Морфофункциональные изменения органов иммунной системы крыс при длительном воздействии низких доз ДДТ

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Морфофункциональные изменения органов иммунной системы крыс при длительном воздействии низких доз ДДТ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Тимохина Екатерина

Москва - 2015

Работа выполнена в ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Яглова Наталья Валентиновна

Официальные оппоненты:

Профессор кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор Торбек Виктория Эдуардовна

Профессор кафедры морфологии и ветеринарии ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный университет - Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязевa, доктор биологических наук, профессор митоген тимоцит пестицид

Панов Валерий Петрович

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние десятилетия в мире отмечается рост заболеваемости, связанный с нарушениями функционирования иммунной системы. Многие исследователи из разных стран сходятся во мнении, что основной причиной повышения числа заболеваний можно по праву считать загрязнение окружающей среды, приводящее к срыву защитных функций и адаптационных резервов организма человека (Гичев Ю.П., 1995; Cooper G., et al., 2004; Karmaus W., et al., 2005; Udoji F., et al., 2010; Brauner E., et al., 2012). Одними из наиболее опасных веществ, поступающих в окружающую среду в результате деятельности человека, являются стойкие органические загрязнители (СОЗ) в силу их высокой токсичности, стабильности, способности к дальнему переносу и биоаккумуляции. Наиболее распространенным СОЗ, широко применявшимся в очень больших количествах в 50-70гг. (более 4,5 млн. тонн) в сельском, домашнем хозяйстве, на производстве и в воинских частях, считается пестицид 1,1,1-трихлор-2,2-бис(4-хлорфенил)этан (ДДТ). На сегодняшний день, во всем мире ежегодно используется 4000 - 5000 тонн ДДТ для борьбы с малярией и висцеральным лейшманиозом (Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, 2010). Благодаря высокой устойчивости к разложению фоновые дозы ДДТ регистрируются на всех материках и во всех океанах (Bachman M.J. et al., 2014; Bouwman H. et al., 2014; Velasco A. et al., 2014). Высокая растворимость в жирах и низкая растворимость в воде обусловливают накопление ДДТ в жировой ткани. Организмы более высоких трофических уровней имеют тенденцию к депонированию больших количеств ДДТ по сравнению с организмами низших уровней. В настоящее время на планете не существует организма, который не содержал бы в своих тканях ДДТ и его метаболитов.

По данным различных исследований, ДДТ и его метаболиты обладают канцерогенным действием (Tomatis L. et al., 1975; Jin X., et al., 2014), а также являются эндокринными дизрапторами, способными приводить к развитию эндокринных заболеваний, а также нарушать физиологическое течение беременности и приводить к преждевременным родам и выкидышам (Venners S.A. et al., 2005; Codru N. et al., 2007; Cox Sh. et al., 2007; Jones O.A. et al., 2008; Sadasivaiah Sh. et al., 2008; Turyk M., 2009). В токсичных и субтоксичных дозах ДДТ и его метаболиты оказывают иммуносупрессивное действие, подавляя гуморальный и клеточный ответ (Banerjee B.D. 1987; Tebourbi O., et al., 1998; Забродский П. Ф. 2007) и др.

Однако крайне мало работ, посвященных изучению влияния низких фоновых доз ДДТ, предусмотренных максимальными допустимыми уровнями (МДУ) содержания в пищевых продуктах, водопроводной воде и т.д. Данные о влиянии ДДТ на функционирование иммунной системы характеризуются фрагментарностью и противоречивостью. По данным Daniel V., et al., 2002; Ndebele K., et al., 2004 при фоновом воздействии ДДТ отмечается снижение секреции Th1 цитокинов (ИЛ-2, интерферона-г), увеличение Th2 цитокинов, в основном ИЛ-4, уменьшение активности натуральных киллеров, а также повышение синтеза IgE, G, A. По другим данным, наблюдается усиление факторов клеточного иммунитета - секреции Th1 цитокинов интерлейкинов (ИЛ)-1,-2, фактора некроза опухоли-б, а также повышение активности индуцибельной NO-синтазы, активности макрофагов (Kim J., et al., 2004; Dutta R., et al., 2008). Практически полностью отсутствуют сведения об изменениях иммунного статуса под влиянием низких доз ДДТ.

Цель исследования: изучение морфофункциональных изменений органов иммунной системы крыс при длительном воздействии низких доз ДДТ.

Задачи исследования:

Изучить морфофункциональные изменения тимуса крыс при длительном воздействии низких доз ДДТ;

Исследовать механизмы гибели тимоцитов под действием низких доз ДДТ;

Изучить морфофункциональные изменения селезенки крыс при длительном воздействии низких доз ДДТ;

Изучить изменения пролиферативной активности ex tempore и пролиферативного ответа на введение митогена при длительном воздействии низких доз ДДТ;

Оценить изменения цитокинового профиля сыворотки крови крыс при длительном воздействии низких доз ДДТ.

Научная новизна:

Впервые установлено, что воздействие низких доз ДДТ, предусмотренных максимальными допустимыми уровнями его содержания в продуктах питания, приводит к развитию морфофункциональных изменений органов иммунной системы.

Впервые охарактеризованы морфологические и функциональные изменения тимуса, селезенки при различном по длительности воздействии низких доз ДДТ, заключающиеся в гибели клеток лимфоидного происхождения, в том числе Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, что вначале вызывает усиление их пролиферации, а затем приводит к значительному снижению пролиферативной активности. Установлено, что в механизмах гибели тимоцитов под действием низких доз ДДТ задействован р53-зависимый путь апоптоза.

Впервые выявлено, что воздействие низких доз ДДТ приводит к изменениям цитокинового профиля, коррелирующим с морфофункциональными изменениями тимуса и селезенки, но не вызывает стойкого сдвига в балансе Th1-Th2 цитокинов.

Практическая значимость:

Выявленные морфофункциональные изменения органов иммунной системы крыс при длительном воздействии низких доз ДДТ показывают, что максимальные допустимые уровни его содержания в продуктах питания не являются безопасными для организма. Эти данные могут стать основой для дальнейших исследований по установлению безопасных уровней содержания ДДТ и его метаболитов в продуктах питания.

Внедрение результатов исследования: Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре анатомии и гистологии животных им. А.Ф.Климова ГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина.

Положения, выносимые на защиту:

Длительное воздействие низких доз ДДТ, предусмотренных МДУ его содержания в продуктах питания, приводит к развитию морфофункциональных изменений центральных и периферических органов иммунной системы крыс, обусловленных гибелью клеток лимфоидного происхождения, реактивным усилением, а затем снижением их пролиферативной активности.

Воздействие низких доз ДДТ приводит к изменениям цитокинового профиля, коррелирующим с морфофункциональными изменениями тимуса и селезенки, но не вызывает стойкого сдвига в балансе Th1-Th2 цитокинов.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены и обсуждены на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г.Москва, 2012г.), конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (г.Москва, 2012г.), ХХ международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (г.Ялта, Украина, 2012г.), VII Международном конгрессе по интегративной антропологии (г.Винница, Украина, 2013г.), конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (г.Москва, 2014г.), конференции «Окружающая среда и здоровье. Здоровая среда - здоровое наследие» (г.Москва, 2014г.), межлабораторной конференции ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (июнь 2014г.).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на 121 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 64 рисунками и 7 таблицами. Список литературы включает 145 источников, из них 49 отечественных и 96 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперимент выполнен на самцах крыс Вистар (n=64) с массой тела 80-100гг (питомник «Столбовая»). Животные содержались в виварии, уход за ними осуществлялся по нормам и правилам обращения с лабораторными животными, в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985), правилами лабораторной практики в Российской федерации (приказ МЗ РФ от 19.06.2003 №267) и законом «О защите животных от жестокого обращения» гл. V, ст. 10, 4679-ГД от 01.12.1999г. Эксперимент проведен в соответствии с правилами работы с использованием экспериментальных животных, утвержденными приказом Минздрава СССР № 577 от 12.08.1977г. и одобрен этическим комитетом НИИ морфологии человека РАМН (протокол №8а от 06.10.2011г.). Животных рандомизировали на 6 групп: 2 контрольные и 4 опытные. Доступ к воде и пище у крыс был свободным. Животные опытных групп (n=44) вместо воды получали растворы о,п-ДДТ (“Sigma”, США) с концентрацией 20 и 80мкг/л. Учет потребляемой жидкости производили ежедневно. Выбор потребляемой дозы ДДТ производили с учетом требований National Toxicology Program (США) к определению низких доз, с учетом пороговых значений низких доз для ДДТ (50 мкг/кг/сут) (Vandenberg L.N. et al., 2012) и нормативам содержания ДДТ в продуктах питания в Российской Федерации (СанПин 2.3.2.1078-01. - 2008). Животные контрольных групп (n=20) получали водопроводную воду ad libitum. Среднесуточное потребление ДДТ крысами составило 1,89±0,086мкг/кг в группе, получавшей раствор ДДТ 20мкг/л, и 7,77±0,17мкг/кг в группе, получавшей раствор 80мкг/л. Предварительно было подтверждено отсутствие в водопроводной воде и корме для лабораторных животных ДДТ, его метаболитов и родственных хлорорганических соединений. Исследование образцов проведено методом газожидкостной хроматографии в ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве».

Животных выводили из эксперимента через 6 и 10 нед. с помощью передозировки золетила (“Virbac Sante Animale”, Франция), вводимого внутримышечно в дозе 50мг/кг. Кусочки тимуса и селезенки фиксировали в растворе Буэна. После стандартной гистологической проводки с помощью гистопроцессора «Tissue-Tek VIP 5 Jr» («Hygeco», Франция) кусочки органов заливали в парафин. Срезы изготавливали с помощью микротома «Microm HM 340E» («Microm Gmbh», Германия) и окрашивали гематоксилином и эозином. Изучение гистологических препаратов проводили методом световой микроскопии с использованием микроскопа “Leica DM2500” и компьютерной морфометрии с помощью программы “ImageScope” (“Leica Microsystems, GMBH, Австрия).

В гистологических препаратах тимуса определяли соотношение коркового и мозгового веществ, ширину субкапсулярного слоя, количество тимических телец в мм2 площади среза мозгового вещества, оценивали количество ретикулярных эпителиоцитов, входящих в их состав, и стадии развития телец (1-я стадия - сближение нескольких ретикулярных эпителиоцитов с повышенной оксифилией цитоплазмы; 2-я стадия - концентрическое наслоение ретикулярных эпителиоцитов и накопление в них кератина; 3-я стадия - формирование полости в центре тельца; 4-я стадия - распад тимического тельца).

В гистологических препаратах селезенки определяли соотношение белой и красной пульпы, в белой пульпе - соотношение площади лимфатических узелков и периартериальных лимфоидных муфт (ПАЛМ), диаметр лимфатических узелков и их герминативных центров, ширину маргинальной и мантийной зон, количество лейкоцитов в маргинальной зоне в мм2 площади среза. Подсчитывали количество узелков в мм2 площади среза селезенки, долю узелков с опустошением герминативных центров. В красной пульпе определяли количество мегакариоцитов и лейкоцитов в мм2 площади среза.

Иммуногистохимическое исследование экспрессии белка р53 тимоцитами выполняли с использованием первичных кроличьих поликлональных антител (“Santa Cruz Biotechnology”, США). Визуализацию реакции осуществляли с помощью набора реактивов “UltraVision Detection System” (“Termo Scientific”, США). Препараты докрашивали гематоксилином Майера. Процент р53-позитивных клеток рассчитывали с помощью программы “ImageScope” (“Leica Microsystems, GMBH, Австрия).

Определяли пролиферативную активность клеток тимуса и селезенки крыс ex tempore (Рахмилевич А.Л. и др., 1990; Яглова Н. В. И др., 2013.). Отмытые клетки в количестве 2х105 вносили в 96-луночные планшеты для определения 4-х часовой пролиферации, добавляли 3Н-тимидин (1мкКи/лунку). После инкубации клетки снимали на харвестре, метку просчитывали на в-счетчике (“LKB” Швеция). Также определяли пролиферативную активность лимфоцитов тимуса и селезенки в реакции бласттрансформации. В лунки планшета вносили смесь 100 мкл клеток селезёнки или тимуса в концентрации 2х106 клеток/мл и 50 мкл митогена Конканавалина А (“Sigma”, США). Контрольные лунки содержали смесь клеток и среду для культивирования. Планшет инкубировали 72 ч при 37оС в атмосфере воздуха с 5% содержанием СО2. За 4 часа до окончания инкубирования в лунки вносили по 1 мкКи 3Н-тимидина. Индекс стимуляции пролиферации в реакции бласттрансформации (ИБ) определяли по формуле: ИБ= А/В, где А - Конканавалин А-стимулированная пролиферация клеток, В - пролиферация клеток в среде.

В сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью коммерческих наборов определяли концентрации ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-12, TФР-в (“Bender Medsystems”, Австрия), неоптерина и кортикостерона (“IBL”, Германия).

Статистическую обработку проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICA (“Statsoft Inc.”, США). Анализировали соответствие вида распределения признака закону нормального распределения с использованием критериев Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса, Шапиро-Уилка. Центральные тенденции и рассеяния количественных признаков, имеющих приближенно нормальное распределение, описывали средним значением М и стандартной ошибкой среднего значения m. Независимые группы сравнивали по количественному признаку с помощью t-критерия Стьюдента с учетом значений критерия Левена о равенстве дисперсий, критерия Манна-Уитни, ч2. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Морфофункциональные изменения тимуса при воздействии низких доз ДДТ

При изучении гистологических препаратов тимуса крыс всех опытных групп, в первую очередь, была отмечена гибель тимоцитов, проявляющаяся наличием участков опустошения коркового вещества, появлением картины «звездного неба». Данные признаки усиливались с увеличением среднесуточной потребленной дозы ДДТ и длительности потребления. Известно, что гибель клеток тимуса в процессах негативной селекции происходит, в основном, за счет апоптоза. По данным работ О. Tebourbi с соавт., 1998 воздействие больших доз ДДТ инициирует гибель тимоцитов также путем апоптоза. При этом имеют место два механизма апоптоза тимоцитов - р53-зависимый и р53-независимый пути (Ярилин А.А., 1996). р53-независимый путь индуцируется гормонами надпочечников - глюкокортикоидами. В связи с этим, для установления механизмов запуска апоптоза тимоцитов при действии на них низких доз ДДТ, было проведено определение концентрации кортикостерона в сыворотке крови, являющегося основным глюкокортикоидом у крыс. Еще в 60-х гг. прошлого века было установлено, что производные ДДТ в больших дозах оказывают цитостатическое действие на клетки карциномы надпочечников и соответственно, снижают продукцию глюкокортикоидов (Hoffman D. et al., 1972). В 70-е гг. препараты на основе ДДТ применялись в химиотерапии карциномы надпочечников, и в настоящее время продолжаются разработки новых цитостатических препаратов на основе ДДТ (Asp V. et al., 2010). Но механизм действия ДДТ остается до сих пор невыясненным. В нашем исследовании, во всех опытных группах отмечено снижение уровня кортикостерона по сравнению с контрольными значениями. Этот факт позволяет утверждать, что в тимусе крыс под действием ДДТ, задействован в основном р53-зависимый, а не глюкокортикоид-индуцируемый р53-независимый путь апопотоза.

Потребление ДДТ крысами в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут в течение 6 недель, приводило к морфофункциональным изменениям тимуса, обусловленным гибелью как лимфоцитов, так и ретикулярных эпителиоцитов. Гибель лимфоцитов подтверждало двукратное увеличение по сравнению с контрольной группой процентного содержания клеток, экспрессирующих белок р53 (рис.1). р53-позитивные клетки располагались диффузно в корковом веществе, а также встречались и в мозговом веществе, то есть апоптозу подвергались как дифференцирующиеся, так и дифференцированные тимоциты. Наблюдали увеличение количества тимических телец в мозговом веществе (табл.1). Таким образом, ДДТ даже в самой низкой исследованной дозе, способен усиливать гибель клеток в тимусе. Гибель клеток вызывала реактивное усиление пролиферации тимоцитов. Было отмечено статистически значимое усиление пролиферации ex tempore тимоцитов по сравнению с контрольной группой, при этом пролиферативный ответ на введение митогена не снижался (рис.2) и расширение субкапсулярного слоя, не достигшее, однако, статистически значимых отличий от контрольной группы.

В группе, потреблявшей ДДТ в дозе 7,77±0,17мкг/кг/сут в течение 6 недель, по сравнению с группой, потреблявшей меньшую дозу ДДТ, принципиальных изменений гистологического строения тимуса не было. Как и в группе крыс, потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут, отмечалась гибель лимфоцитов в корковом веществе. Значительное усиление апоптоза клеток, отмеченное в группе, потреблявшей меньшую дозу ДДТ в течение того же срока исследования, дает возможность предположить, что в данной, более высокой, дозе ДДТ, массовая гибель клеток могла наблюдаться ранее, что и привело к сужению субкапсулярного слоя по сравнению со значением опытной группы, получавшей меньшую дозу ДДТ. Доля клеток, экспрессирующих белок р53, превышала значения контрольной группы, но была меньше, чем в группе крыс (рис.1), потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут в течение аналогичного срока. р53-позитивные клетки располагались в основном на границе коркового и мозгового вещества. При этом соотношение коркового и мозгового веществ не изменялось.Однако структура мозгового вещества тимуса имела ряд отличий, связанных с усилением гибели ретикулярных эпителиоцитов. Эти процессы были выражены в увеличении количества тимических телец и ретикулярных эпителиоцитов в их составе как в сравнении с контрольной группой, так и с группой, потреблявшей ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут в течение 6 недель (табл.1). Все эти изменения привели к реактивному усилению пролиферативной активности тимоцитов как по сравнению с контрольной группой, так и по сравнению с предыдущей опытной группой, больше, чем в три раза (рис.2). Также было отмечено значительное повышение пролиферации клеток в ответ на введение митогена.

В тимусе крыс контрольной группы через 10 недель после начала эксперимента в сравнении с тимусом контрольной группы предыдущего срока исследования, было отмечено усиление гибели ретикулярных эпителиоцитов, выражавшееся в статистически значимом увеличении количества тимических телец в мм2 среза мозгового вещества, а также изменении соотношения стадий развития тимических телец в сторону увеличения доли телец в начальной стадии. Отмечалось также усиление гибели лимфоцитов. Экспрессия белка р53 клетками тимуса увеличилась более чем в два раза (рис.1). р53-позитивные клетки располагались в основном субкапсулярно. В корковом веществе были выявлены участки гибели лимфоцитов, появление картины «звездного неба». Это свидетельствует о развитии начальной стадии возрастной инволюции тимуса у крыс данного возраста (Shanley D.P. et al., 2009). Известно, что тимус достигает максимума развития к периоду полового созревания, затем начинается возрастные изменения, появляющиеся усилением гибели лимфоцитов, увеличением образования тимических телец, увеличением числа клеток в тимических тельцах, что в конечном итоге приводит к сморщиванию долек (Greenstein B.D. et al., 1986; French R.A. et al., 2002; Ярилин А.А., 2003).

Рис. 1. Процентное содержание клеток тимуса, экспрессирующих белок р53, в контрольных группах через 6 и 10 недель после начала эксперимента, и в опытных группах, потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/к/сутг и 7,77±0,17мкг/кг/сут в течение 6 и 10 недель. Статистически значимое отличие: * - от контрольной группы; # - от группы, потреблявшей меньшую дозу ДДТ.

Рис. 2. Пролиферация ex tempore и индекс пролиферации клеток тимуса контрольной и опытных групп через 6 недель после начала эксперимента. Статистически значимое отличие: * - от контрольной группы; # - от группы, потреблявшей меньшую дозу ДДТ.

После 10 недель потребления ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут, гибель ретикулярных эпителиоцитов в мозговом слое была более выражена, чем в контрольной группе за счет увеличения количества клеток, образующих тимические тельца (табл.1). Однако, процентное содержание клеток, экспрессирующих белок р53, не изменилось по сравнению с контрольной группой (рис.1). В отличие от контрольной группы, где р53-позитивные клетки располагались в основном субкапсулярно, в группе крыс, потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут в течение 10 недель, клетки, экспрессирующие белок р53, располагались диффузно в корковом и в виде скоплений в мозговом веществе. Соотношение коркового и мозгового вещества не изменялось и не отличалось от значений контрольной группы. Тем не менее, отмечалось прогредиентное снижение ширины субкапсулярного слоя, в результате чего, этот показатель был ниже, чем в контрольной группе. Наиболее вероятной причиной этого была наблюдавшаяся значительная гибель лимфобластов на более раннем сроке исследования данной дозы ДДТ, а также снижение пролиферативной активности тимоцитов в данной опытной группы, что не дало возможности восстановить численность клеток в субкапсулярном слое. Стоит также отметить, что в данной дозе исследования значительно увеличилась пролиферация тимоцитов в ответ на введение митогена (рис.3).

В тимусе крыс, потреблявших ДДТ в течение 10 недель в дозе 7,77±0,17мкг/кг/сут, отмечено усиление гибели лимфоцитов. Экспрессия белка р53 клетками тимуса возросла по сравнению с контрольной и опытной группой аналогичного срока исследования, потреблявшей меньшую дозу ДДТ (рис.1). р53-позитивные тимоциты обнаруживались в корковом и мозговом веществе, а также отмечалось увеличение их количества в субкапсулярном слое, что вместе со значительным снижением пролиферативной активности в данной группе, привело к снижению толщины слоя лимфобластов. Значительные изменения отмечались также и в строме тимуса. Увеличилось количество гибнущих ретикулярных эпителиоцитов за счет увеличения как числа тимических телец, так и количества клеток в них. При этом только в данной опытной группе, были выявлены тимические тельца 3-й стадии развития (табл.1). Значительная гибель ретикулярных эпителиоцитов привела к уменьшению доли мозгового вещества в тимусе крыс данной группы.

Сравнение изменений в группах показало, что их характер одинаков в контрольных и опытных группах, но темпы гибели клеток тимуса при потреблении ДДТ были ускорены. В опытной группе через 6 недель после начала эксперимента изменения были сходны с показателями контрольной группы через 10 недель. Поскольку в контрольной группе более длительного срока исследования наблюдались возрастные изменения тимуса, то схожесть показателей может свидетельствовать о более быстром течении этих процессов у крыс, получавших низкие дозы ДДТ в течение 6 недель. При этом данные изменения не носят адаптивный характер, т.к. известно, что в начальные сроки краткосрочной адаптации, любые, даже кратковременные стиму-лы, вызыва-ют стимуляцию коры надпочечников (Селье Г., 1960; Ткаченко Б.И., 1994). Однако, изучение концентрации кортикостерона в нашем исследовании, показало снижение его уровня во всех опытных группах. При долговременной адаптации (Меерсон Ф.З., 1981) во всех органах, ответственных за нее, появляются новые специфические изменения, обеспечивающие приспособление к новым условиям существования. Появления данных изменений в нашем исследовании также отмечено не было.

После потребления ДДТ в течение 10 недель выявленные изменения в тимусе усилились в сравнении с предыдущим сроком исследования и контрольной группой. Но характер изменений также был идентичен у сравниваемых групп, за исключением того, что тимоциты крыс, потреблявших ДДТ в течение 10 недель в меньшей дозе приобрели свойство реагировать на митоген резким усилением пролиферации на фоне пониженной пролиферативной активности. Выраженная гибель ретикулярных эпителиоцитов, наблюдаемая как через 6, так и через 10 недель в опытной группе,

Таблица. 1

Морфометрические показатели тимуса крыс, потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут и 7,77±0,17мкг/кг/сут в течение 6 и 10 недель и крыс контрольных групп (М±m)

Примечание:

Статистически значимое отличие: * - от контрольной группы; # - от группы, потреблявшей меньшую дозу ДДТ; ^ - от группы меньшего срока исследования.

указывает на возможное нарушение секреции тимических гормонов и созревания Т-лимфоцитов. Это усиление инволютивных изменений может говорить о негативном влиянии малых доз ДДТ на функционирование тимуса, а, следовательно, и быть причиной нарушения реакций в первую очередь клеточного иммунитета также как и при действии субтоксических доз ДДТ (Banerjee B.D., 1987; Udoji F. et al., 2010).

Рис. 3. Пролиферация ex tempore и индекс пролиферации клеток тимуса контрольной и опытных групп через 10 недель после начала эксперимента. Статистически значимое отличие: * - от контрольной группы; # - от группы, потреблявшей меньшую дозу ДДТ.

Морфофункциональные изменения селезенки при воздействии низких доз ДДТ

Выявленные изменения морфофункциональных показателей селезенки свидетельствуют о том, что длительное воздействие низких доз ДДТ приводит к изменениям как в белой пульпе, так и красной пульпе.

При потреблении ДДТ крысами в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут в течение 6 недель, отмечалось увеличение доли ПАЛМ, что вероятно связано с выявленным усилением пролиферативной активности клеток тимуса при воздействии аналогичной суточной дозы ДДТ на данном сроке исследования. Статистически значимо увеличилось количество узелков с гибелью клеток герминативных центров. Значительная гибель лимфоцитов подтверждается и данными других авторов, работавших с более высокими дозами (Kannan K., 1979; Rehana T. et al., 1992). При этом отмечено расширение герминативных центров в лимфатических узелках селезенки и значительное увеличение количества лейкоцитов в маргинальной зоне, происходившее за счет усиления пролиферативной активности клеток селезенки (табл.2). Однако доля маргинальной зоны во вторичных узелках уменьшилась за счет реактивного расширения герминативных центров (табл.2). Также выявлено значительное снижение индекса индуцированной пролиферации, что свидетельствует о нахождении большего количества клеток селезенки в различных стадиях митоза до введения митогена (рис.4). Данная реакция была вызвана усилением гибели клеток в герминативных центрах, отмеченным в этой группе. В красной пульпе выявлено увеличение численности лейкоцитов в единице площади среза селезенки, что, вероятно, является реактивным изменением в ответ на потребление этой дозы ДДТ. К низкой дозе инсектицида оказались чувствительны также мегакариоциты, что подтверждает отмеченное увеличение их количества в красной пульпе. Такое же увеличение отмечено в работах других авторов, изучавших воздействие различных веществ на селезенку. Так, выявлено, что длительное введение в организм крыс Т-2 токсина (продукта жизнедеятельности грибов рода Fusarium) приводило к увеличению количества мегакариоцитов в селезенке (Щебентовская О.Н., 2008). Также было установлено увеличение числа мегакариоцитов у мышей, обитающих в зоне Сибирского химического комбината, производящего ядерное топливо для атомной энергетики (Москвитина Н.С. и др., 1999).

В группе, потреблявшей ДДТ в дозе 7,77±0,17мкг/кг/сут в течение 6 недель, выявлено сужение доли ПАЛМ, что привело к уменьшению доли белой пульпы в селезенке данной опытной группы (табл.2). Также уменьшилась доля герминативных центров в лимфатических узелках. При этом узелки с большим количеством гибнущих клеток в герминативных центрах встречались чаще, чем в контрольной группе и группе крыс, потреблявших меньшую дозу ДДТ. Усиление гибели клеток селезенки при увеличении дозы подтверждается также уменьшением количества лейкоцитов в маргинальной зоне при сравнении с опытной группой, потреблявшей меньшую дозу ДДТ (табл.2). На фоне выраженной гибели клеток селезенки под действием ДДТ отмечено ответное реактивное усиление пролиферативной активности. Показатель же индуцированной пролиферации не отличался от значений контрольной группы (рис.4). Было отмечено увеличение количества первичных узелков, что также указывает на восстановление органа в ответ на значительную гибель клеток под действием ДДТ. Отмечено снижение численности лейкоцитов красной пульпы, что указывает на усиление инволютивных изменений органа под действием ДДТ (Рябикина А.И. и др., 2008). Отмечено также увеличение числа мегакариоцитов, как в сравнении со значениями контрольной группы, так и группы, потреблявшей меньшую дозу ДДТ. Данный факт указывает на их дозозависимую чувствительность к низким дозам инсектицида.

Изучение гистологического строения селезенки крыс контрольных групп выявило ряд возрастных морфофункциональных изменений органа через 10 недель после начала эксперимента. В этом сроке наблюдалось уменьшение доли белой пульпы, в основном за счет уменьшения размера лимфатических узелков. Возрастные изменения выявлены также и в строении лимфатических узелков, и в частности В-зависимых зон. Было отмечено сужение герминативных центров, а также увеличение числа узелков с опустошением герминативных центров. Известно, что возрастные изменения селезенки характеризуются сокращением доли белой пульпы, снижением доли периартериальных лимфоидных муфт и лимфатических узелков, постепенным исчезновением герминативных центров в узелках с возрастом (Сапин М.Р., 1980; Моталов В.Г., 2002; Молдавская А.А. и др., 2009).

В селезенке крыс, потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут в течение 10 недель, герминативные центры в лимфатических узелках заметно расширились по сравнению с контрольными значениями, а доля маргинальной зоны и количество лейкоцитов в ней уменьшились, что указывает на снижение количества более зрелых клеток (табл.2). Т.е. тенденция, наблюдаемая в опытной группе, получавшей ту же дозу ДДТ в течение меньшего срока исследования, сохранилась. При этом усиление пролиферации, выявленное через 6 недель, которое привело к расширению герминативных центров, на сроке 10 недель сменилось снижением пролиферативной активности. Однако, клеток, находящихся на ранних стадиях митоза, также как и через 6 недель исследования, было значительно больше, чем в контрольной группе. Это подтверждает снижение более чем в два раза значения индуцированной пролиферации по сравнению с данными контрольной группы (рис.4). В красной пульпе отмечено увеличение числа мегакариоцитов как по сравнению со значением контрольной группы.

После 10 недель потребления ДДТ в дозе 7,77±0,17мкг/кг/сут, значительно уменьшилась доля белой пульпы в селезенке. В ее составе было отмечено уменьшение доли ПАЛМ, вызванное, вероятно, статистически значимым снижением пролиферативной активности клеток тимуса, отмеченное в этой опытной группе. Было отмечено снижение доли первичных лимфатических узелков в составе белой пульпы (табл.2), что говорит об угнетении процесса новообразования узелков под действием данной дозы и указывает на ускорение под действием ДДТ начинающихся в данном возрасте инволютивных изменений. Доля гибнущих клеток в герминативных центрах была значительно больше, чем во всех остальных группах исследования. Ширина маргинальной зоны и количество клеток в ней уменьшились. При этом отмечено расширение герминативных центров, а также увеличение количества клеток на ранних стадиях митоза, что подтверждается снижением ответной реакции на введение митогена в данной группе (рис.4). Однако пролиферативная активность, как и в группе, потреблявшей меньшую дозу ДДТ, осталась сниженной по сравнению со значениями контрольной группы, т.е. реактивный ответ на гибель клеток под действием ДДТ с увеличением дозы и времени воздействия снижается. По данным других авторов более высокие дозы и более длительное воздействие ДДТ также снижали пролиферативную активность лимфоцитов селезенки (Rehana T. et al., 1992). Эти данные свидетельствуют об усилении размножения клеток в В-зависимых зонах лимфатических узелков, при увеличении темпов их гибели под действием ДДТ. В красной пульпе сохранилась тенденция увеличения числа мегакариоцитов, что подтверждает дозозависимый эффект инсектицида на эти клетки.

Рис. 4. Пролиферация ex tempore и индекс пролиферации клеток селезенки контрольной и опытных групп через 6 и 10 недель после начала эксперимента. Статистически значимое отличие: * - от контрольной группы; # - от группы, потреблявшей меньшую дозу ДДТ.

Таблица 2

Морфометрические показатели селезенки крыс, потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут и 7,77±0,17мкг/кг/сут в течение 6 и 10 недель и крыс контрольных групп (М±m)

Примечание:

Статистически значимое отличие: * - от контрольной группы; # - от группы, потреблявшей меньшую дозу ДДТ; ^ - от группы меньшего срока исследования

Изменения цитокинового профиля сыворотки крови крыс при воздействии низких доз ДДТ

Для изучения изменений цитокинового профиля под воздействием ДДТ нами были выбраны в качестве показателей функциональной активности T-хелперных клонов ИЛ-12 как основной цитокин, вызывающий дифференцировку Th0-лимфоцитов в Th1, и ИЛ-2 как один из Th1 цитокинов. Было также проведено определение уровня неоптерина как интегрального показателя выраженности реакций клеточного иммунитета, ИЛ-10, подавляющего продукцию ИЛ-2 Т-лимфоцитами (Mosmann T. et al., 1996), и ТФР-в1 как основного цитокина регуляторных Т-лимфоцитов, оказывающего иммуносупрессивное действие. Также как было отмечено ранее, изучался уровень кортикостерона, который в свою очередь обладает выраженной противовоспалительной активностью и является ингибитором продукции ИЛ-2 и ИЛ-1, подавляет пролиферацию Т-лимфоцитов, модулирует синтез и активность нуклеарных факторов АР и NFкB (Ланин Д.В. и др., 2010; Scudeletti M. et al., 1996).

Через 6 недель потребления ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут началось усиление продукции ИЛ-2. Также отмечалось повышение концентрации неоптерина и снижение ИЛ-12. У крыс, потреблявших ДДТ в дозе 7,77±0,17мкг/кг/сут через 6 недель, также отмечалось увеличение концентрации неоптерина и снижение содержания ИЛ-12 (табл.3). Таким образом, на фоне пониженного уровня кортикостерона на данном сроке эксперимента отмечалось усиление показателей клеточного иммунитета.

При употреблении ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут через 10 недель отмечалось увеличение концентрации продукции ИЛ-2 и неоптерина на фоне пониженного уровня кортикостерона. Столь резкое усиление синтеза ИЛ-2 неизбежно должно было привести к усилению секреции цитокинов регуляторными Т-лимфоцитами, что проявилось в повышении концентрации ТФР-в1, а также вызвало компенсаторное усиление продукции ИЛ-10 (табл.3).

Наметившееся снижение продукции ИЛ-10 прогрессировало и через 10 недель. Длительный прием ДДТ в дозе 7,77±0,17мкг/кг/сут по сравнению с дозой 1,89±0,086мкг/кг/сут приводил к более медленному увеличению уровня неоптерина и ИЛ-2, а также снижению в сыворотке крови концентрации как ИЛ-12, так и ИЛ-10 и снижению продукции ТФР-в1 по сравнению с предыдущим сроком исследования. Цитокиновый профиль крыс, потреблявших ДДТ в дозе 7,77±0,17мкг/кг/сут через 10 недель, соответствовал значениям, наблюдаемым у крыс, получавших меньшую дозу, через 6 недель приема ДДТ. Вероятно, это отставание проявлялось вследствие токсического воздействия ДДТ на организм в целом.

Усиление синтеза ИЛ-2 в сочетании с ростом продукции неоптерина, выявленное в настоящем исследовании, не позволяет согласиться с мнением авторов, утверждающих, что воздействие ДДТ приводит к подавлению синтеза ИЛ-2 и поляризации иммунного ответа по Th2 типу (Daniel V. et al., 2002; Ndebele K. et al., 2004; Karmaus W. et al., 2005).

Таблица.3

Изменения концентрации цитокинов и гормонов в сыворотке крови крыс, потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут и 7,77±0,17мкг/кг/сут в течение 6 и 10 нед и крыс контрольных групп (М±m)

Примечание: статистически значимое отличие: * - от контрольной группы; # - от группы, потреблявшей меньшую дозу ДДТ; ^ - от группы меньшего срока исследования.

При сопоставлении морфофункциональных характеристик тимуса и уровней цитокинов в сыворотке крови крыс, у крыс опытной группы, потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут в течение 6 недель, статистически значимые корреляции между морфологическими изменениями тимуса и концентрации неоптерина, ИЛ-2 и ТФР- в1 в сыворотке крови не наблюдались. Концентрация ИЛ-12 снижалась по мере роста продукции ИЛ-2, но чем медленнее это происходило, тем больше была толщина коркового слоя (R=0,79, p=0,000013) и количество тимических телец (R=0,51, p=0,015). В тимусе крыс, потреблявших ДДТ в дозе 7,77±0,17мкг/кг/сут в течение 6 недель, отмечена обратная зависимость между уровнем неоптерина в сыворотке крови и количеством тимических телец в мозговом веществе (R=-0,77, p=0,0006), а также количеством ретикулярных эпителиоцитов в составе телец (R=0,56, p=0,02).

Через 10 недель после начала эксперимента темпы снижения ИЛ-2 в контрольной группе четко отражались в морфологических возрастных изменениях тимуса. В тимусе у крыс с более высокими значениями ИЛ-2 был более широкий субкапсулярный слой, также отмечена зависимость между уровнем ИЛ-2 и гибелью ретикулярных эпителиоцитов (R=0,56, p=0,015). Возрастные изменения тимуса контрольных крыс коррелировали с продукцией ТФР- в1. Наблюдалась отрицательная зависимость между уровнем ТФР- в1 и шириной субкапсулярного слоя (R=-0,63, p=0,0061), а также количеством тимических телец (R=-0,56, p=0,015). Таким образом, ТФР- в1 в норме выступал как антагонист ИЛ-2 по действию на клетки тимуса.

В тимусе крыс, потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут в течение 10 недель, появилась прямая зависимость между концентрацией ТФР-в1 и количеством тимических телец (R=0,78, p=0,0004). Также подтвердилась зависимость уровня ИЛ-2 с количеством гибнущих ретикулярных эпителиоцитов (R=0,59, p=0,005). В группе, потреблявшей ДДТ в дозе 7,77±0,17мкг/кг/сут в течение 10 недель, так же, как и в контрольной группе, наблюдалась отрицательная корреляция между уровнем ТФР- в1 и шириной субкапсулярного слоя (R=-0,61, p=0,003), а также количеством тимических телец (R=-0,72, p=0,002). Этот факт подтвердил усиление возрастных изменений тимуса крыс данной группы.

При изучении цитокинового профиля и морфофункциональных характеристик селезенки крыс, потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут в течение 6 недель, отмечалась прямая зависимость между концентрацией ИЛ-2 и долей лимфатических узелков с опустошением герминативных центров (R=0,57, p=0,0052). Усиление гибели клеток закономерно приводило к росту продукции неоптерина, что демонстрировала умеренная зависимость между его концентрацией в сыворотке крови и долей лимфатических узелков с опустошением герминативных центров (R=0,48, p=0,021). Наибольшие концентрации ТФР- в1 отмечались у крыс с более выраженной гибелью клеток герминативных центров лимфатических узелков (R=0,67, p=0,00069). У крыс, потреблявших ДДТ в дозе 7,77±0,17мкг/кг/сут в течение 6 недель, в селезенке наблюдались уменьшение доли как лимфатических узелков, так и ПАЛМ, опустошение герминативных центров, увеличение количества первичных лимфатических узелков, сопровождавшееся снижением продукции ИЛ-2 и повышением ТФР- в1. Повышенный уровень неоптерина, также отражающий активность макрофагов, коррелировал с опустошением герминативных центров (R=0,79, p=0,000029).

У крыс контрольной группы, через 10 недель после начала эксперимента, было выявлено снижение доли белой пульпы, увеличение количества первичных узелков. Усилилась ранее статистически незначимая прямая зависимость между концентрацией кортикостерона, в физиологических условиях обеспечивающего развитие лимфатических узелков селезенки, и объемной долей лимфатических узелков (R=0,68, p=0,0076) и развитием в них герминативных центров (R=0,50, p=0,0047).

Через 10 недель потребления ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут, когда уровни ТФР- в1, ИЛ-2 и неоптерина достигли максимальных значений, появилась обратная зависимость между концентрацией ТФР- в1 и объемной долей белой пульпы селезенки (R=-0,45, p=0,047). При потреблении ДДТ в дозе 7,77±0,17мкг/кг/сут в течение 10 недель, данная зависимость подтвердилась (R=-0,30, p=0,005), а также, как и в контрольной группе, была выявлена зависимость между концентрацией ИЛ-2 и долей лимфатических узелков с опустошением герминативных центров (R=0,63, p=0,004).

Сопоставив данные об изменениях цитокинового профиля и показателей спонтанной пролиферативной активности клеток тимуса и селезенки обнаружили четкую зависимость между продукцией ИЛ-2 и пролиферацией клеток. Реактивное повышение пролиферативной активности в связи с гибелью клеток приводило к снижению ИЛ-2, а понижение пролиферативной активности как клеток тимуса, так и селезенки влекли за собой повышение синтеза ИЛ-2. Также обнаруживалась прямая зависимость между изменением концентрации ИЛ-2 и количеством клеток тимуса, экспрессирующих белок р53. При значительной апоптотической гибели тимоцитов, отмечалось усиление продукции ИЛ-2. При снижении темпов гибели клеток, уровень ИЛ-2 также снижался.

Таким образом, сопоставление морфологических изменений тимуса и селезенки и концентрации сывороточных цитокинов, показало, что изменения цитокинового профиля были обусловлены гибелью клеток и реактивными изменениями, направленными на восстановление структуры органов иммунной системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Воздействие низких доз ДДТ, предусмотренных МДУ его содержания в продуктах питания, вызывает морфофункциональные изменения органов иммунной системы, обусловленные гибелью клеток лимфоидного происхождения, в том числе и Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, что вначале вызывает усиление их пролиферации, а затем приводит к значительному снижению пролиферативной активности. В тимусе крыс усиливается также гибель ретикулярных эпителиоцитов, что приводит к ускорению инволютивных изменений органа. Изменения цитокинового профиля при воздействии низких доз ДДТ, обусловлены в первую очередь его иммунотоксическим действием, отражают дисбаланс между гибелью и пролиферацией клеток тимуса и селезенки, коррелируют с морфологическими изменениями этих органов. Наблюдаемое аварийное реагирование органов иммунной системы способно нарушать гомеостатические и саногенетические механизмы, приводя к развитию заболеваний, обусловленных нарушением реакций как клеточного, так и гуморального иммунитета.

ВЫВОДЫ

Длительное воздействие низких доз ДДТ, предусмотренных максимальными допустимыми уровнями его содержания в продуктах питания, приводит к развитию морфофункциональных изменений органов иммунной системы крыс Вистар.

Воздействие низких доз ДДТ вызывает морфофункциональные изменения тимуса крыс, обусловленные усилением гибели лимфоцитов и ретикулярных эпителиоцитов, что приводит к более раннему проявлению инволютивных изменений органа.

Гибель тимоцитов под действием низких доз ДДТ происходит при участии р53-зависимого пути апоптоза.

Воздействие низких доз ДДТ вызывает морфофункциональные изменения селезенки крыс, обусловленные гибелью клеток в герминативных центрах, а увеличение дозы и длительности потребления ДДТ приводит к изменениям структуры лимфатических узелков в виде расширения герминативных центров и уменьшения ширины мантийной зоны и снижению доли белой пульпы селезенки.

Усиление гибели клеток тимуса и селезенки при воздействии низких доз ДДТ вызывает реактивное усиление их пролиферативной активности и пролиферативного ответа на введение митогена. Дальнейшее увеличение дозы ДДТ и времени его воздействия, приводит к снижению пролиферативного потенциала клеток тимуса. Увеличение пролиферации клеток селезенки в ответ на введение митогена на фоне пониженной пролиферативной активности свидетельствует о сохранении пролиферативного потенциала.

Воздействие низких доз ДДТ приводит к изменениям цитокинового профиля, коррелирующим с морфофункциональными изменениями тимуса и селезенки, но не вызывает стойкого сдвига в балансе Th1-Th2 цитокинов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛЕКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Родиченко Е.П. Морфофункциональные изменения селезенки крыс при длительном воздействии фоновых доз ДДТ. // Морфологические ведомости. - 2012. - №1. - С.86-89.

2. Яглова Н.В., Родиченко Е.П., Яглов В.В. Изменения цитокинового профиля у крыс вистар при длительном воздействии низких доз ДДТ. // Иммунология. - 2012. - №2. - С.98-102.

3. Родиченко Е.П., Яглова Н.В., Яглов В.В., Обернихин С.С. Влияние хронического воздействия низких доз ДДТ на морфофункцилнальное состояние тимуса крыс. // Российский медико-биологический вестник. - 2013. - №2. - С.36-41.

4. Яглова Н.В., Тимохина Е.П., Яглов В.В. Влияние низких доз дихлордифенилтрихлорэтана на морфофункциональное состояние тимуса крыс. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т.155. - № 5. - С.657-660.

Другие публикации

5. Родиченко Е.П. Изменения структуры лимфатических узелков селезенки при длительном воздействии на организм фоновых доз инсектицида ДДТ // Человек и лекарство: Сборник материалов XIX Российского национального конгресса. - Москва, 2012. - С.561.

6. Яглова Н.В., Тимохина Е.П. Морфофункциональное состояние тимуса крыс при длительном воздействии малых доз ДДТ // Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии: Сборник научных трудов конференции. - Москва, 2012. - С.157-160.

7. Яглова Н.В., Яглов В.В., Тимохина Е.П. Гистофизиология органов иммунной системы крыс при длительном воздействии фоновых доз ДДТ // Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии: Сборник научных трудов конференции. - Москва, 2012. - С.160-163.

8. Яглова Н.В., Тимохина Е.П., Яглов В.В. Цитокиновый профиль и механизмы его изменения при длительном воздействии низких доз ДДТ // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: Труды ХХ международной конференции и дискуссионного научного клуба. - Украина, Ялта, 2012. - С.68-70.

9. Яглова Н.В., Тимохина Е.П. Гистофизиология селезенки крыс при длительном потреблении фоновых доз ДДТ // VII Мiжнародний конгресс з iнтегративноi антропологii. - Винница, Украина, 2013. - С.179-181.