Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНЕСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра «Общая биология и биохимия»

Реферат

по дисциплине «Биохимические основы воспроизведения биологических систем»

на тему: «Обратная транскрипция»

Выполнил студент: Акжигитова Карина Ирековна

Группа: 15ФБ2

Руководитель: доцент, к.б.н.

Кручинина Анастасия Дмитриевна

Пенза, 2017



Содержание

• обратный транскрипция фермент биология
• Введение
• Обратная транскрипция
• Механизм транскрипции, три стадии транскрипции
• Значение обратной транскрипции
• Механизм обратной транскрипции
• Применение обратной транскрипции в молекулярной биологии вирусов
• Заключение
• Список литературы


Введение

За десять лет после открытия структуры ДНК и расшифровки генетического кода сформулированная Джеймсом Уотсоном в 1952 г. гипотеза об однонаправленном переносе генетической информации (от нуклеиновых кислот к белку и никогда наоборот) превратилась в общепризнанную «центральную догму молекулярной биологии», которая предполагала, что ДНК транскрибируется в РНК и далее транслируется в белки. Эта аксиома остается в силе для всех биологических систем. Это правило переноса генетической информации составляет суть молекулярной биологии. Только один раз, в 1970 г., оно было модифицировано, когда признали существование обратной транскрипции. Впервые обратная транскрипция была обнаружена у опухолевых вирусов мышей и кур. Сейчас эти РНК-содержащие вирусы называют ретровирусами. Их инфекционный цикл хорошо изучен. Вирус проникает в клетку-мишень, и на основе своей РНК создает копию ДНК, которая встраивается в хромосому хозяина.

При делении клетки встроенная копия ДНК вирусного генома удваивается и передается дочерним клеткам. Таким образом, наследственный материал вируса оказывается включенным в геном клетки. Вирусная РНК может образоваться позже путем копирования встроенной ДНК. Это приведет к образованию новых инфекционных вирусов.

В 1970 году Howard Temin и David Baltimore независимо друг от друга открыли фермент, названный обратной транскриптазой (ревертазой), и возможность обратной транскрипции была окончательно подтверждена.

В общем виде идею обратной транскрипции Тёмин высказал еще в 1964 г., работая к тому времени несколько лет под руководством своего учителя Р. Дульбекко с опухолеродными вирусами животных, но она была решительно отвергнута, так как считалось, что в природе не существует фермента, способного осуществить такой процесс. В 1970 г. Тёмин (одновременно независимо от него Д. Балтимор) экспериментально обнаружил такой фермент -- ревертазу, фермент класса трансфераз, осуществляющий синтез молекулы ДНК на РНК как матрице. Одновременно Тёмин (и независимо от него Р. Дульбекко) выдвинул вскоре подтвержденную экспериментами теорию провируса -- генома вируса, который полностью объединен с генетическим материалом клетки-хозяина в единую молекулу ДНК, что делает возможным перерождение нормальной клетки в раковую. Тем самым концепция обратной транскрипции была окончательно доказана, и в 1975 г. Тёмин (вместе с Д. Балтимором и Р. Дульбекко) был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине.

По общему признанию обратная транскрипция, это открытие которое относится к числу выдающихся событий в молекулярной биологии. Оно имело крупное общебиологическое значение, и его влияние испытали многие разделы биологии и медицины, такие как молекулярная биология, молекулярная генетика, вирусология, онкология, энзимология и др.

Обратная транскрипция -- это процесс образования двуцепочечной ДНК на основании информации в одноцепочечной РНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией, так как передача генетической информации при этом происходит в «обратном», относительно транскрипции, направлении. Идея обратной транскрипции вначале была очень непопулярна, так как противоречила центральной догме молекулярной биологии, которая предполагала, что ДНК транскрибируется в РНК и далее транслируется в белки. Однако в 1970 году Темин и Балтимор независимо друг от друга открыли фермент, названный обратной транскриптазой (ревертазой), и возможность обратной транскрипции была окончательно подтверждена.



Обратная транскрипция

Это процесс образования двуцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией, так как передача генетической информации при этом происходит в «обратном», относительно транскрипции, направлении.

обратная транскриптаза (ревертаза или РНК-зависимая ДНК-полимераза) -- фермент, катализирующий синтез ДНК на матрице РНК в процессе, называемом обратной транскрипцией. Обратная транскрипция необходима, в частности, для осуществления жизненного цикла ретровирусов, например, вирусов иммунодефицита человека и T-клеточной лимфомы человека типов 1 и 2. После попадания вирусной РНК в клетку обратная транскриптаза, содержащаяся в вирусных частицах, синтезирует комплементарную ей ДНК, а затем на этой цепи ДНК, как на матрице, достраивает вторую цепь. ретровирусы - это РНК-содержащие вирусы, в жизненный цикл которых входит стадия образования ДНК обратной транскриптазой и внедрение ее в геном клетки хозяина в форме провируса. Предпочтительного места внедрения провируса в геном нет. Это позволяет отнести его к мобильным генетическим элементам. В состав ретровируса входит две идентичные молекулы РНК. На 5'-конце имеется Сap, на 3'-конце - поли А-хвост. Фермент обратную транскриптазу вирус "носит" c собой. Геном ретровируса содержит 4 гена: gag-белок нуклеоида,pol-обратная транскриптаза, env-белок капсида (оболочки),онкоген.str5 = str3-короткий концевой повтор;U5, U3-уникальные последовательности, PB (primer binding site) - участок связывания затравки. На РВ садится (за счет комплементарности) tРНК и служит затравкой для синтеза ДНК. Синтезируется небольшой кусок ДНК. Обратная транскриптаза, обладая еще и активностью РНК-азы Н, удаляет РНК в гибриде с ДНК, а за счет идентичности str3 и str5 этот одноцепочечный участок ДНК взаимодействует с 3'-концом второй молекулы РНК, которая служит матрицей для продолжения синтеза цепи ДНК. Затем РНК-матрица уничтожается и по образовавшейся цепи ДНК строится комплементарная.

Образованная молекула ДНК длиннее РНК. В форме провируса она находится в геноме клетки хозяина. При митозе и мейозе передается дочерним клеткам и потомкам. Некоторые вирусы (такие как ВИЧ, вызывающий СПИД), имеют возможность транскрибировать РНК в ДНК. ВИЧ имеет РНК-геном, который встраивается в ДНК. В результате, ДНК вируса может быть объединено с геномом клетки-хозяина. Главный фермент, ответственный за синтез ДНК из РНК, называется ревертазой. Одной из функций ревертазы является создание комплементарной ДНК (кДНК) из вирусного генома. Ассоциированый фермент рибонуклеаза H расщепляет РНК, а ревертаза синтезирует кДНК из двойной спирали ДНК. кДНК интегрируется в геном клетки-хозяина с помощью интегразы. Результатом является синтез вирусных протеинов клеткой-хозяином, которые образуют новые вирусы

Механизм транскрипции, три стадии транскрипции

Транскримпция (от лат. transcriptio -- переписывание) -- процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы, происходящий во всех живых клетках. Другими словами, это перенос генетической информации с ДНК на РНК. Транскрипция катализируется ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Процесс синтеза РНК протекает в направлении от 5'- к 3'- концу, то есть по матричной цепи ДНК РНК-полимераза движется в направлении 3'->5'Транскрипция состоит из стадий инициации, элонгации и терминации.

Инициация транскрипции происходит в специфических участках ДНК - промоторах (Промотор (promoter): последовательность ДНК, которая связывает РНК-полимеразу и служит отправной точкой транскрипции;), - и сама состоит из нескольких стадий. В отличие от ДНК-полимераз, РНКП способна самостоятельно осуществлять инициацию и начинать синтез РНК в отсутствие затравки. Инициация требует наличия субстратов РНК-полимеразы - нуклеозидтрифосфатов - и заключается в образовании первых нескольких звеньев цепи РНК.При синтезе первых 9 рибонуклеотидов этот фрагмент выбрасывается и затем транскрипция начинается вновь и идет до конца. Энхансер -- небольшой участок ДНК, способный связываться с факторами транскрипции, при этом увеличивая уровень транскрипции гена или группы генов. Сайленсер (англ. Silencer) -- последовательность ДНК, с которой связываются белки-репрессоры (факторы транскрипции). Связывание белков-репрессоров с сайленсерами приводит к понижению или к полному подавлению синтеза РНК ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой.

Элонгация-Переход от инициации к элонгации сопровождается разрывом связей между ферментом, промотором, факторами инициации транскрипции. Момент перехода РНК-полимеразы от инициации транскрипции к элонгации точно не определен. Происходит наращивание цепи, в результате которой происходит расплетение ДНК, транскрибция восст. Струк. ДНК с выталкиванием РНК. ИЛИ Факторы элонгации повышают активность РНК-полимеразы и облегчают расхождение цепей ДНК. Синтез молекулы РНК идёт от 5'- к З'-концу комплементарно матричной цепи ДНК. На стадии элонгации, в области транскрипционной вилки, одновременно разделены примерно 18 нуклеотидных пар ДНК. Растущий конец цепи РНК образует временную гибридную спираль, около 12 пар нуклеотидных остатков, с матричной цепью ДНК. По мере продвижения РНК-полимеразы по матрице в направлении от 3'- к 5'-концу впереди неё происходит расхождение, а позади - восстановление двойной спирали ДНК.

Терминация-Раскручивание двойной спирали ДНК в области сайта терминации делает его доступным для фактора терминации. Завершается синтез РНК в строго определенных участках матрицы - терминаторах (сайты терминации). Сигнал об окончании транскрипции закодирован в мРНК и наз. Терминатор. он обр. в самой РНК.есть два механизма терминации транскрипции: ро-зависимый механизм, при котором белок Rho (ро) дестабилизирует водородные связи между матрицей ДНК и мРНК, высвобождая молекулу РНК. ро-независимый, при котором транскрипция останавливается, когда только что синтезированная молекула РНК формирует стебель-петлю, за которой расположено несколько урацилов (…УУУУ), что приводит к отсоединению молекулы РНК от матрицы ДНК.

Терминация транскрипции у эукариот менее изучена. Она завершается разрезанием РНК, после чего к её 3' концу фермент добавляет несколько аденинов (…АААА), от числа которых зависит стабильность данного транскрипта.

Долгое время считалось, что передача информации от РНК к ДНК невозможна, однако, впоследствии выяснилось, что это не так. Некоторые вирусы способны встраивать информацию со своей вирусной РНК в ДНК генома клетки-хозяина. Возможность "обратного" направления информации в настоящее время все шире используется в различных целях, от исследовательских до терапевтических. Так называемые энзимы - обратные транскриптазы - способны осуществлять синтез кДНК на матрице РНК. О происходящих в клетках млекопитающих (эукариот) процессах передачи информации известно достаточно много.

Некоторые онкогенные РНК-содержащие вирусы животных, например, вирус саркомы Рауса имеют уникальный фермент - РНК-зависимую ДНК-полимеразу, называемую обратной транскриптазой. После того как такой вирус попадает в клетку-хозяина, этот фермент способен катализировать синтез ДНК, комплементарной по отношению к вирусной РНК, которая играет при этом роль матрицы. В результате образуется ДНК, которая содержит гены, обусловливающие рак. Эта ДНК часто встраивается в геном эукариотической клетки-хозяина, где она может в течение многих поколений оставаться в скрытом, т.е. неэкспрессируемом, состоянии.

Рис 1 Обратная транскриптаза

При определенных условиях такие бездействующие вирусные гены могут активироваться и вызывать репликацию вируса; при других же условиях они могут способствовать превращению таких клеток в раковые.

У некоторых бактериофагов E.coli хромосома представляет собой не ДНК, а РНК. РНК этих вирусов, которые при синтезе вирусных белков выступают в роли мРНК, реплицируются в клетке-хозяине под действием ферментов, называемых РНК-зависимыми РНК-полимеразами, или РНК-репликазами. Эти ферменты обычно отсутствуют в клетках E.coli и появляются в них лишь в ответ на присутствие вирусных РНК.

Открытие обратной транскриптазы позволило по-новому сформулировать центральную догму молекулярной биологии.



Рис 2

Обратная транскриптаз (или РНК-зависимая ДНК-полимераза) - фермент (КФ 2.7.7.49), что катализуе синтез ДНК с использованием РНК в качестве матрицы. Называется так потому, что большинство процессов транскрипции в живых организмах происходят в другом направлении, а именно, с молекулы ДНК синтезируется РНК-транскрипт.

Обратная транскриптаза была открыта Говардом Темином в Висконсинском университете в Мэдисоне и независимо около Дэвидом Балтимором в MIT в 1970 году. Оба вместе с Ренато Дульбеко разделили Нобелевскую премию по биологии и медицины за это открытие.

Функция У вирусов Обратная транскрипция необходима, в частности, для осуществления жизненного цикла ретровирусов, например, вирусов иммунодефицита человека и T-клеточной лимфомы человека типов 1 и 2. Эти вирусы содержат РНК как носителя своего генома. После попадания вирусной РНК в клетку обратная транскриптаза, содержащаяся в вирусных частицах, синтезирует комплементарную этой РНК ДНК, а затем на этой цепочке ДНК, как на матрице, достраивает РНК для новых вирусных частиц.

У эукариот Ретротранспозона эукариот кодируют обратную рестриктаз, используемой ими для встраивания в геном хозяина, подобно тому, как это происходит у вирусов. Теломераза - другая обратная транскриптаза, найденная в большинстве эукариот, в частности человека, использующего РНК в ее составе как шаблон достраивая теломеры в процессе репликации ДНК.

У бактерий Обратные транскриптазы также найдены в бактериальных ретронах, последовательности, кодирующие обратную транскриптазу и используются в синтезе боДНК.

Использование человеком

В молекулярной биологии и генной инженерии обратную транскриптазу используется в зворотнетранскрипцийний полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР или RT-PCR). Классическая методика ПЦР может быть застсована только к ДНК, но с помощью обратной транскриптазы, РНК может быть транскрибировано в ДНК, делая возможным ПЦР-анализ молекул РНК. Кроме того, ОТ-ПЦР используется для получения кДНК - копии эукариотического гена, не содержит интронов. Для этого из организма выделяют зрелую мРНК, кодирующей соответствующий генный продукт (белок, РНК) и проводят с ним обратную транскрипцию. Полученную кДНК можно трансформировать в клетки бактерий для получения трансгенного продукта или использовать для создания кДНК-библиотек мРНК.

Значение обратной транскрипции

Обратной транскрипцией, как известно, называют синтез полинуклеотидных цепей молекул ДНК по матрице РНК, в отличие от обычной (прямой)

Обратная транскрипция катализируется особым ферментом, который находится в составе РНК-содержащих опухолеродных вирусов, именуемых, по современной терминологии, ретровирусами. Фермент, осуществляющий обратную транскрипцию, получил название РНК-зависимой ДНК-полимеразы, или обратной транскриптазы, а по предложению академика В. А. Энгельгардта ему было дано короткое наименование -- ревертаза.

Вскоре же после обнаружения ревертазы в составе ретровирусов стало очевидно, что это открытие имеет по крайней мере три существенных аспекта. Во-первых, выяснилось, что прочно утвердившийся центральный постулат молекулярной биологии, коротко записываемый как цепочка ДНК >РНК > белок, нуждается в существенном дополнении: между первыми двумя членами этой триады необходимо добавить еще одно направление передачи генетической информации и записать всю цепочку в виде ДНК = РНК > белок. Во-вторых, присутствие ревертазы в составе ретровирусов сразу же указало на биологическую роль этого фермента в переписывании генетической информации ретровируса из РНК- в ДНК-форму. ДНК, синтезированная путем обратной транскрипции по РНК вируса, может служить в свою очередь матрицей для ДНК-зависимого синтеза ДНК. Тем самым информация может перейти в форму двойной нити ДНК, которая именуется провирусом. Провирус взаимодействует с генетическим аппаратом клетки, в результате чего происходит воссоединение (интеграция) геномов клетки и вируса. Такая интеграция -- необходимое звено в размножении ретровирусов и в превращении нормальной клетки в трансформированную. Наконец, в третьих, ревертаза обладает замечательной способностью использовать любые РНК в качестве матриц при наличии подходящей затравки. Поэтому открылся принципиально важный путь превращения любых РНК в ДНК-форму, то есть путь синтеза генетического материала вне клеток, в пробирке, «синтез генов».

Таким образом, обратная транскрипция положила начало двум совершенно новым направлениям в биологии: с одной стороны, изучению детальных механизмов размножения опухолеродных вирусов и их трансформирующего действия на клетки, а с другой -- получению генетического материала любой заданной специфичности, а это незаменимый инструмент исследования для широкого круга вопросов не только молекулярной биологии, но и молекулярной генетики, биологии развития, эмбриологии и др. От синтеза генетического материала в однотяжевой форме существует путь к получению двутяжевой формы ДНК, а следовательно, сочетание обратной транскрипции и репликации позволяет получать фрагменты ДНК, в том числе структурные гены и в принципе даже полные гены, включающие регуляторные участки, которые можно размножить методами генетической инженерии.

Все эти перспективы, открывшиеся перед молекулярной биологией, были достаточно быстро осознаны представителями молекулярной биологии, и в ряде стран началась широкая, интенсивная работа.

В 1971 г. академик В. А. Энгельгардт выдвинул идею организации особого международного научного проекта для целенаправленного развития исследований по обратной транскрипции на основе единой согласованной научной программы. К сотрудничеству были привлечены академии наук Германии и Чехословакии.

Развитие работ по обратной транскрипции требовало согласованных усилий представителей разных научных дисциплин -- молекулярных биологов, энзимологов, вирусологов, химиков-органиков, генетиков, онкологов.

Чтобы дать представление о характере этих работ, следует хотя бы коротко упомянуть некоторые полученные результаты.

В 1976 г., вскоре после работ американских и швейцарских исследователей, участники проекта по изучению обратной транскрипции синтезировали с использованием ревертазы структурные гены глобинов. Затем синтезированные гены были использованы для получения рекомбинантных молекул ДНК, которые в свою очередь после введения в бактерии были размножены. Этот общий подход к синтезу генов и их размножению методами генетической инженерии был разработан на генах белков-глобинов, а затем использован для генов иммуноглобулинов мышей, инсулина рыб и др. Подобные исследования весьма важны. Некоторые полученные рекомбинантные ДНК -- весьма ценные инструменты исследования, другие -- имеют большое практическое значение.

В 1974 г. впервые удалось показать, что короткие (8--9-членные) олигодезоксирибонуклеотиды, полученные в результате органохимического синтеза, могут быть эффективными и избирательными «фазовыми» затравками обратной транскрипции, если они по своей нуклеотидной последовательности комплементарны определенному участку РНК-матрицы. Важность этой универсальной системы обратной транскрипции состоит в том, что с определенных, заранее выбранных участков молекул РНК можно получать фрагменты ДНК, однородные по своей структуре. Способ инициации обратной транскрипции с помощью фазовых затравок лег в основу метода расшифровки первичной структуры РНК, основанного на том, что аналоги субстратных нуклеозидтрифосфатов под действием ревертазы включаются в растущую цепь ДНК, однако они лишены З'ОН-группы, и из-за невозможности присоединить очередной нуклеотид синтез обрывается. При подборе определенных концентраций субстратов и аналогов синтез останавливается статистически, то есть образуется набор фрагментов ДНК, оканчивающихся одинаковым нуклеотидом. Если образующиеся фрагменты ДНК разделить электрофорезом в полиакриламидном геле, то затем легко определить расстояние от 5'-конца фрагмента до данного З'-концевого нуклеотида непосредственно на радиоавтограмме геля. Если продукт синтеза подвергнуть химической модификации, приводящей к раскрытию вторичной структуры, то распределение полос на геле становится гораздо более отчетливым и полным. Это значительно ускоряет анализ и делает его более надежным.

Ясно, что при обратной транскрипции важная роль принадлежит олигонуклеотидной затравке, без которой многие исследования делаются невозможными. Поэтому большое значение имела успешно проведенная работа по твердофазному синтезу олигодезоксирибонуклеотидов любого заданного строения. Твердофазный метод позволяет резко сократить продолжительность синтеза (например, для синтеза декануклеотида традиционным методом требуется несколько месяцев, а твердофазным -- две недели). Второе преимущество состоит в том, что открывается прямой путь к автоматизации синтеза, к созданию специальных приборов -- «синтезаторов». Помимо синтеза затравок этот метод используется для синтеза особых «линкеров», нужных для получения рекомбинантных молекул ДНК.

В результате детального анализа механизма обратной транскрипции, удалось установить, что в начале синтеза главную роль играет не двуспиральный комплекс матрица--затравка (как предполагали некоторые исследователи), а З'ОН-группа, расположенная на определенном расстоянии от полинуклеотидной цепи матрицы. При удлинении цепи в ходе синтеза было обнаружено новое, весьма своеобразное явление: ревертаза может вести синтез непрерывной цепи ДНК даже в том случае, когда в полинуклеотидной цепи матрицы имеется перерыв ковалентной структуры. Возможно, что способность ревертазы переходить с одной матрицы на другую без перерыва в цепи синтезируемой ДНК -- это специальное приспособление для синтеза провирусной ДНК при попадании ретровирусов в клетки.

Как уже упоминалось, фермент ревертаза входит в состав ретровирусов. В нормальных клетках также обнаруживаются ферменты, имеющие ревертазоподобную активность, однако они представляют собой либо обычные клеточные ДНК-полимеразы, либо происходят от ретровирусов. Уже давно в работах одного из первооткрывателей ревертазы X. Темина было высказано предположение о существовании обратной транскрипции в нормальных клетках, однако до сих пор этот вопрос остался невыясненным.

При тщательном изучении препарата ДНК-полимеразы из кишечной палочки обнаружили фракцию, обладающую РНК-зависимой ДНК-полиме-разной активностью, полностью отделимую от обычной ДНК-зависимой активности. Ряд свойств новооткрытого фермента резко отличает его от обычной ДНК-полимеразы, поэтому можно думать, что это отдельный, самостоятельный белок, а не часть какого-либо другого фермента. Весьма интересно, что количество бактериальной ревертазы при переносе с бедной среды на богатую в клетках кишечной палочки значительно возрастает, то есть индукция, сопровождающаяся активацией синтеза РНК и белков, активирует и ревертазу. Еще не известно, какие функции в нормальной бактериальной клетке выполняет этот фермент. В последнее время удалось обнаружить, что при индукции ферментов в клетках животных, по-видимому, наблюдаются сходные явления, то есть не исключено, что и в клетках эукариот при определенных состояниях может существовать обратная транскрипция, не связанная с размножением ретровирусов.

Важной составной частью исследований по обратной транскрипции было развитие исследований по ретровирусологии. Учитывалось, что выяснение молекулярных основ трансформирующего действия ретровирусов на клетки представляет большой теоретический интерес и может иметь также непосредственное практическое значение для онкологии.

В последнее время для онковирусологических исследований первостепенную важность приобрели методы генетической инженерии, так как они позволяют осуществлять размножение определенных участков геномов ретровирусов и клеток, имеющих отношение к трансформации. При обратной транскрипции РНК вируса саркомы мышей во вскрытых вирусных частицах были получены двутяжевые молекулы ДНК, содержащие ген, ответственный за трансформацию (онкоген) этого вируса. Синтезированный фрагмент был введен в бактериальную плазмиду, и были получены рекомби-нантные молекулы ДНК, которыми трансформировали клетки бактерий. В результате удалось выделить клоны Е. coli, содержащие онкоген. ДНК полученного клопа использовали в радиоактивной форме для поиска клона бактериофага лямбда, содержащих встроенные фрагменты клеточного генома, родственные онкогену. Такие клоны удалось обнаружить в коллекции (библиотеке) емкостью 1 млн. клонов, содержащих гены человека. Клоны, содержащие нуклеотидные последовательности вирусов лейкоза и саркомы мышей, были найдены также в библиотеке генов крысы, извлечены и картированы. Обнаружены клеточные онкогены человека и крысы, гомологичные онкогену вируса саркомы мышей, создана база для выяснения возможной роли этих онкогенов в возникновении рака у человека.

Большое внимание привлекал вирус лейкоза крупного рогатого скота, так как заболевание, вызываемое этим вирусом, причиняет серьезные убытки животноводству. Вирус лейкоза был получен в высокоочищенном состоянии и в значительных количествах; изучены его физико-химические свойства, выделена и охарактеризована ревертаза этого вируса.

Значительные усилия были направлены на изучение диагностики предлейкозного состояния животных. Были отработаны и проверены при массовых испытаниях два количественных теста -- по ревертазной активности и иммунохимический. Полученные результаты дают основания для внедрения в ветеринарную практику этих новых приемов диагностики. Предложен новый метод определения ревертазной активности; без применения радиоактивных изотопов, что сделает возможным его массовое использование.

В конце 1997 г. в журнале «Nature» была опубликована работа группы Ролфа Цинкернагеля (Zinkemagel) из Цюриха, в которой показано, что в некоторых клетках животных, содержащих обратную транскриптазу ретровирусов, могут образовываться ДНК-копии других РНК-содержащих вирусов. Это захватывающее открытие означает, что обратная транскриптаза, кодируемая ретровирусами, потенциально способна делать копии ДНК с других молекул РНК, присутствующих в клетке. Значит, возможно образование свободных ДНК-копий (их называют кДНК, или ретротранскрипты) собственных генов по матрице мРНК. Эта идея, допускающая теоретическую возможность передачи генетической информации от сомы к зародышевой плазме (о чем и говорил Тед Стил еще в 1979 г.), приблизила нашу теорию об эволюции иммунной системы позвоночных к реальности.

В практике генной инженерии широко распространен метод искусственного получения генов, основанный на их ферментативном синтезе с помощью механизма обратной транскрипции. Этот механизм связан с активностью РНК-зависимой ДНК-полимеразы или обратной транскриптазы -- фермента, с помощью которой, можно синтезировать практически любой индивидуальный ген в присутствии соответствующих иРНК, методы выделении которых достаточно разработаны.

Наиболее детально изучена ревертаза ретровирусов птиц. Каждый вирион содержит около 50 молекул этого фермента. Обратная транскриптаза состоит из двух субъединиц -- a (65 кДа) и b (95 кДа), присутствующих в эквимолярном количестве. Обратная транскриптаза обладает, по крайней мере, тремя ферментативными активностями:

1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК;

2) активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК - ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;

3) ДНК-эндонуклеазной активностью.

Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина. Очищенная обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-матрицах. Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер). Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реакции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК.

Обратную транскриптазу преимущественно используют для транскрипции матричной РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию обратной транскрипции проводят в специально подобранных условиях с использованием сильных ингибиторов РНКазной активности. При этом удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых молекул РНК. В качестве праймера при обратной транскрипции поли (А)-содержащих мРНК используют олигo (dT), а для молекул РНК, не имеющих З'-поли (А) концов, -- химически синтезированные олигонуклеотиды, комплементарные З'-концу изучаемой РНК. После синтеза на мРНК комплементарной цепи ДНК и разрушения РНК (обычно применяют обработку щелочью) осуществляют синтез второй цепи ДНК. При этом используют способность ревертазы образовывать на 3'-концах одноцепочечных кДНК самокомплементарные шпильки, которые могут выполнять функции праймера.

Матрицей служит первая цепь кДНК. Данная реакция может катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой I E. coli. Показано, что сочетание этих двух ферментов позволяет повысить выход полноценных двухцепочечных молекул кДНК. По окончании синтеза первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Образующиеся при этом концы не всегда оказываются тупыми, и для повышения эффективности последующего клонирования их репарируют до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Полученную двухцепочечную кДНК можно затем встраивать в клонирующие векторы, размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований.

Механизм обратной транскрипции

Основной подход к исследованию мРНК базируется на методе обратной транскрипции, происходящем из открытия Д. Балтимором, Р. Дульбекко и Г. Теминым явления обратной транскрипции у вирусов. Ими был описан фермент обратная транскриптаза, который, используя молекулу РНК в качестве матрицы, строит вторую, комплементарную, цепь, но уже ДНК. Такая одноцепочечная комплементарная ДНК получила название кДНК(cDNA). Лабораторными методами эту кДНК можно «умножить» в миллионы раз и сохранить для последующего анализа. На методе обратной транскрипции базируются многие современные методы исследования для анализа клеточной системы транскрипции-трансляции.

Однако тут есть один нюанс -- чтобы обратная транскрипция началась, нужна короткая стартовая «затравка» (праймер), которая была бы комплементарна 3'-концу РНК. До сегодняшнего дня в качестве универсального праймера в основном использовался олигонуклеотид поли(Т), комплементарный поли(А)-хвосту. Теперь, когда оказалось, что поли(А)-хвост не столь уж инвариантен, возникает вопрос: является ли «универсальный» поли(Т)-праймер настолько уж универсальным? В свете описанного открытия, возможно, он может не связываться и не выявлять целые пулы мРНК с уридинами на 3'-конце, которые оказываются фактически «невидимыми» для традиционных алгоритмов в молекулярной биологии. А если учесть, что метод обратной транскрипции на основе поли(Т) и последующая ПЦР-диагностика являются сейчас основными инструментами для определения экспрессии генов, открытие альтернативных 3'-концов может вызвать необходимость пересмотреть истинность целых массивов данных, которые сегодня считаются исходной базой для молекулярных исследований.

Как известно, у многих вирусов геномом служит не ДНК, а РНК (это т.н. РНК-содержащие вирусы). Для репликации таких геномов используются две ферментативные системы.

В одних случаях (у ретровирусов, в т.ч. вируса СПИДа некоторых онкогенных вирусов) это обратная транскриптаза, или РНК-зависимая ДНК-полимераза. Она последовательно катализирует три процесса:

1. Синтез (-) - цепи ДНК на вирусной (+)- РНК как на матрице;

2. Разрушение вирусной РНК в составе образовавшегося гибрида РНК-ДНК;

3. Синтез (+) - цепи ДНК на (-)- цепи с образованием двухцепочечной ДНК.

Последняя обычно интегрируется в геном хозяйской клетки и служит матрицей для синтеза вирусных мРНК РНК полимеразной системой. Так что синтез РНК здесь происходит обычным способом.

Более распространен иной способ репликации РНК-содержащих вирусов. При нем используется другой фермент - РНК-синтетаза (или РНК-зависимая РНК-полимераза). Здесь на вирусной РНК как на матрице синтезируется не ДНК, а РНК. Причем это происходит в цитоплазме зараженной клетки: в одних случаях - вне вирусной частицы, в других - внутри таковой.

В разных вирусах с РНК-синтетазным механизмом репликации используются несколько отличающиеся схемы. Это, главным образом, зависит от того, какая именно РНК служит в качестве генома.

(+)- РНК-содержащие вирусы, использующие РНК-синтетазу

В пикорновирусах содержится т.н. (+)- РНК. Это значит, что она может непосредственно использоваться в трансляции как мРНК.

Внутри вирусной частицы РНК не ассоциирована с белком. Поэтому после того, как вирус попадает в клетку и теряет свою оболочку, его РНК становится доступной для связывания с нею рибосом клетки.

При этом образуется единая полипептидная цепь, которая затем расщепляется на 7 вирусных белков. Шесть из них затем войдут в состав новых вирусных частиц, а седьмой белок - фермент РНК-синтетаза, отсутствующий в вирусных частицах.

Таким образом, репликации вирусной РНК может начинаться только после ее трансляции и накопления какого-то количества РНК-синтетазы.

Сама же репликация идет в два этапа. На первом этапе на (+)- РНК как на матрице образуются (-)- цепи РНК, на втором этапе эти (-)- цепи РНК служат матрицей для синтеза (+)- цепей РНК, идентичных вирусным.

Эти вновь образованные (+)- цепи РНК могут использоваться по трем направлениям:

- в трансляции (как мРНК) для образования вирусных белков;

- в репликации - для образования новых цепей РНК;

- в сборке (вместе с вирусными белками) новых вирусных частиц.

(-)- РНК-содержащие вирусы

Другие вирусы (например, рабдовирусы и парамиксовирусы) содержат (-)- РНК, к трансляции не способную. Вместо трансляции она участвует (как матрица) в транскрипции - образовании пяти моноцистронных (+)- РНК, которые и выступают впоследствии в качестве мРНК. Процесс катализируется РНК-синтетазой, содержащейся в вирусной частице.

В связи с иной биологией вирус имеет и иную, более сложную, организацию. В частности, (-)- РНК упакована с помощью белков в т.н. нуклеокапсид, в составе которого остается и после проникновения вируса в клетку.

Среди белков нуклеокапсида находятся два фермента - разновидности РНК-синтетазы. Один фермент осуществляет уже упоминавшуюся транскрипцию (-)- РНК. Образующиеся при этом вирусные пре-мРНК подвергаются созреванию: у них формируются «колпачки» и поли (А)-фрагменты. Вероятно, лишь после этого мРНК покидают матричный нуклеокапсид и связывается с рибосомами зараженной клетки.

В какой-то момент нуклеокапсид перключается на другой процесс - репликацию. Возможно, это достигается путем модификации ферментов или всего нуклеокапсида. Как бы то ни было, репликация осуществляется другой разновидностью РНК- синтетазы.

Процесс вновь включает 2 этапа:

- образование на (-) -цепи как на матрице (+) -цепи РНК и

- образование на (+)-цепи как на матрице (-)-цепей РНК.

Новосинтезированные (-)-РНК покидают нуклеокапсид и объединяются с новосинтезированными же вирусными белками в новые нуклеокапсиды.

(±)- РНК-содержащие вирусы

Наконец, реовирусы содержат в качестве генома около 10 различных двухцепочечных молекул РНК, которые можно обозначить как (±)-РНК.

Принцип репродукции этих вирусов такой же, как если бы геномом явялялась двухцепочечная ДНК. Только ключевым ферментом является РНК-синтетаза.

Неоднократно транскрибируя (-)-цепи (±)-РНК, данный фермент образует (+)-цепи, выступающие в качестве мРНК. А для накопления новых двухцепочечных молекул (±)-РНК, очевидно, необходимо использование в качестве матрицы обеих цепей вирусной РНК. Применение обратной транскрипции в молекулярной биологии вирусов. Значение для вирусов Обратная транскрипция необходима, в частности, для осуществления жизненного цикла ретровирусов, например, вирусов иммунодефицита человека и T-клеточной лимфомы человека типов 1 и 2. После попадания вирусной РНК в клетку обратная транскриптаза, содержащаяся в вирусных частицах, синтезирует комплементарную ей ДНК, а затем на этой цепи ДНК, как на матрице, достраивает вторую цепь. Значение для эукариот Ретротранспозоны эукариот кодируют обратную транскриптазу, которая используется ими для встраивания в геном хозяина подобно тому, как это происходит у вирусов. Роль в генетической инженерии и молекулярной биологи. В генетической инженерии обратную транскриптазу используют для получения кДНК -- копииэукариотического гена, не содержащей интронов. Для этого из организма выделяют зрелую мРНК, кодирующую соответствующий генный продукт (белок, РНК) и проводят с ней в качестве матрицы обратную транскрипцию. Полученную кДНК можно трансформировать в клетки бактерий для получения трансгенного продукта. Обратная транскриптаза (ревертаза) является РНК-зависимой ДНК полимеразой и используется для синтеза первой цепи комплиментарной ДНК с одноцепочечной РНКматрицы. Для инициации реакции необходим олигодезоксинуклеотид (специфический или случайный праймер). Особенностью ревертазы является ее способность после завершения синтеза молекулы кДНК нематрично присоединять к 3'-концу первой цепи кДНК несколько дезоксинуклеотидов (преимущественно G или C), что позволяет использовать первую цепь для синтеза полноразмерных библиотек кДНК и клонирования 5'-концов кДНК (5'-RACE).

ПЦР с обратной транскрипцией (для получения кДНК)

Исходным материалом для ПЦР служит геномная ДНК или мРНК. В последнем случае из мРНК путем обратной транскрипции получают кДНК, которую затем используют в ПЦР. Такое исследование получило название метода ПЦР с обратной транскрипцией.

За создание метода ПЦР (полимеразная цепная реакция) Керри Мюллису в 1993 году была присуждена Нобелевская премия.

ПЦР позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (несколько десятков пар нуклеотидов ДНК или РНК) любого организма, содержащийся в следовых количествах среди огромного количества нуклеотидных последовательностей иной природы, и быстро размножить его. По сути дела метод ПЦР имитирует в пробирке естественную репликацию ДНК, только повторяющуюся с огромной скоростью и столько раз, сколько это необходимо исследователю.

Метод включает несколько этапов: расплетание двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и последующее комплементарное дополнение (достройку) обеих с помощью специального фермента. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках.

Для проведения такого процесса используют две генетические пробы (праймеры), которые служат в качестве затравки для синтеза второй цепи на однонитевой ДНК. Праймеры - это искусственно синтезированные короткие нуклеотидные последовательности (15-30 нуклеотидов), комплементарные концам размножаемых (амплифицируемых) участков нитей ДНК. Понятно, что, чтобы иметь нужные праймеры, необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка ДНК, который требуется размножить.

Сначала двунитевую ДНК нагреваю т до температуры около 100 град. С. При этом комплементарные нити ДНК расходятся между собой (ДНК денатурирует). Затем к обеим нитям ДНК по принципу комплементарности присоединяют искусственно синтезированные праймеры, в результате чего образуются короткие двунитевые "стартовые" участки. Далее в действие вступает специфический бактериальный фермент - Taq-полимераза, устойчивая к высоким температурам, при которых другие белки теряют свои свойства. Термоустойчивая полимераза осуществляет in vitro синтез вторых цепей ДНК на каждой из двух денатурированных цепей. После нового прогрева до 100град.С уже вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации - это и есть цепная реакция ПЦР.

В результате такого "тиражирования" за 2-3 часа количество копий фрагмента ДНК увеличивается в геометрической прогрессии, и через 25 циклов амплификации синтезируется 10⁶ копий фрагмента. Такого количества ДНК достаточно, чтобы визуально регистрировать с помощью простых приемов, которые давно используются молекулярными биологами.

Метод амплификации ДНК с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) оказал революционное влияние на генодиагностику. Для использования метода необходимо знать последовательность нуклеотидов на исследуемом участке ДНК.

Поскольку ДНК-полимераза не способна сама начать репликацию и может только достраивать комплементарную цепь к уже имеющемуся двухцепочечному участку, то сначала синтезируют два олигонуклеотида (так называемых праймера), комплементарных участкам противоположных цепей ДНК, обычно отстоящих друг от друга на несколько сотен пар нуклеотидов. Праймеры инкубируют с ДНК, намеченной для амплификации, и ДНК-полимеразой, которая, как известно, синтезирует комплементарные цепи в направлении 5'-3'. Специфичность реакции зависит от правильного выбора праймеров.

В ходе реакции последовательно меняют температуру: при температуре 90-95 градусов по С происходит разделение цепей ДНК, при температуре 40-60 градусов по С - присоединение праймера (отжиг), при температуре 72 градуса по С - синтез цепей ДНК.

В реакции используют термостойкую ДНК-полимеразу, которая не теряет активности в течение всей процедуры.

После ряда таких циклов, обычно 20-30 и более, образуются сотни тысяч копий исходной последовательности, расположенной между праймерами. Метод настолько чувствителен, что его можно использовать, например, для амплификации и анализа единственного участка ДНК из одного сперматозоида человека.

Для ПЦР пригоден минимально обработанный исходный биологический материал, даже частично разрушенный, что позволяет исследовать цельную кровь, пятна высохшей крови, смывы из ротовой полости, старые срезы ткани и другие образцы. Исходным материалом для ПЦР служит геномная ДНК или мРНК. В последнем случае из мРНК путем обратной транскрипции получают кДНК, которую затем используют в ПЦР, - так называемый метод ПЦР с обратной транскрипцией.

Метод ПЦР служит основой для дальнейших исследований амплифицированной последовательности:

- расщепления рестриктазами;

- гибридизации с аллель-специфическими олигонуклеотидными зондами;

- определения нуклеотидной последовательности;

- исследования экспрессии in vitro с целью поиска мутаций, укорачивающих молекулу белка.

Различные модификации метода применяются для:

- синтеза одноцепочечной ДНК путем изменения соотношения олигонуклеотидных праймеров;

- создания рекомбинантных ДНК;

- исследования мутагенеза клонированной ДНК;

- сравнения экспрессии разных аллелей;

- выявления редких нуклеотидных последовательностей или ДНК возбудителей инфекции.

ПЦР можно провести всего за один день, ее легко автоматизировать, реакция сравнительно недорога и чрезвычайно специфична.

Принцип ПЦР заключается в чередовании циклов гибридизации одноцепочечных ДНК или РНК с мечеными олигонуклеотидными зондами (праймерами), синтеза комплементарной нуклеотидной последовательности с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и денатурации образовавшихся двухцепочечных структур путем нагревания. За 20-30 циклов количество копий нужного фрагмента нуклеиновой кислоты достигает нескольких миллионов.

Для определения продукта реакции, как правило, используют хемилюминесценцию.



Заключение

В заключении хотелось бы отметить, что открытие фермента ревертазы и процесса обратной транскрипции - большое событие не только в генетике, но и молекулярной биологии вообще. Прежде всего оно внесло изменение в формулировку основного постулата в молекулярной биологии: ДНК®РНК®белок. В связи с тем, что первый этап процесса передачи наследственной информации оказался в некоторых случаях обратимым, теперь эта формулировка приняла такой вид: ДНК «РНК®белок.

Открытие процесса обратной транскрипции не поколебало основного генетического постулата матричной теории наследственности, а лишь уточнило его. Оказалось, что в редких, особых случаях РНК может служить матрицей для ДНК. Но генетическая информация всегда сначала переписывается на РНК, а затем переводится (транслируется) на аминокислотную последовательность белков. С белков в нуклеиновые кислоты



Список литературы

1. Темин Г. РНК направляет синтез ДНК. М.: Природа, 1972. № 9.

2. Гершензон С. М. Обратная транскрипция и ее значение для общей генетики и онкологии. М., 1973, т. 75, №3.

3. Стент Г., Молекулярная генетика, пер. с англ. М., 1974. гл. 16.

4. Пташне М. Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг лямбда. М.: Мир, 1989. 160 с.

5. Агол В.И., Богданов А.А., Гвоздев В.А. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот: Учеб. для биол. спец. вузов / Под ред. А.С. Спирина. М.: Мир, 1982. 440 с.

6. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов. М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2003. 544 с.

7. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: В 3-х т. Т. 1. Пер. с англ.: - М.: Мир, 1987. 295 с.

8. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: В 3-х т. Т. 2. Пер. с англ.: - М.: Мир, 1988. 368 с.

9. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: В 3-х т. Т. 3. Пер. с англ.: - М.: Мир, 1988. 335 с.

10. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд., перераб М75 и доп. Т. 1. Пер. с англ.: - М.: Мир, 1994. 517 с.

11. Гюнтер Э., Кемпфэ Л., Либберт Э. Основы общей биологии: пер. с нем./Под общей ред. Э. Либберта. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.

12. История биологии с начала XX века до наших дней. М.: Наука, 1975. 660 с.

13. Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987. 1064 с.

14. Уотсон Дж. Д. Двойная спираль: воспоминания об открытии структуры ДНК. М.: Мир, 1969. 152 с.

15. Жимулев И.Ф., Общая и молекулярная генетика; Учеб. пособие.-2-е изд., Новосибирск: Сиб.унив. изд-во, 2003, 479 с.

Размещено на Allbest.ru