Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГБОУ ВО «Воронежский государственный лесотехнический университет им. Г.Ф. Морозова»

ДНК-АНАЛИЗ КАК ОДИН ИЗ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ ФИТОПАТОГЕНОВ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ

Калошин В.П.

Аннотация

На основе изучения ДНК-анализа - как одного из методов выявления фитопатогенов древесных растений установлено, что проводить фитопатологическое обследование лесных питомников на основании использования методов ДНК-маркирования и внедрение технологии ранней диагностики и идентификации болезней древесных растений в лесохозяйственную практику позволяют выявлять и идентифицировать фитопатогены как в посадочном материале, так и объектах окружающей среды (почва, растительные остатки и др.). Кроме того, существенными моментами ДНК-диагностики, в отличие от визуальной фитопатологической оценки, являются точная постановка диагноза, а также возможность выявления болезней на самых ранних стадиях ее развития.

Ключевые слова: фитопатогены, ДНК-анализ, идентификации болезней, диагностика.

Annotation

болезнь древесный растение диагностика

DNA ANALYSIS - AS ONE OF THE METHODS FOR IDENTIFYING PHYTOPATHOGENS OF WOOD PLANTS

Kaloshin V.P. FGBOU VO "Voronezh State Forestry University after G.F. Morozova ", Voronezh

Based on the study of DNA analysis, as one of the methods for identifying plant pathogens of tree plants, it has been established that conducting phytopathological examinations of forest nurseries based on the use of DNA labeling methods and introducing the technology of early diagnosis and identification of tree plant diseases in forest management practice identify and identify phytopathogens in both the plant material and environmental objects (soil, plant residues, etc.). In addition, the essential points of DNA diagnostics, in contrast to the visual phytopathological assessment, are accurate diagnosis, as well as the ability to detect diseases at the earliest stages of its development.

Keywords: phytopathogens, DNA analysis, disease identification, diagnosis.

Основная часть

Зачастую возникновение и развитие заболеваний связано с первичным ослаблением и снижением устойчивости сеянцев и саженцев вследствие длительного неблагоприятного воздействия метеорологических факторов (засуха, заморозки и др.) или нарушения агротехники выращивания. Также немаловажным является и использование зараженных семян или почвенных субстратов. Мероприятия по защите сеянцев и саженцев древесных пород от болезней представляют собой использование целого комплекса агротехнических, биологических, химических, физикомеханических и других методов. Для более достоверной диагностики заболеваний выполняют микроскопирование пораженных тканей с целью обнаружения патогенного микроорганизма и его идентификации по структуре мицелия и плодовых тел, особенностям спороношения. Микроскопический метод является наиболее распространенным в практике специализированных лабораторий лесозащитных организаций. Недостатками исследования фитопатогенов путем пересева инфекционного начала в чистую культуру являются длительность исследований, их трудоемкость и отсутствие специфических сред для каждого конкретного вида возбудителя болезни. На текущий момент наиболее современными и перспективными способами диагностики и видовой идентификации болезнетворных микроорганизмов являются методы, основанные на применении технологий молекулярной генетики. Общие принципы диагностики возбудителей инфекционных заболеваний сводятся к выявлению генетического материала патогена в тканях хозяина или образцах почвы, воды, воздуха, соскобах, пыли и др. с помощью специфических реактивов и оборудования.

Проводится фитопатологическое обследование лесных питомников на основании использования методов ДНК-маркирования и внедрение технологии ранней диагностики и идентификации болезней древесных растений в лесохозяйственную практику. Процедура молекулярно-фитопатологической диагностики состоит из следующих стадий (рис.1): выделение суммарной ДНК из инфицированных растений, амплификация локусов грибной ДНК методом ПЦР, расшифровка структуры амплифицированных локусов (секвенирование), сравнительный анализ в базе данных (идентификация). Выделение суммарной ДНК из растительного материала, растительных остатков выполняется CTABметодом, почвы - PEG-методом. Для установления видовой принадлежности изолятов проводится амплификация и секвенирование региона рДНК, включающего следующую последовательность локусов: 18S рРНК - ВТС1 - 5,8S рРНК - ВТС2 - 28S рРНК. ПЦРанализ выполняется на основании использования DreamTaq™ Green PCR Master Mix (Fermentas, Литва) при следующих параметрах реакции: начальная денатурация - 5 мин при 95єC, последующие 35 циклов - 20 сек. при 95єC, 25 секунд при 67єC и 45 секунд при 72єC, финальная элонгация - 8 мин при 72єC.

Рис. 1 Схема проведения молекулярно-генетической диагностики патогенов в лесном посадочном материале

Для амплификации используютя праймеры ITS1 и ITS4. Предварительный анализ продуктов амплификации выполняетя с помощью электрофоретического фракционирования в 2,5% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием, а также дополнительным рестрикционным анализом. Альтернативные по размеру и рестрикционным спектрам (MspI, AluI, TaqI, RsaI, HhaI) ампликоны отбираются для последующего секвенирования. Секвенирующая реакция выполняется на основании использования набора BigDye Terminator Sequence Kit v.1.1 (Applied Biosystems, США) согласно протоколу компании-изготовителя. Электрофоретическое фракционирование проводится с помощью генетического анализатора ABI Prism 310 (Applied Biosystems, США), интерпретация результатов - программного обеспечения Sequence Analysis 5.1.1 (Applied Biosystems, США). Для установления (подтверждения) видовой принадлежности образцов, нуклеотидная структура секвенированных ампликонов анализируется с помощью программы BLAST в GenBank NCBI. В ходе проводимой молекулярно-генетической диагностики посадочного материала в инфицированных растениях выявляется наличие генетического материала патогенов. Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов, образцов инфицированных растений хвойных пород на фореграммах представлены окрашенными зонами - выявляемый генетический материал патогенных микромицетов, в то же время здоровые растения характеризуются отсутствием ДНК возбудителей заболеваний (рис. 2). При использовании технологии ПЦР в реальном времени у зараженных растений в ходе прохождения программы амплификации наблюдается накопление ПЦР- продукта (наличие S-образной кинетической кривой), у здоровых образцов график амплификации являлся горизонтальным, а уровень сигнала находился в пределах уровня детекции фоновых значений (рисунок 2). ДНК-спектры посадочного материала лиственных пород (дуба, клена, липы, березы), кроме генетического материала патогена в случае инфицированных растений, содержат и ампликоны растения-хозяина, что связано с гомологией регио нов генов 18S и 28S рРНК грибов и покрытосеменных растений (рис. 3). Здоровые сеянцы и саженцы характеризуются наличием только одной окрашенной зоны, специфичной для исследуемой породы. Диагностическая особенность лиственных пород используется в качестве дополнительного внутреннего контроля протекания ПЦР-реакции. Отсутствие фракции растения- хозяина в ПЦР-спектре указывает на нарушение технологии молекулярно-фитопатологического анализа.

Рисунок 2 Молекулярно-фитопатологическая диагностика посадочного материала хвойных методами а) классической ПЦР и б) ПЦР в реальном времени

Рисунок 3 Молекулярно-фитопатологическая диагностика посадочного материала лиственных пород

Расположение фракций на электрофореграмме зависит от размера выявляемого фрагмента ДНК патогена и является величиной видоспецифичной. Данный признак используется в качестве первичного критерия при проведении идентификации возбудителя заболевания. Для образцов инфицированных растительных тканей получены многофракционные ПЦР- спектры, что свидетельствует о содержании генетического материала более чем одного вида патогенов. Несмотря на многофракционный тип выявляемых спектров, наибольшей интенсивностью характеризуется какой-либо один или несколько доминирующих альтернативных вариантов ампликонов, что указывает на большое количественное содержание соответствующего ему вида гриба в исследуемом образце.

Выводы

Методы ДНК-анализа позволяют выявлять и идентифицировать фитопатогены как в посадочном материале, так и объектах окружающей среды (почва, растительные остатки и др.). Кроме того, существенными моментами ДНК-диагностики, в отличие от визуальной фитопатологической оценки, являются точная постановка диагноза, а также возможность выявления болезней на самых ранних стадиях ее развития.

Список литературы

1. Баранов О. Ю. и др. Молекулярно-генетическая диагностика грибных болезней в лесных питомниках // Лесн. и охот. хоз-во. 2012. № 6. С. 21-29.

2. Баранов О. Ю., Ярмолович В. А., Пантелеев С. В. Молекулярно-генетические особенности пораженных шютте тканей хвои сеянцев ели европейской // Современное состояние и перспективы охраны и защи- ты лесов в системе устойчивого развития: матлы Междунар. науч. конф. Институт леса НАН Беларуси. 2013. С. 63-66.

3. Дьяков Ю. Т. Общая и молекулярная фитопатология. М.: Об-во фитопатологов, 2001. 301 с.

4. Падутов В. Е., Баранов О. Ю., Воропаев Е. В. Методы молекулярно-генетического анализа. Минск: Юнипол, 2007. 176 с.

5. СИБИРСКИЙ ЛЕСНОЙ ЖУРНАЛ. 2018. № 2. С. 15-27 http://xn80abmehbaibgnewcmzjeef0c.xnp1ai/upload/iblock/d77/d77743321cbf18b530d3ff85f60 60a80.pdf.

Размещено на Allbest.ru