Получение биомассы каротинсинтезирующих дрожжей рода Rhodotorula при культивировании на сельскохозяйственных отходах

Полная исследовательская публикация __ Червякова О.П., Суясов Н.А., Фомичева А.М., Шакир И.В.

и Панфилов В.И.

Размещено на http://www.allbest.ru/

96 ______________ http://butlerov.com/ _______________ ©--Butlerov Communications. 2017. Vol.50. No.5. P.95-99.

Тематический раздел: Биохимические исследования. Полная исследовательская публикация

Подраздел: Биотехнология. Идентификатор ссылки на объект - ROI: jbc-01/17-50-5-95

г. Казань. Республика Татарстан. Россия. __________ ©--Бутлеровские сообщения. 2017. Т.50. №5. _________ 95

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева

Получение биомассы каротинсинтезирующих дрожжей рода Rhodotorula при культивировании на сельскохозяйственных отходах

Червякова Ольга Петровна, Поддерживающий переписку, Суясов Николай Александрович, Ведущий направление; Фомичева Александра Михайловна, Шакир Ирина Васильевна, Панфилов Виктор Иванович, Кафедра биотехнологии

Тел.: (965) 362-99-17. E-mail: chervyakova85@mail.ru

Миусская пл, 9. г. Москва, 125047. Россия

Аннотация

Каротиноиды - это биологически активные вещества, которые играют важную роль в протекании физиологических процессов у человека и животных. Многие микроорганизмы способны синтезировать каротиноидные пигменты, поэтому их используют в качестве продуцентов в промышленном производстве каротиноидов. К таким микроорганизмам относятся дрожжи рода Rhodotorula, культивирование которых можно осуществлять с использованием различных источников углерода, в том числе и компонентов растительного сырья. Возможность использования вторичного растительного сырья (побочных продуктов сельскохозяйственной и пищевой промышленности, некондиционное сырье) позволяет решить проблемы их переработки, что является актуальным в настоящее время.

В данной работе проведена оценка биопотенциала различных видов растительного сырья для культивирования каротинсинтезирующих дрожжей Rhodotorula rubra.

Установлено, что предварительная обработка растительного сырья позволяет повысить доступность питательных компонентов, при этом содержание общих углеводов в гидролизатах достигает 30.0-40.0 г/л. Степень потребления углеводов дрожжами Rhodotorula rubra составляет 60.0-80.0%, накопление биомассы варьируется в диапазоне от 8.0 до 10.5 г/л.

Анализ каротиноидного состава биомассы показал, что количество пигментов и их соотношение зависит от вида субстрата и способа его обработки и изменяется от 50.0 до 550.0 мкг/л. Наибольшим потенциалом для микробного синтеза каротиноидов дрожжами Rhodotorula rubra обладают свекловичная меласса и кислотные гидролизаты шрота подсолнечника и клубней топинамбура, при этом максимальный выход пигментов с 1 л культуральной жидкости составляет 507.0, 545.0 и 180.3 мкг, соответственно.

Ключевые слова: каротиноиды, Rhodotorula, сельскохозяйственные отходы, растительное сырье, кормовая добавка.

Abstract

In the English version of this article, the Reference Object Identifier - ROI: jbc-02/17-50-5-95

Biomass production of carotenoid synthesizing yeasts of genus Rhodotorula at cultivation on agricultural wastes

Olga P. Chervyakova⁺, Nikolay A. Suyasov*, Alexandra M. Fomicheva, Irina V. Shakir, and Viktor I. Panfilov

Department of Biotechnology. D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia.

Miusskaya sq. 9. Moscow, 125047, Russia. Phone: +7 (965) 362-99-17. E-mail: chervyakova85@mail.ru

*Supervising author; ⁺Corresponding author

Carotenoids are biologically active substances that play an important role in the course of physiological processes in humans and animals. Besides to plants, many microorganisms are able to synthesize carotenoid pigments, therefore they are used as producers in the industrial production of carotenoids. The yeasts of genus Rhodotorula can synthesize carotenoids, the cultivation of which can be carried out using various sources of carbon, including components of plant raw materials. The possibility of using secondary plant raw materials (by-products of the agricultural and food industry, substandard raw materials) allows solving the problems of their processing, that is actual at the present time.

This research work is devoted to evaluating the bio-potential of various types of plant raw materials for the cultivation of carotinoid synthesizing yeasts Rhodotorula rubra.

It is found that pretreatment of plant raw materials, as well acid hydrolysis as enzymatic, allows increasing the availability of nutrient components, while the content of total carbohydrates in hydrolysates reaches 30.0-40.0 g/L. The degree of assimilation of carbohydrates by yeast Rhodotorula rubra is 60.0-80.0%, the accumulation of biomass varies in the range from 8.0 to 10.5 g/L.

Analysis of the carotenoid composition of the biomass showed that the amount of pigments and their ratio varies depending on the type of substrate, on the method of its processing, and ranges from 50.0 to 550.0 мg/L. The greatest potential for microbial synthesis of carotenoids by yeast Rhodotorula rubra is beet molasses and acid hydrolysates of deproteinised sunflower meal and of Jerusalem artichoke tuber, the maximum yield of pigments from a liter of culture fluid being 507.0, 545.0 and 180.3 мg, respectively.

Keywords: carotenoids, Rhodotorula, agricultural wastes, plant raw materials, feed supplement.

Введение

Наиболее эффективный вариант повышения биологической ценности кормовых продуктов - обогащение их биологически активными добавками. В качестве такой добавки можно использовать биомассу каротинсинтезирующих микроорганизмов. Учитывая значимую роль каротиноидов для протекания физиологических процессов, создание новых форм каротиноидных препаратов и их применение в качестве биологически активных добавок является актуальной задачей. По мимо этого, синтез таких природных коммерчески значимых каротиноидов, как в-каротин, толулин и торулародин некоторыми видами дрожжей рода Rhodotorula, привел к рассмотрению этих микроорганизмов в качестве потенциальных источников пигмента [1].

С целью повышения рентабельности производства и сопутствующего решения проблемы переработки некондиционного растительного сырья для культивирования микроорганизмов в качестве субстрата могут быть использованы углеводсодержащие отходы переработки пищевых производств и побочных продуктов сельского хозяйства [2-5].

Таким образом, современные потребности народного хозяйства включают необходимость производства белковых кормовых добавок, решение экологических вопросов при переработке отходов. Это позволяет рассматривать исследования, направленные на решение обозначенных проблем, как имеющие большое практическое и социальное значение.

1. Экспериментальная часть

Основным объектом исследования являлись дрожжи Rhodotorula rubra из коллекции кафедры биотехнологии РХТУ имени Д. И. Менделеева. Данный вид микроорганизмов является продуцентом таких каротиноидных пигментов, как в-каротин, торулин, торулародин.

Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл (объем питательной среды 50 мл), при температуре 28-30 ^оС, при постоянном встряхивании с интенсивностью 150-200 об/мин, в течение 4 суток. Для культивирования использовали питательную среду следующего минерального состава (г/л): K₂HPO₄ - 1.0; KH₂PO₄ - 0.12; (NH₄)₂SO₄ - 1.30; MgSO₄•7H₂O - 0.60; NaCl - 0.40; MnSO₄•4H₂O - 0.08; CaCl₂ - 0.40; дрожжевой экстракт - 4.0; рН (5.50 ± 0.20) ед. [6].

В качестве источника углерода использовали несколько видов растительного сырья и отходов его переработки - измельченные клубни топинамбура, кофейный шлам, экструдированные пшеничные отруби, маслоэкстракционный шрот семян подсолнечника после выделения белковой фракции (ДПШ), шелуху подсолнечника и свекловичную мелассу. Для повышения биодоступности питательных компонентов сырье гидролизовали (условия подобраны ранее) [7-10]. Для ферментативного гидролиза использовали комплексные ферментные препараты Viscoferm и Cellic CTec (Novozym, Дания). Условия предварительной обработки растительного сырья представлены в табл. 1.

Табл. 1. Условия предварительной обработки растительного сырья

Для определения каротиноидного состава дрожжевые клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием в течение 15 мин. при 5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, оставшиеся капли удаляли с помощью фильтровальной бумаги. Навеску сырой биомассы растирали в фарфоровой ступке и экстрагировали ацетоном. Экстракт сливали в пробирку, а экстракцию проводили до полного обесцвечивания биомассы. Далее каротиноиды переводили в эфирную фракцию. Для получения разделения к смеси прибавляли дистиллированную воду. Эфирную фракцию собирали в сухую градуированную пробирку с притертой пробкой. В экстрактах определяли поглощение при длинах волн 450, 509 и 537 нм на спектрофотометре СФ-2000 [11].

2. Результаты и их обсуждение

Для оценки потенциала выбранного растительного сырья в полученных гидролизатах определяли содержание редуцирующих веществ (РВ) и общих углеводов (ОУ) (табл. 2).

Особенностью клубней топинамбура является большое количество легко извлекаемых при экстракции водой углеводов. Необходимо отметить, что концентрация общих углеводов в гидролизатах достаточно высокая и в среднем составляет 30.0-40.0 г/л, поэтому их целесообразно использовать для культивирования микроорганизмов.

Также для оценки биопотенциала исследуемого растительного сырья при культивировании дрожжей Rhodotorula rubra определяли способность культуры накапливать биомассу и каротиноиды (табл. 3). Для этого полученные гидролизаты использовали для культивирования дрожжей. Содержание мелассы в питательной среде соответствовало концентрации редуцирующих веществ 30.0 г/л.

Табл. 2. Содержание редуцирующих веществ и общих углеводов в гидролизатах

Табл. 3. Накопление биомассы и каротиноидных пигментов при культивировании дрожжей Rh. rubra на гидролизатах растительных отходов

* - не обнаружено (ниже чувствительности метода)

При культивировании дрожжей Rhodotorula rubra на различных углеводсодержащих средах накопление биомассы достигало 8.0-10.5 г/л. Наименьшее количество биомассы было получено при культивировании на ферментативном гидролизате ДПШ - 5.8 г/л. Такой незначительный рост культуры может быть связан с невысоким содержанием углеводов в среде.

Анализ каротиноидного состава биомассы показал, что накопление пигментов и их соотношение варьируется от 50.0 до 550.0 мкг/л культуральной жидкости в зависимости от вида растительного сырья, способа его обработки. Наибольший выход каротиноидов был получен при использовании в качестве субстрата кислотного гидролизата клубней топинамбура и свекловичной мелассы и составил 545.0 и 507.0 мкг/л, соответственно. биопотенциал каротинсинтезирующий дрожжи

Заключение

В результате проведенных исследований установлено, что предварительная обработка различного рода растительных отходов позволяет использовать их в качестве углеводных субстратов при культивировании микроорганизмов. На примере культуры дрожжей Rhodotorula rubra показано, что для микробиологического синтеза каротиноидов наибольший интерес могут представлять свекловичная меласса и кислотные гидролизаты клубней топинамбура.

При сопоставлении литературных и экспериментальных данных отмечено, что применение каких-либо видов углеводсодержащих отходов взамен индивидуальных углеводов приводит к снижению каротиноидов в биомассе каротин синтезирующих дрожжей. Эта проблема может быть решена путем оптимизации ферментационного процесса или способа подготовки субстрата, что является основой для дальнейших исследований.

1. Предварительная обработка растительных отходов комплексными ферментными препаратами (Viscoferm и Cellic CTec) и кислотным гидролизом позволяет использовать их качестве углеводных субстратов при культивировании дрожжей Rhodotorula rubra. При обработке клубней топинамбура, кофейного шлама, экструдированных пшеничных отрубей, масло-экстракционного шрота семян подсолнечника после выделения белковой фракции и шелухи подсолнечника были получены водные экстракты и гидролизаты с содержанием общих углеводов 30.0-40.0 г/л.

2. При культивировании дрожжей Rhodotorula rubra на кислотном гидролизате клубней топинамбура накопление биомассы составляет 10.5 г/л, а выход каротиноидных пигментов - 545.0 мкг/л.

3. При культивировании дрожжей Rhodotorula rubra на свекловичной мелассе накопление биомассы составляет 10.0 г/л, а выход каротиноидных пигментов - 507.0 мкг/л.

Литература

1. G.I. Frengova, D.M. Beshkova. Carotenoids from Rhodotorula and Phaffia: yeasts of biotechnological importance. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 2009. Vol.36. No.2. Р.163.

2. E. Valduga, A. Valйrio, H. Treichel, M. Di Luccio, A. Furigo Jъnior. Study of the bioproduction of carotenoids by Sporidiobolus salmonicolor (CBS 2636) using pretreated agroindustrial substrates. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 2008. Vol.83. No.9. Р.1267-1274.

3. M.M.K. Bagy, M.H. Abd-Alla, N.A. Nafady, F.M. Morsy, G.A.E. Mahmoud. Bioconversion of plant wastes to в-carotene by Rhodotorula glutinis KU550702. European Journal of Biological Research. 2016. Vol.6. No.4. Р.226-241.

4. S. Petrik, S. Obruиa, P. Beneљovб, & I. Mбrovб. Bioconversion of spent coffee grounds into carotenoids and other valuable metabolites by selected red yeast strains. Biochemical Engineering Journal. 2014. Vol.90. Р.307-315.

5. T. Schneider, S. Graeff-Hцnninger, W.T. French, R. Hernandez, N. Merkt, W. Claupein. Lipid and carotenoid production by oleaginous red yeast Rhodotorula glutinis cultivated on brewery effluents. Energy. 2013. Vol.61. Р.34-43.

6. Червякова О.П., Шакир И.В., Суясов Н.А., Панфилов В.И. Факторы, влияющие на биосинтез каротиноидов дрожжами Rhodotorula rubra. Химическая промышленность сегодня. 2015. №5. С.45-50.

7. Башашкина Е.В., Шакир И.В., Суясов Н.А., Панфилов В.И. Использование кофейного шлама в качестве сырья для получения белковой кормовой добавки. Химическая промышленность сегодня. 2010. №6. С.28-33.

8. Башашкина Е.В., Суясов Н.А., Шакир И.В., Панфилов В.И. Биоконверсия отходов производства растворимого кофе в продукты кормового назначения. Экология и промышленность России. 2011. №1. С.18-19.

9. Кареткин Б.А., Катаева Т.С., Баурин Д.В., Грошева В.Д., Шакир И.В., Панфилов В.И. Факторный эксперимент для оптимизации условий предварительной обработки питательной среды. Фундаментальные исследования. 2014. №11-1. С.13-19.

10. B.A. Dr. Karetkin, O.P. Chervyakova, D.V. Dr. Baurin, Assoc. Prof. Dr. Shakir I.V., Prof. Dr. Panfilov V.I. Optimisacion of pretreatment condition of plant raw composed media for carotenoids biosynthesis by yeast Rhodotorula rubra. 16th International Multidisciplinary Scientific GeoConference, SGEM 2016. 2016. Р.301-309.

11. Вечер А.С., Куликова А.Н. Спектрофотометрическое определение содержания каротиноидов в биосинтезе микроорганизмов. Физиолого-биохимические исследования растений. Сб. научн. тр. Минск. 1967. С.46-54.

Размещено на Allbest.ru