E-mail: golovatskaya@mail.tomsknet.ru

Key words: Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.; photomorphogenesis; green light; brassinolide; IAA; zeatin; zeatin riboside; ABA.

В связи с прикрепленным образом жизни растения вынуждены быть особенно пластичными в ответах на воздействия окружающей среды. Свет, как наиболее важный внешний фактор, является не только источником энергии для фотосинтеза, но и сигналом, изменяющим программу развития растения. Особый интерес представляет роль зеленого света (ЗС) в жизнедеятельности растений [1]. Его регулирующее действие на растения осуществляется через ряд фоторецепторов [2-4] с участием системы вторичных мессенджеров. Согласно мнению ряда исследователей, в эту систему регуляции вовлечены гормоны. Показано, что гормональный статус растений меняется в зависимости от селективного света [5-7]. Известно, что цитокинины (ЦК) участвуют в регуляции ското- и фотоморфогенеза, но в отношении участия брассиностероидов (БР) в светорегуляции морфогенеза данных недостаточно [7, 8]. В настоящее время показано, что наиболее активный представитель брассиностероидов - брассинолид - регулирует многие процессы в растении от активности протонного насоса, роста клетки, стебля, дифференциации ксилемы, положения листьев, биосинтеза этилена и пигментов, мужской плодовитости и до регуляции фотосинтеза, реакций стресса и фотоморфогенеза [9- 12]. В связи с этим целью работы являлось изучение роли брассинолида в регуляции уровня фитогормонов (ауксинов, цитокининов и абсцизинов) в процессе роста растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. на ранних этапах онтогенеза на зеленом свету.

Объект и методики исследования

Объектами исследования служили растения двух линий Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. экотипа Columbia (Col) и его мутантная форма det2 с нарушенным биосинтезом брассиностероидов [13].

Стерильные семена Arabidopsis высевали в чашки Петри на жидкую питательную среду Ѕ МС [14] с добавлением 10-7 М брассинолида (БЛ). Брассиностероиды любезно предоставлены профессором В.А. Хрипачом (Институт биоорганической химии НАН Беларуси, г. Минск). В контроле использовали среду без добавления гормона. Для синхронизации прорастания семена выдерживали в течение 3 сут в темноте при +6°С, затем 3 ч освещали с помощью люминесцентных ламп ЛД-40 (33 Вт/м2) и помещали в темноту, где экспонировали 7 сут в условиях полной темноты или ежедневного кратковременного (60 мин) освещения ЗС (л = 543 нм, плотность потока квантов 3,0 мкмоль/(м2·с)). Длину гипокотилей и площадь семядолей измеряли у ста проростков каждого варианта.

Количественное определение ИУК, АБК и цитокининов (зеатина и рибозида зеатина - РЗ) проводили с помощью твердофазного иммуноферментного метода [15], используя моноклональные антитела к свободным формам ИУК, АБК и зеатину и антивидовые антитела, меченные пероксидазой («Фармхиминвест», Россия). Измерение плотности растворов определяли на микрофотометре «Specord M-40» при длине волны 492 нм.

Далее на рис. 1, 2 приведены данные в виде средних арифметических со стандартными ошибками.

Результаты и обсуждение

Моделью для изучения фотоморфогенеза были выбраны растения арабидопсис мутантной формы, имеющие многие характеристики светового фенотипа при выращивании в темноте [16]. Световой фенотип растущих в темноте мутантных форм det2 проявлялся в коротких и утолщенных гипокотилях, открытых и расширенных семядолях, раскрытых первичных зародышевых листьях. Гипокотиль у таких проростков был короче и толще дикого типа, а семядоли - крупнее, чем Col (рис. 1).

Преждевременное прекращение роста осевого органа и развитие семядолей в темноте показывают, что в растениях без видимой необходимости происходит экспрессия генов, обычно регулируемых светом. Кроме того, нарушается метаболизм БР, т.к. нарушены реакции преобразования 2Н-кампестерола в Н-кампестанол. Растения формы det2 накапливают только 8-15% уровня кампестанола и меньше 10% других брассиностероидов по сравнению с растениями дикого типа. Такие фенотипические и метаболические различия между мутантным det2 и диким типами арабидопсис позволяют предполагать важную роль DET2 в развитии этих растений.

Данные, представленные на рис. 1, показывают участие БЛ в регуляции морфогенеза линий Col и det2, различающихся по содержанию эндогенных БР, в темноте и на ЗС. Действие 10-7 М БЛ в темноте было малоэффективно в отношении растяжения семядолей обеих линий. Тогда как растяжение гипокотилей проростков дефицитного по БР мутанта det2 увеличилось (на 27%), частично восстанавливая этиолированный фенотип гипокотилей исходной линии. Действие экзогенного БЛ на рост корня зависело от уровня эндогенных БР: при их недостатке (det2) растяжение увеличивалось, тогда как при норме (Col) - тормозилось. Аналогичная ростовая реакция растений дикого типа отмечена и другими авторами [17, 18].

Рис. 1. Влияние брассинолида (БЛ, 10-7 М) на морфогенез 7-дневных проростков арабидопсиса в темноте (Т) и при деэтиоляции на зеленом свету (ЗС, 543 нм, 3 мкМ·квант/(м2·с), 60 мин)

проросток брассинолид эндогенный фитогормон

Деэтиоляция на ЗС низкой интенсивности (543 нм, 3 мкМ·квант/(м2·с)) была малоэффективна в отношении ингибирования роста гипокотилей у обеих линий, но существенно увеличила размеры семядолей (на 17 и 25% соответственно у det2 и Col). Из полученных данных видно, что чувствительность ростовых реакций к ЗС у мутантного типа арабидопсис была меньше, чем у дикого типа. Возможно, недостаток БР, выступающих в качестве трансдукторов светового сигнала, снижал ответные реакции растений типа det2 на свет.

Обработка БЛ (10-7 М) повысила ростовой ответ семядолей на действие ЗС. При этом был отмечен аддитивный эффект совместного действия ЗС и экзогенного гормона на рост семядолей дикого типа и синергический эффект - на рост семядолей мутантного типа (см. рис. 1). Последняя ростовая реакция была аналогична реакции, отмеченной нами для линий экотипа Landsberg erecta (Ler) при совместном действии ЗС и другого брассиностероида 24-эпибрассинолида (ЭБЛ) [19]. Кроме того, экзогенный БЛ восстанавливал ростовую реакцию корня растений мутантного типа на ЗС до уровня дикого типа.

Различия в морфогенезе проростков Col и det2 были обусловлены изменениями их гормонального статуса (рис. 2). В темноте деэтиолированные проростки фенотипа det2 характеризовались повышенным уровнем ЦК (зеатина и РЗ) и связанной ИУК, пониженным уровнем свободной ИУК и обеих форм АБК по сравнению с этиолированными проростками фенотипа Col. Подобную динамику гормонов отмечали для выращенных на свету растений и другие авторы [7]. Результаты анализа гормонального баланса показали, что мутация гена DET2 сопряжена с 7-кратным снижением отношения ИУК свободная/зеатин и 2-кратным увеличением отношения свободных форм ИУК/АБК по сравнению с нормой.

Деэтиоляция на ЗС уменьшила содержание обеих форм ИУК в растениях мутантного фенотипа и только свободной формы гормона в проростках дикого типа. Светозависимое снижение активности ауксинов после облучения красным светом показано другими авторами [20, 21]. ЗС повысил уровень зеатина у дикого типа за счет высвобождения из связанных форм, а у мутантного типа снизил уровень обеих форм ЦК. В деэтиолированных проростках обеих линий уменьшилось содержание свободной и связанной АБК по сравнению с этиолированными проростками.

Обработка 10-7 М БЛ проростков мутантного фенотипа в темноте по уровню ИУК и ЦК частично напоминала их деэтиоляцию на ЗС. Оба фактора, гормон и свет, действующие по отдельности, устанавливали одинаковый уровень ингибитора роста АБК у обеих линий растений.

Совместное действие факторов (БЛ+ЗС) на проростки арабидопсиса снизило уровень РЗ у обеих линий и синергически увеличило уровень свободной АБК в проростках мутантного типа (рис. 2), что показано нами ранее для Ler при действии ЭБЛ на ЗС [19]. Регуляция БЛ гормонального баланса арабидопсиса, вероятно, зависела от светорегулируемого изменения уровня эндогенных гормонов, в том числе и БР [22, 23].

Таким образом, впервые показано, что брассинолид участвует в регуляции морфогенеза на начальных этапах онтогенеза A. thaliana в темноте и при деэтиоляции на зеленом свету. Брассинолид изменяет баланс эндогенных фитогормонов. Аддитивный или синергический характер совместного действия брассинолида и зеленого света с длиной волны 543 нм на рост семядолей разных линий арабидопсиса проявляется через изменение уровня эндогенных фитогормонов, в том числе и уровня АБК (det2).

Полученные данные позволяют предполагать участие брассиностероидов в трансдукции сигнала зеленого света при регуляции фотоморфогенеза растений арабидопсиса.

Авторы выражают благодарность М.В. Ефимовой за помощь в проведении ряда экспериментов.

Литература

1. Карначук Р.А. Регуляторное влияние зеленого света на рост и фотосинтез листьев // Физиология растений. 1987. Т. 34, вып. 4. С. 765-773.

2. Карначук Р.А., Постовалова В.М., Беленькая Е.В., Жуланова С.Г. Фитохромный контроль метаболизма 14С-углеводов в растениях // Физиология растений. 1978. Т. 25. С. 268-271.

3. Головацкая И.Ф. Роль криптохрома 1 и фитохромов в регуляции фотоморфогенетических реакций растений на зеленом свету // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 822- 829.

4. Головацкая И.Ф., Карначук Р.А., Ефимова М.В. и др. Роль криптохрома 1 и фитохромов А-Е в регуляции роста арабидопсиса на зеленом свету // Вестник Томского государственного университета. 2007. № 297. С. 184-187.

5. Карначук Р.А., Негрецкий В.А., Головацкая И.Ф. Гормональный баланс листа растений на свету разного спектрального состава // Физиология растений. 1990. Т. 37, вып. 3. С. 527-534.

6. Карначук Р.А., Головацкая И.Ф. Гормональный статус, рост и фотосинтез растений, выращенных на свету разного спектрального состава // Физиология растений. 1998. Т. 45, вып. 6. С. 925-934.

7. Chory J., Reinecke D., Sim S. et al. A role for cytokinins in de-etiolation in Arabidopsis: det mutants have an altered response to cytokinins // Plant Physiol. 1994. Vol. 104. P. 339-347.

8. Neff M., Nguyen S.M., Malancharuvil E.J. et al. BAS1: A gene regulating brassinosteroid levels and light responsiveness in Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 96. P. 15316-15323.

9. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. Минск: Наука и техника, 1993. 287 с.

10. Прусакова Л.Д., Чижова С.И. Роль брассиностероидов в росте, устойчивости и продуктивности растений // Агрохимия. 1996. № 11. С. 137-150.

11. Clоuse S.D., Sasse J.M. Brassinosteroids: Essential Regulators of Plant Growth and Development // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. Vol. 49. P. 427-451.

12. Головацкая И.Ф., Никонорова Н.М. Рост и продуктивность растений в зависимости от их чувствительности к свету и способа обработки брассинолидом // Агрохимия. 2008. № 1. С. 46-51.

13. Koorneef M., Rolff E., Spruit C.J.P. Genetic control of light-inhibited hypocotyl elongation in Arabidopsis thaliana L. Heynh // Z. Pflanzenphysiol. 1980. Vol. 100. P. 147-160.

14. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. P. 473-497.

15. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко Н.Н. и др. Иммуноферментная система для определения цитокининов // Физиология растений. 1990. Т. 37. С. 193-199.

16. Chory J., Peto C., Feinbaum R., Pratt L., Ausubel F. Arabidopsis thaliana mutant that develops as a light-grown plant in the absence of light // Cell. 1989. Vol. 58. P. 991-999.

17. Clouse S.D., Langford M., Hall A.F. et al. Physiological and molecular effects of brassinosteroids on Arabidopsis thaliana // Plant Growth Regul. 1993. Vol. 12. P. 61-66.

18. Schumacher K., Chory J. Brassinosteroid signal transduction: still casting the actors // Curr. Opin. Plant Biol. 2000. Vol. 3. P. 79-84.

19. Карначук Р.А., Головацкая И.Ф., Ефимова М.В., Хрипач В.А. Действие эпибрассинолида на морфогенез и соотношение гормонов у проростков Arabidopsis на зеленом свету // Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 591-595.

20. Briggs W.R. Red light, auxin relationships and the phototropic responses of corn and oat coleoptiles // Am. J. Bot. 1963. Vol. 50. P. 196-207.

21. Muir R.M., Zhu L. Effeet of light in the control or growth by auxin and its inhibitor(s) in the sunflower // Physiol. Plant. 1983. Vol. 57. P. 407-410.

22. Clouse S.D. Integration of light and brassinosteroid signals in etiolated seedling growth // Trends Plant Sci. 2001. Vol. 6. P. 443-445.

23. Li J., Nagpal P., Vitart V. et al. A Role for brassinosteroids in light-dependent development in Arabidopsis // Science. 1996. Vol. 272. P. 398-401.

Размещено на Allbest.ru