Было установлено, что при глубинном культивировании штамма В. circulans Ск2ч в питательных средах, различающихся по составу азотсодержащих соединений, уровень накопления БПВ был различен. Так, из данных табл.1 видно, что если в качестве источника азота в составе среды использовались гидролизаты белков животного происхождения (казеин и рыбная мука), то БПВ не обнаруживалось, несмотря на весьма высокие показатели концентрации живых клеток (3-8 Ч 10⁸ КОЕ/мл) в КЖ.

Такая же картина наблюдалась и при культивировании в бульоне с цитратом аммония, но уже в присутствии щавелевокислого и хлористого аммония антимикробная активность становилась заметной. Лучшие результаты по активности супернатантов давали среды, содержащие тиомочевину, мочевину, глутамат нартия, тартрат и сульфат аммония. На клетках одновременно сорбировалось вещество с более значительным эффектом на грамположительные бактерии, и этому в большей мере способствовало культивирование штамма в присутствии мочевины и глутамата (табл.1). Дальнейшие исследования проводили в среде с тартратом, в присутствии которого результаты оказывались более стабильными. Простые моно - и дисахариды по способности влиять на синтез бактерицидного вещества были практически равнозначны (табл.2). Из числа спиртов глицерин превосходил 1-, 2-пропандиол и немного уступал сахаридам. Частично гидролизованный полисахарид декстрин по спектру и величине активности оказался лучше декстрана, крахмала, целлюлозы и ее производных. Несмотря на то что в присутствии салицина и пектина наблюдался хороший рост клеток, это не способствовало накоплению бактерицидного вещества. Напротив, альгинат, лигнин и поливинилпирролидон на фоне весьма умеренного роста культуры стимулировали синтез антимикробиента. Среды с фиколлом и хитозаном не дали положительных результатов.

При глубинном культивировании в среде с виннокислым аммонием и глюкозой первые признаки спорообразования c агрегацией клеток отмечаются после 48 ч роста, а к 72 ч уже видны зрелые споры в спорангиях и остатки клеток (рис.1). Достаточно сходная картина наблюдается и в опыте по культивированию штамма с другими вариантами питательных сред, которые содержали сульфат аммония и глутамат натрия. В этих условиях бактерицидное вещество на заметном уровне (100 АЕ/мл) появляется лишь после 18 ч роста, продолжая накапливаться в КЖ вплоть до 3 сут инкубации.

Таблица 1

Антимикробные активности бесклеточных ферментатов и образцов бактериоциноподобного вещества из супернатантов и поверхности клеток в зависимости от источника азота в среде роста В. circulans Ск2ч Listeria monocytogenes

Примечание. НО - активность не обнаруживается.

Таблица 2

Сравнение антимикробной активности супернатантов в зависимости от типа источника углерода в среде культивирования В. circulans Ск2ч

* Альгиновая кислота (Serva), нейтрализованная 10% -ным NaOH до значения рН 7,2; ** микрокристаллическая, фармакопейная; *** для тонкослойной хроматографии; **** поливинилпирролидон м. м.10 000 (Sigma); ***** в составе препарата "Полифепана" на основе лигнина - сорбента медицинского и ветеринарного назначения.

Рис.1. Микроскопическая картина проб КЖ в процессе глубинного культивирования В. circulans Ск2ч в среде на основе тартрата аммония и глюкозы. Мазки окрашены по Граму, просмотрены при увеличении Ч1250 в микроскопе модели Eclipse E200 ("Nikon", China) под иммерсией и оцифрованы с помощью приставки Mini See 1,0 ("Media Info V.0.7.36 Beta", CЄ

Результаты дальнейших исследований по выделению и количественной оценке бактерицидного вещества в некоторых вариантах питательных сред приведены в табл.3. Как следует из представленных данных, все использованные нами полисахариды, кроме лигнина, способствовали продукции БПВ и даже, на первый взгляд, в большей степени, чем в контрольной среде с глюкозой. Анализ результатов этих опытов наводит на мысль о возможной солюбилизирующей роли целлюлоз и альгината, так как их использование приводило к более высокому выходу бактерицидного вещества из супернатанта по сравнению с контролем. Об этом свидетельствует и характер распределения активности БПВ между клеточной массой КЖ и интерфазной пленкой, получаемой из бесклеточного супернатанта (табл.4). Так, если в среде с глюкозой доля сорбированного на клетках бактерицидного вещества составляла 29%, то в средах с добавлением целлюлоз и альгиновой кислоты - от 1,5 до 13,5%. Полученные данные интересны тем, что демонстрируют пути увеличения выхода целевого продукта в жидкую фазу с использованием доступных материалов.

Как показали результаты электрофореза (рис.2) и тонкослойной хроматографии образцов, расположение полос пептидов с активностью против тестштамма E. coli в контроле (рост на глюкозе) и в опыте при выращивании на различных типах целлюлозы практически одинаковое, что свидетельствует об их молекулярной идентичности. По данным биотестирования в опытах по ТСХ показатель Rf для всех образцов супернатанта был равен 0,7. Пептидные полосы БПВ из образцов супернатантов соответствовали молекулярной массе около 5,0-5,7 кДа (рис.2). В то же время у контрольного образца, выделенного из клеточной поверхности продуцента, молекулярный вес активной фракции был несколько выше - около 6,0 кДа (образец 2, рис.2).

Таблица 3

Количественные показатели выхода бактериоциноподобного вещества B. circulans Ск2ч, выделенного методом двухфазного разделения после культивирования продуцента с полисахаридами

* Антимикробная активность.

Таблица 4

Распределение антимикробной активности бактериоциноподобного вещества B. circulans Ск2ч между жидкой фазой и клетками в зависимости от углеводного состава ферментата

Рис.2. Тестирование образцов бактерицидного вещества по данным ДСН-ПААГ электрофореза и определения величины молекулярного веса антимикробной фракции, действующего на штаммы E. coli: 1 - маркеры (5,7 и 14,5 кДа); 2 - контрольный образец (среда с глюкозой), выделенный из клеточной массы; 3 - то же из супернатанта; 4 - опытный образец из супернатанта, полученный при культивировании в присутствии метилцеллюлозы, 5 - то же с микрокристаллической целлюлозой

Сопоставление результатов ТСХ бактерицидных веществ, полученных из клеточной массы и супернатанта, также указывает на их отличие. На полосках силикагеля после окраски нингидрином выявлялись пятна с Rf 0,5 для образца из клеточной массы и Rf 0,7 - из супернатанта. В результате биотестирования разрезанных полосок силикагеля (фрагменты по 0,5 см) после ТСХ было установлено, что образцы из клеточной массы оказывались активными против L. monocytogenes, а образцы из супернатанта - преимущественно против Е. сoli. Эти данные дают основание предполагать о синтезе B. circulans Ск2ч двух пептидных компонентов с несколько различной антимикробной активностью.

В результате сравнительных испытаний по выбору способа выделения бактерициноподобного вещества из бесклеточных супернатантов B. circulans установлено, что более предпочтительным оказался метод преципитации целевой фракции с помощью неполярных растворителей (табл.5). Теоретической предпосылкой целесообразности выбора указанного способа явилось то, что бактериоцины по своей природе имеют аффинность к гидрофобным растворителям, что предполагает возможность их сбора на границе раздела фаз (вода/растворитель). Дихлорметан обладает низкой температурой кипения (40єС), меньшим уровнем токсичности по сравнению с хлороформом, толуолом, легко удаляется из растворов и, благодаря этому, имеется возможность для многократного его использования. Кроме того, обработка супернатанта ДХМ позволяет выделить до 94,6% целевой субстанции с одновременным снижением в ней (на 86% по массе) количества балластных веществ (табл.6).

Таблица 5

Выходы образцов бактериоциноподобного вещества в зависимости от способа обработки супернатанта

* АЕ - арбитражная единица активности в отношении Е. сoli.

Таблица 6

Количественные показатели фракционирования супернатанта B. circulans Ск2ч с использованием дихлорметана

Таким образом, способность штамма B. circulans Ск2ч производить бактерицидное вещество на простых по составу средах при обычных условиях аэробного роста с возможностью его извлечения малозатратными методами делает этот штамм технологически перспективным в качестве продуцента нового антибактериального средства. В результате выполненных исследований были определены условия для получения и более глубокого изучения его свойств и химической структуры.

Полученные нами данные о влиянии некоторых полисахаридов (декстрин, крахмал) на выход бактерицидного вещества согласуются с первыми работами, проводимыми с бактериями B. circulans [20]. Сведений об эффективности целлюлоз в отношении синтеза антимикробных пептидов в доступной литературе не обнаружено. Имеются публикации о способности бацилл этой группы вырабатывать ферменты, расщепляющие сложные полисахариды [21] и даже гербициды [22] вне связи с продукцией антимикробных веществ. В целом же вопрос о питательных потребностях штаммов-продуцентов для микробного синтеза бактериоцинов / бактериоциноподобных веществ, остается по-прежнему неясным. По мнению некоторых исследователей [1, 9, 10], для активной продукции этих веществ есть смысл использовать бедные по азоту среды, так как в этом случае создаются лучшие условия для их наработки, что дает возможность бактериям конкурировать с другими в общей экологической нише. Эта точку зрения подтверждают и наши данные (табл.1). По всей видимости, такая закономерность может касаться и других веществ подобного рода [23].

Известна связь биосинтеза пептидных антибиотиков типа полимиксина и бутирозина со спорообразованием продуцентов [24]. По этой причине продуценты этих антибиотиков обычно культивируют в течение 3-5 сут. По нашим данным, бактерицидное вещество штамма B. circulans Ск2ч накапливается в КЖ еще до появления спор. Результаты белкового электрофореза свидетельствуют о том, что величина молекулярной массы антимикробной субстанции Ск2ч составляет 5-6 кДа (рис.2), тогда как у антибиотиков из группы полимиксинов - около 1 кДа [8, 9, 25, 26]. В то же время полученное бактерицидное вещество по величине молекулярной массы более соответствует бактериоцинам класса II лактобактерий [27, 28], но отличается от них более широким спектром антимикробного действия.

Выбранный нами способ извлечения бактериоцидного вещества из супернатанта при помощи неполярного растворителя дихлорметана отличается простотой и эффективностью. Интерфазная пленка, собираемая на границе раздела фаз, содержит более 90% целевого продукта (см. табл.5,6). Ранее описанный способ выделения бактериоцинов был основан на использовании хлороформа [29], который обладает сильным наркотическим действием.

Заключение