Новый метод биотестирования с применением современных импедансных технологий

Размещено на http://www.allbest.ru/

Новый метод биотестирования с применением современных импедансных технологий

В.С. Сибирцев, Л.В. Красникова, А.Г. Шлейкин, С.А. Строев, И.А. Наумов, Р.О. Олехнович, В.Ф. Терещенко, Э.М. Шабанова, Мусса Аль-Хатиб

Аннотация. Представлены схемы новой модификации метода биотестирования. Эти схемы используют современные кондуктометрические технологии и основаны на анализе микробных «кривых роста», регистрация которых происходит в режиме реального времени для множества параллельных образцов. Показаны результаты сопоставления предлагаемой методики импедансного биотестирования со стандартным культуральным методом определения общего количества микроорганизмов в тестируемых образцах. Представлены результаты применения методики импедансного биотестирования в исследовании угнетающего действия дезинфектанта хлоргексидина на жизнедеятельность Escherichia coli, а также влияния ферментного препарата трансглутаминаза на процессы сквашивания молока различными видами микроорганизмов.

Предлагаемый в настоящей работе метод импедансного биотестирования обеспечивает достаточно высокий уровень сходимости своих данных с данными, получаемыми в результате применения стандартных культуральных методик биотестирования. Кроме того, предлагаемый метод имеет такие преимущества, как: (а) возможность получения подробной информации о динамике изменения численности популяции и интенсивности метаболизма тестовых микроорганизмов; (б) повышение объективности анализа; (в) значительное уменьшение расхода питательных сред, времени исследования и трудозатрат исследователя при проведении анализов.

Ключевые слова: биотестирование, кондуктометрия, антисептическая активность, импедансный анализ микроорганизмов, микробиологические кривые роста, трансглутаминаза, сквашивание.

Введение

В последнее время все более актуальными становятся проблемы разработки как можно более быстрых, объективных и доступных к массовому применению методов:

- выявления всех возможных как позитивных, так и негативных свойств новых либо модифицированных продуктов и препаратов;

- определения чувствительности к антибиотикам микроорганизмов, инфицировавших конкретного больного в каждом конкретном случае;

- оценки степени эндогенной и экзогенной интоксикации каждого конкретного больного;

- прогнозирования индивидуальной чувствительности больных к различным видам и дозам химио-, рациационной и иной терапии;

- оценки санитарно-гигиенического состояния и степени экологического неблагополучия различных, помещения, территорий, водоемов и т.п.;

- оценки степени токсичности промышленных и бытовых выбросов и стоков и т.д.

Решение вышеупомянутых проблем может быть осуществлено разными способами. Однако наиболее приемлемым и адекватным в настоящее время признано использование для этих целей тестовых биосистем. При этом в качестве последних могут быть применены как одноклеточные [1-8]; так и более высокоорганизованные организмы (такие, например, как: планктон, растения, рыбы, крысы и т.п.) [6-14]; а также культуры клеток их тканей, крови и т.д.

Использование для целей биотестирования многоклеточных организмов, с одной стороны, позволяет более адекватно моделировать с их помощью человеческий организм. Но это же делает проведение таких анализов значительно более сложным, дорогим, длительным и субъективным в оценке результатов.

Применение же в качестве тест-систем, микроорганизмов, - если не снимает совсем, то, по крайней мере, значительно уменьшает многие из вышеперечисленных недостатков. Кроме того, многие из тестируемых препаратов в качестве целевого воздействия должны угнетать или активировать жизнедеятельность тех или иных видов именно микроорганизмов, как можно меньше влияя на функционирование более высокоорганизованных организмов. И в этом случае нужно проводить отдельные исследования действия таких препаратов на одноклеточные и многоклеточные организмы.

Однако принятые в настоящее время в качестве стандартных при биотестировании процедуры оценки общей выживаемости микроорганизмов (заключающиеся, в большинстве случаев, в оценке того, насколько ингибируется - или активируется, по сравнению с контрольной группой - рост колоний тестовых микроорганизмов на агаризованной питательной среде после инкубации их в течение одних или нескольких суток в стерильных условиях при заданной температуре в присутствии истинного или коллоидного раствора с определенной концентрацией исследуемого вещества либо после воздействия иных факторов) дают весьма неполную «статичную» информацию о летальных нарушениях в жизнедеятельности тестовых организмов.

Вследствие этого ранее нами было предложено, в частности, оценивать при подобном биотестировании также нелетальные изменения структуры генома тестовых организмов (в том числе пространственной - значимо меняющейся даже при незначительном изменении характера жизнедеятельности организма) с помощью специально разработанной системы специфичных флуорофоров со взаимосогласованными спектральными и комплексообразующими с ДНК свойствами [15-18].

А в последнее время при осуществлении исследований по биотестированию с помощью одноклеточных микроорганизмов мы стали также проводить анализ их «кривых роста» с применением импедансных технологий - достаточно точно, надежно и удобно реализуемых для подобных целей в настоящее время, в частности, в таких микробиологических кондуктометрических анализаторах как «BacTrac» или «Rabit» - выпускаемых компаниями «SY-LAB GmbH» (Австрия) и «Don Whitley Scientific Limited» (Великобритания); зарегистрированных в Госреестре средств измерений РФ и эксплуатируемых в соответствии с ГОСТ 22171-90.

Описание приборной части предлагаемого метода импедансного биотестирования

Вышеуказанные приборы позволяют измерять электрический импеданс (величина, обратная проводимости средой переменного электрического тока [19]), изменяющийся вследствие преобразования тестовыми микроорганизмами в процессе их жизнедеятельности одних химических веществ в другие - в автоматическом режиме, через каждые 6 мин, параллельно для множества (до нескольких сотен) независимых жидких образцов.

При этом каждый из таких образцов заливается сначала в количестве от 2 до 10 мл в отдельную, многоразовую, измерительную ячейку (выполненную из стекла или термопластика, выдерживающих автоклавирование водяным паром, находящимся под давлением при температуре до 121°С включительно; и имеющую, у анализатора «Rabit», к примеру, диаметр 15 мм, высоту 100 мм и два электрода из нержавеющей стали длиной 15 мм, расположенных в нижней части ячейки, как показано на рис. 1). После чего может инкубироваться непосредственно в одном из измерительных модулей анализатора в течение заданного времени (от нескольких часов до нескольких суток) и при заданной температуре (в диапазоне от +3°С до +50°С).

Рис. 1. Схема измерения импеданса (а) и устройство измерительной ячейки биоанализатора «Rabit» (со стерильно-марлевой пробкой и в разобранном виде) (б)

Измерение импеданса в каждой из ячеек анализатора осуществляется контактным методом с использованием мостовой схемы, подобной показанной на рис. 1 - на вход которой подается переменный низкочастотный ток, а балансировка моста до достижения на детекторе нулевого сигнала осуществляется как по амплитуде, так и по фазе этого сигнала. При этом точность фиксации изменения количества микроорганизмов в каждом образце составляет около 10 КОЕ/мл (КОЕ - колониеобразующая единица; в соответствии с терминологией, принятой для стандартных культуральных методов определения в образцах количества жизнеспособных микроорганизмов).

Кроме того, есть возможность регистрировать изменения интенсивности метаболизма тестовых микроорганизмов при остающимся постоянным их количестве (что тоже приводит к изменению угла наклона фиксируемой анализатором зависимости импедансной электропроводности среды от времени ).

Внешний вид биоанализатора «Rabit» показан на рис. 2.

Рис. 2. Внешний вид микробиологического кондуктометрического импедансного анализатора «Rabit».

Слева - два измерительно-инкубационных блока (каждый из которых может инкубироваться при отдельно задаваемой температуре, включает 32 независимо друг от друга заполняемых образцами и измеряемых ячейки, имеет габариты 400Ч600Ч400 мм и весит 35 кг). Справа - управляющий процессорный блок, к которому может быть подсоединено до 16 измерительно-инкубационных блоков

Описание методики и результатов сопоставления предлагаемого способа импедансного биотестирования со стандартным культуральным методом

На рис. 3-5 показаны результаты сопоставления предлагаемой методики импедансного анализа микроорганизмов со стандартным культуральным методом определения в образцах общего количества клеток Escherichia coli (как наиболее широко используемого на сегодняшний день санитарно-показательного и тестового микроорганизма), реализуемого в соответствии с ГОСТ 18963-73, ГОСТ 26670-91 и ГОСТ 10444.15-94.

Рис. 3. Сопоставление типичных «кривых роста», регистрируемых для чистой культуры микроорганизмов в замкнутой системе (без добавления питательных веществ и отвода метаболитов после начала измерений): (1) непосредственно, по изменению концентрации микробных тел (n, КОЕ/мл) и (2) косвенно, по изменению удельной импедансной электропроводности среды (Д, мкСм•мл-¹). При этом, по оси абсцисс отложено время от начала измерений (, ч). Кривой (3) обозначено изменение со временем величины удельной импедансной электропроводности среды (Д(Д)/ Д, мкСм•мл-¹•мин-¹), выражаемое 1-ой производной по кривой 2. А римскими цифрами на рисунке обозначены области фаз роста микроорганизмов: I - начальной (лаг-), II - экспоненциальной (лог-), III - стационарной и IV - отмирания

Рис. 4. Графический способ определения _S - времени от начала измерений, за которое удельная импедансная электропроводность тестируемых образцов (1)-(3) (с уменьшающейся в данном ряду исходной микробной обсемененностью) увеличивается на величину Д_lim. При этом одинаковыми цифрами обозначены кривые, соответствующие наибольшему и наименьшему значениям, полученным для одной серии образцов. А _3,2,1 и _3,2,2 - верхняя и нижняя границы «доверительного интервала» для _3,2 (под коим подразумевается среднее время, за которое серия образцов с наименьшей исходной микробной обсемененностью увеличит свою удельную импедансную электропроводность на величину Д_lim2) и т.д.

Рис. 5. Результаты сопоставления предлагаемой методики импедансного биотестирования (_S в которой определяется, как показано на рис. 4) со стандартным культуральным методом определения общего количества клеток E. coli в образцах (n, КОЕ/мл). Точками обозначены экспериментальные данные, полученные для Д_lim =100 мкСм/мл (1) и Д_lim = 200 мкСм/мл (2), а прямыми - соответствующие им регрессионные зависимости: lg(n) = 5,8-0,14•_S (1) и lg(n) = 6,6-0,14•_S (2)

Общенакопительная питательная среда для микроорганизмов с рН 7,20,2 приготавливалась путем растворения в 100 мл дистиллированной воды 0,5 г сухой х.ч. глюкозы и 2 г сухой основы питательного ГРМ-бульона (изготовленной по ТУ 10-02-02-789-176-94 и содержащей 0,2 г NaCl на 1,8 г панкреатического гидролизата рыбной муки). После чего по 1,6 мл полученного бульона разливалось в каждую из 30 измерительных ячеек биоанализатора «Rabit», используемых в описываемом опыте. Затем все ячейки стерилизовались автоклавированием в течение 20 мин при температуре 121°С и остужались до комнатной температуры.

Далее по 5 ячеек в параллель засевались каждая 0,4 мл суспензии E.coli с общей обсемененностью: 0 («фоновый контроль»), 10³, 5Ч10³, 10⁴, 5Ч10⁴ и 10⁵ КОЕ/мл, соответственно. При этом вышеуказанные суспензии E. coli К 12 в такой же питательной среде, как описано выше, приготавливались методом последовательных разведений из исходной суспензии данного штамма кишечной палочки (концентрация КОЕ в которой определялась стандартным культуральным методом).

Затем все ячейки помещались в измерительный модуль анализатора «Rabit» и инкубировались там при 37°С в течение трех суток - с автоматической регистрацией через каждые 6 мин в каждой из ячеек величины полной проводимости средой гармонически переменного электрического тока.

Если же в качестве тестовых потребовалось бы использовать иные, нежели E.coli К 12, виды и штаммы микроорганизмов - то состав питательных сред для их анализов, а также время и температура инкубации могли быть выбраны другие (в соответствии с особенностями метаболизма и морфологии этих микроорганизмов).

Из результатов проведенного анализа видно, что экспериментальные импедансные «кривые роста» (определяемые по изменению тестовыми микроорганизмами удельной импедансной электропроводности среды), совпадая с теоретической «кривой роста» (непосредственно характеризующей количество микробных тел в образце) во время лаг-фазы (когда идет адаптация микроорганизмов к новым для них условиям существования) и лог-фазы (когда идет активное «экспоненциальное» размножение микроорганизмов в анализируемом образце), отличаются от последней на стационарной стадии (когда количество микроорганизмов в образце остается постоянным) и стадии отмирания (когда количество микроорганизмов в образце уменьшается - в частности, из-за истощения питательной среды - но процессы клеточного метаболизма при этом не идут в обратном направлении) (см. рис. 3).

Определение конкретного количества микроорганизмов в образце (n, КОЕ/мл) с применением импедансных технологий может быть осуществлено по калибровочному графику, который желательно строить для каждого конкретного вида и штамма тестовых микроорганизмов так, как показано на рис. 4 и рис. 5, в виде: lg(n) = a•?_S + b, где a и b - эмпирические коэффициенты (зависящие от вида и штамма тестовых микроорганизмов, температуры инкубации, характеристик питательной среды и прибора, применяемых при анализе); а ?_S - время от начала измерений, за которое тестовые микроорганизмы в ходе анализа изменяют удельную импедансную электропроводность тестируемого образца на величину ?_lim (мкСм/мл).

При этом в качестве ?_lim надежней всего было бы, конечно, выбрать ?, при котором в образце происходит переход тестовых микроорганизмов из экспоненциальной фазы роста в стационарную. Но так как это значительно увеличит время анализа (если не использовать специально обедненные питательными веществами среды), то в качестве ?_lim при построении калибровки обычно принимают какое-либо пороговое значение ? в начале экспоненциальной фазы роста образца с наибольшей исходной концентрацией тестовых микроорганизмов. При этом, как видно из рис. 4, 5, чем меньше принятое пороговое значение ?_lim - тем меньшее время затрачивается на импедансный анализ, но больше ошибка определения ?_S каждого из образцов (а соответственно, и их микробной обсемененности n). Таким образом, малые значения ?_lim лучше применять при анализе образцов с высокой ожидаемой микробной контаминацией. А большие значения ?_lim, наоборот, лучше применять при анализе образцов с малой ожидаемой микробной контаминацией.

импедансный биотестирование микроорганизм хлоргексидин

Описание методики и результатов импедансного биотестирования антибактериальных свойств исследуемых препаратов

На рис. 6 показаны результаты практического применения предлагаемой методики регистрации микробиологических кривых роста к анализу угнетающего действия на E.coli (при необходимости осуществления анализа спектра действия тестируемого препарата - вместо E. coli образцы могут засеваться также другими различными видами тестовых микроорганизмов) антисептика хлоргексидин биглюконат (ХГ), способного оказывать как бактериостатическое, так и бактерицидное действие в отношении многих как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий.

Рис. 6. Результаты исследования антисептической активности ХГ с помощью микробиологического кондуктометрического анализатора «Rabit»: «стерильный» ГРМ-бульон («фоновый контроль») (1);

E. coli (с уровнем начальной обсемененности 10⁵ КОЕ/мл) в ГРМ-бульоне без ХГ (2); E. coli в ГРМ-бульоне с ХГ в концентрации 10-⁴% (по объему) (3); E. coli в ГРМ-бульоне с ХГ в концентрации 10-³% (по объему) (4). Одной цифрой обозначены кривые, соответствующие наибольшему и наименьшему значениям, полученным для указанного варианта, включающего 16 параллельных образцов (в случае вариантов 1 и 4 эти кривые совпадают)

При этом измерительные ячейки с питательной средой для тестовых микроорганизмов готовились к анализу так же, как и в предыдущем случае. Затем, в каждую из этих ячеек (кроме используемых для «фонового контроля») засевалось по 0,2 мл суспензии с 10⁵ КОЕ/мл E. coli. После этого все ячейки инкубировались при 37°С в течение 12 ч (чтобы начать анализ уже на стадии экспоненциального роста тестовых микроорганизмов - когда они наиболее чувствительны к внешним воздействиям).

Далее в каждую из ячеек добавлялось по 0,2 мл стерильного водного раствора с разными концентрациями ХГ. После чего все ячейки помещались в измерительный модуль анализатора «Rabit» и инкубировались там при 37°С в течение 2,5 сут - с автоматической регистрацией через каждые 6 мин величины импедансной электропроводности среды отдельно в каждой из ячеек.

Всего было проведено три последовательные серии таких измерений, в каждой из которых анализировалось по 16 образцов (4 варианта по 4 параллельных образца в каждом). Результаты этого приведены на рис. 6. Причем, для большей наглядности, был выбран такой режим построения графиков, при котором из значений импедансной электропроводности, регистрируемых для каждой ячейки, вычиталась величина ₀ - регистрировавшаяся для каждого из образцов в момент начала измерений и составлявшая, в данном случае, ₀ = (8,7-9,3)·10-³ См/мл для «стерильного» ГРМ-бульона и ₀ = (1,08-1,11)·10-² См/мл для остальных образцов.

Из представленного видно, что ХГ в концентрации 10-³ об.% оказывал бактерицидное, а в концентрации 10-⁴ об.% - бактериостатическое действие на обрабатываемые им образцы, содержащие жидкую питательную среду, обсемененную E. coli.

Для того чтобы получить более строгие количественные характеристики бактериостатического действия ХГ на E. coli - при наличии положительного (E. coli в ГРМ-бульоне без ХГ) и отрицательного («стерильный» ГРМ-бульон) контролей с заранее известными в них концентрациями микроорганизмов (10⁵ и 10⁰ КОЕ/мл, соответственно), можно обойтись даже без калибровки (которую, в противном случае, пришлось бы предварительно строить, как описано в предыдущем разделе, для каждого отдельного вида или штамма микроорганизмов, используемых в качестве тестовых).

Решая систему из 2-х уравнений вида:

lg(n₁) = a•ф₁ + b и lg(n₂) = a•ф₂ + b ,

получаем:

a = [lg(n₂) - lg(n₁)] / [ф₂•(1- ф₁/ф₂)] и b = lg(n₁) - a•ф₁ .

В нашем случае lg(n₁) = 5 и lg(n₂) = 0. А также для порогового значения Дч_lim = 100 мкСм/мл - ф₁ = 6 ч, ф₂ = 50 ч, ф_ХГ = 22±1 ч (для образцов с E.coli в ГРМ-бульоне с ХГ в концентрации 10-⁴ об.%).

Отсюда получаем уравнение

lg(n_ХГ) = 5,86 - 0,15 ф_ХГ

откуда n_ХГ = 73 Ч10² КОЕ/мл.

Подтверждают приведенные выше расчеты и данные, полученные стандартным культуральным методом, реализуемым в соответствии с ГОСТ 18963-73, ГОСТ 26670-91 и ГОСТ 10444.15-94. В этом случае из исходной суспензии, содержащей ГРМ-бульон, обсемененный E. coli, делали несколько последовательных разведений. Затем в каждое разведение добавляли стерильный водный раствор с требуемой концентрацией ХГ. Перемешивали. И далее анализировали, как описано выше. В результате была получена концентрация E. coli в исходной суспензии:

- без ХГ - (1,00,3)·10⁵ КОЕ/мл;

- с ХГ в концентрации 10-⁴ об.% - (8,02,5)·10² КОЕ/мл;

- в то время как с ХГ в концентрации 10-³ об.% ни одной четко различимой колонии E.coli на чашках за время анализа не выросло.

Описание методики и результатов импедансного биотестирования других свойств исследуемых препаратов

На рис. 7 показаны результаты практического применения предлагаемой методики импедансного биотестирования к анализу процессов сквашивания молока в присутствии Streptococcus thermophilus (St) и Lactobacillus helveticus (Lh), а также и ферментного препарата трансглутаминаза (ТГ), примененного здесь с целью модификации структуры кисломолочного продукта для улучшения его потребительских свойств [20].

Рис. 7. Результаты исследования процессов сквашивания молока различными видами микроорганизмов в присутствии препарата ТГ с помощью микробиологического кондуктометрического анализатора «Rabit». Кривыми показаны данные, полученные для: «стерильного» молока («фоновый контроль») (1); 5 мл молока + 0,25 мл Lh (2); 5 мл молока + 0,25 мл Lh + 0,125 г ТГ (3); 5 мл молока + 0,25 мл St (4); 5 мл молока + 0,25 мл St + 0,125 г ТГ (5)

В этом случае перед началом анализа измерительные ячейки и молоко стерилизуют раздельно. При этом молоко желательно стерилизовать методами фильтрации или пастеризации (чтобы предотвратить ухудшение его потребительских свойств вследствие высокотемпературной денатурации белков, витаминов и т.д.).

Затем по 5 мл молока наливали в каждую из измерительных ячеек. После этого добавляли туда суспензии, содержащие жизнеспособные S. thermophilus или L. helveticus и препарат ТГ. После чего ячейки помещали в измерительный модуль анализатора «Rabit» и инкубировали при 33°С в течение трех суток - с автоматической регистрацией через каждые 6 мин величины импедансной электропроводности среды отдельно в каждой из ячеек.

В этих условиях, как видно из рис. 7, S. thermophilus в период своей экспоненциальной фазы роста (начинавшейся с 6 ч и заканчивавшейся после 36 ч инкубации) проявлял более высокую активность, чем L. helveticus. При этом экспоненциальная фаза роста L. helveticus протекала менее интенсивно и более растянуто по времени (не заканчиваясь даже после 72 ч инкубации). В присутствии ТГ процессы сквашивания молока протекали более интенсивно, чем без ТГ. При сквашивании под действием L. helveticus эффект ТГ был более выраженным, чем при участии S. thermophilus.

Получить такой объем информации, имея в своем арсенале только стандартный культуральный метод определения количества микроорганизмов в пробах, было бы весьма затруднительно. Однако в случае, например, совместного сквашивания молока культурами S. thermophilus и L. helveticus - без дополнительных биохимических и микроскопических методов идентификации микроорганизмов исследователю также трудно было бы обойтись.

Заключение

Таким образом, очевидно, что предлагаемый в настоящей работе метод импедансного биотестирования, обеспечивая достаточно высокий уровень сходимости своих данных с данными, получаемыми в результате применения стандартных культуральных методик биотестирования, имеет по сравнению с последними также целый ряд преимуществ, включающий, в частности:

1. возможность получения подробной информации о динамике изменения численности популяции и интенсивности метаболизма тестовых микроорганизмов (что особенно пригодилось нам в последнем случае - когда мы исследовали процессы сквашивания молока);

2. значительное уменьшение расхода питательных сред, а также временных и трудозатрат исследователя при проведении анализов (поскольку отпадает необходимость в приготовлении большого числа последовательных разведений исходной пробы, как это предусматривает стандартный культуральный метод определения количества микроорганизмов; плюс, при микробиологическом анализе даже одного разведения, в случае оценки антисептических свойств хлоргексидина тратилось 4Ч2 = 8 мл питательного бульона, вместо 4Ч15 = 60 мг плотной агаризованной питательной среды);

3. повышение объективности оценки результатов анализа (в том числе из-за уменьшения ошибки, возникающей вследствие неравномерного распределения пробы по дну чашки Петри, которое может привести к слиянию колоний).

Литература

1. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина, 1972. 480 с.

2. Коротяев А.И., Бабичев А.С. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. СПб: Спецлитература, 1998. 592 с.

3. Gulya A.P., Prisakar V.I., Tsapkov V.I., Buracheva S.A., Spynu S.N., Bezhenar N.P. Synthesis and antimicrobial activity of sulfanilamide-containing copper (II) naphthalidenethiosemicarbazidates // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2008. V. 42. N 6. P. 326-328.

4. Velikorodov A.V., Ionova V.A., Degtyarev O.V., Suxenko L.T. Synthesis and antimicrobial and antifungal activity of carbamate-functionized spiro compounds // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2013. V. 46. N 12. P. 715-719.

5. Yunnikova L.P., Akent'eva T.A., Aleksandrova G.A. Synthesis and antimicrobial activity of amines and imines with a cycloheptatriene fragment // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2013. V. 46. N 12. P. 723-725.

6. Vorob'eva A.I., Sultanova G.R., Bulgakov A.K., Zajnchkovskij V.I., Kolesov S.V. Synthesis and biological properties of copolymers based on N,N-diallyl-N,N-dimethylammonium chloride // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2013. V. 46. N 11. P. 653-655.

7. Belakhov V.V., Shenin Yu.D. Synthesis and antifungal activity of N-trialkylsilyl derivatives of nystatin // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2008. V. 42. N 6. P. 322-325.

8. Anikina L.V., Vikharev Yu.B., Rozhkova Yu.S., Schkljaev Yu.V. Synthesis and biological activity of 3-spiro[adamantane-2,3?-isoquinolines] // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2013. V. 46. N 12. P. 707-710.

9. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л.: Медгиз, 1963. 146 с.

10. Raevsky O.A., Razdolskii A.N., Liplavskii Ya.V., Raevskaya O.E., Yarkov A.V. Acute toxicity evaluation upon intravenous injection into mice: interspecies correlations, lipophilicity parameters, and physicochemical descriptors // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2012. V. 46. N 2. P. 69-74.

11. Raevskii O.A., Razdol'skii A.N., Tonkopii V.D., Iofina I.V., Zagrebin A.O. Classificatory and quantitative models of the relationship between the structures of chemical compounds and their toxicity for Daphnia magna // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2008. V. 42. N 6. P. 329-334.

12. Markosyan A.I., Akalyan Kh.S., Arsenyan F.G., Sukasyan R.S., Garibdzhanyan B.T. Synthesis and biological properties of 3-phenyl- and 3-phenethyl-5-methyl-5-ethyl-4-oxo-3,4,5,6-tetrahydrobenzo[h]quinazolines // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2008. V. 42. N 6. P. 313-318.

13. Shakurova Й.R., Parfenova T.I., Sufiyarova R.Sh., Khalilova A.Z., Akhmetova V.R., Bashkatov S.A. Synthesis and anti-inflammatory activity of acyl derivatives of taraxasterol // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2008. V. 42. N 6. P. 319-321.

14. Kedik S.A., Sakaeva I.V., Kochkina Yu.V., Eremin D.V., Panov A.V., Suslov V.V. Synthesis and radioprotector activity of N-vinylpyrrolidone and 2-methyl-5-vinyltetrazole copolymers // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2013. V. 46. N 12. P. 726-729.

15. Sibirtsev V.S. Study of applicability of the bifunctional system «Ethidium bromide + Hoechst-33258» for DNA analysis // Biochemistry (Moscow). 2005. V. 70. N 4. P. 449-457.

16. Sibirtsev V.S. Fluorescent DNA probes: study of mechanisms of changes in spectral properties and features of practical application // Biochemistry (Moscow). 2007. V. 72. N 8. P. 887-900.

17. Сибирцев В.С., Гарабаджиу А.В. Флуоресцентные ДНК-зонды: введение в теорию и практику использования. СПб: НОУ «Экспресс», 2006. 188 с.

18. Сибирцев В.С., Гарабаджиу А.В. Новые методы биотестирования и анализа ДНК с помощью флуорофоров // Биотехносфера. 2011. Т. 13. № 3. С. 9-14.

19. Бессонов Л.А. Теоретические основы электротехники. М.: Высшая школа, 1996. 492 c.

Размещено на Allbest.ru