данного метода, также существенным достоинством является простота пробоотбора в случае с ротовой жидкостью(не требуется специальной классификации лаборанта, меньший риск заражения ВИЧ или гепатитом);

Использование микроплазменной АЭС с капельно-искровым разрядом в качестве источника атомизации и возбуждения выгодно отличается возможностью определения магния и кальция по их атомным линиям. В пламенном фотометре данные элементы образуют тугоплавкие оксиды и не атомизируются.

Cписок литературы

1. Lac G. Saliva assays in clinical and research biology // Pathol. Biol. (Paris) 2001 49:8 660-7

2. Тарасенко Л.М., Непорада К.С.. Биология полости органов рта // Учебное пособие. Полтава, 2008, С. 6-8

3. Seifert G. Salivary glands and the organism-interrelations and correlating reactions // Laryngorhinootologie 1997 76:6 387-93

4. Григорьев И.В., Уланова Е.А., Ладик Б.Б. Некоторые особенности белкового спектра смешанной слюны у пациентов с депрессивным синдромом // Клиническая лабораторная диагностика. 2002. № 1. С. 15-18.

5. Lijnen I., Willems G., DNA research in forensic dentistry. Methods Find. Exp. Clin Pharmacol. 2001; 23 (9) : 511-7

6. Aki.K., Izumi A., Hosoi E. The evalution of histo-blood group ABO typing by flow cytometric and PCR- amplification of specific alleles analyses and their applications in clinical laboratories. J. Med. Invest. 2012;59 (1-2):143-51

7. [Электронный ресурс] http://spravochnik.synevo.ua/ru/hypot-hypnadpochechnikovaia/cortisol-sliuna.html (Дата обращения 15.12.15, 12.55)

8. Gerritsen L,. Geeerlings M.I.,Beekman A.I. et. al. Early ant late life events and salivary cortisol in older person. Psychol. Med. 2009:1-10

9. Adamopoulou M., VAiraktaris E., Panis V., et.al. HPV delection rate in saliva may depend on the immune system efficiency. In vivo, 2008 ; 22 (5) : 599-602

10. Балмасова И.П., Царев В.Н., Носик А.С. и др. Опыт применения экспресс-теста для определения антител к вирусу иммунодефицита человека в ротовой жидкости. Стоматолог 2008; 2: 14--18.

11. Рувинская Г.Р. Перспективы применения метода масс-спектрометрии для анализа ротовой жидкости в клинической стоматологии // . ГБОУ ВПО "Казанский государственный медицинский университет" Минздравсоцразвития РФ. 2012

12. Савинов С.С. Новые возможности дуговой атомно-эмиссионной спектрометрии для прямого анализа жидких биопроб. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Санкт-Петербург - 2014

Размещено на Allbest.ru