Белки, взаимодействующие с LIM-доменным цитоскелетным белком зиксином в раннем развитии центральной нервной системы шпорцевой лягушки Xenopus laevis

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Белки, взаимодействующие с LIM-доменным цитоскелетным белком зиксином в раннем развитии центральной нервной системы шпорцевой лягушки Xenopus laevis

Специальность - 03.01.03 - молекулярная биология

Людмила Викторовна Ермолина

Москва 2011

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Дифференцировка клеток и морфогенетические движения являются основными процессами, обеспечивающими эмбриональное развитие. В результате дифференциальной экспрессии генов возникают многочисленные типы клеток, правильное размещение которых в эмбрионе достигается благодаря перемещению отдельных клеток и клеточных пластов. Чтобы избежать аномалий развития, эти процессы должны быть четко скоординированы друг с другом. Поэтому выяснение механизмов, обеспечивающих такую координацию, является одной из актуальных проблем молекулярной биологии развития. Одним из возможных подходов к решению данной задачи представляется поиск белков, способных, с одной стороны, регулировать морфогенетические движения клеток, а с другой - физически взаимодействовать с белками, регулирующими дифференцировку эмбриональных клеток.

Как известно, важную роль в регионализации эмбриона, а также в эмбриональной клеточной дифференцировке играют гомеодоменные транскрипционные факторы, кодируемые гомеобоксными генами (McGinnis and Krumlauf, 1992). Ранее в нашей лаборатории был идентифицирован новый класс гомеодоменных транскрипционных факторов Anf (от Anterior Neural Fold - передний нервный валик) (Zaraisky et al., 1992; Kazanskaya et al., 1997). Было показано, что представитель данного класса белков у шпорцевой лягушки Xenopus laevis (белок Xanf1) контролирует ранние стадии развития зачатка переднего мозга, из которого в ходе развития формируются большие полушария, а также промежуточный отдел головного мозга и глаза (Ermakova et al., 1999; Ermakova et al., 2007)

В настоящей работе в результате поиска белковых партнеров гомеодоменного белка Xanf1 с помощью дрожжевой двугибридной системы на модели эмбрионов шпорцевой лягушки Xеnopus laevis был идентифицирован неизвестный ранее у лягушки гомолог цитоскелетного LIM-доменного белка зиксина. Было показано, что связывание зиксина с белком Xanf1 приводит к подавлению репрессорной активности Xanf1 в клетках зачатка переднего мозга зародышей. Полученные данные представляют значительный интерес в связи с тем, что зиксин известен как белок-регулятор сборки актиновых микрофиламентов и формирования клеточных контактов, что, в свою очередь, является необходимой базой для морфогенетических движений клеток в эмбриогенезе. Таким образом, выявленная в настоящей работе способность зиксина модулировать активность гомеодоменного белка Xanf1 указывает на возможный механизм связи морфогенетических движений клеток зачатка мозга посредством зиксина с их транскрипционным аппаратом, контролируемым белком Xanf1. В частности, подобному влиянию зиксина может способствовать выявленная у него недавно способность перемещаться из клеточных контактов в ядро в ответ на приложенные к клетке механические напряжения (Cattaruzza et al., 2004; Yoshigi et al., 2005).

Полученные данные о взаимодействии зиксина с Xanf1, а также известная из литературы способность зиксина взаимодействовать со многими белками в культуре клеток, позволяют предположить, что в эмбриональном развитии зиксин может влиять на активность ряда других транскрипционных факторов и белков, вовлеченных во внутриклеточную передачу сигналов. В связи с этим, представляется актуальным целенаправленный поиск таких белков-партнеров зиксина. Идентификация подобных белков - перспективный подход к проблеме выяснения механизмов связи между морфогенезом и клеточной дифференцировкой в эмбриональном развитии.

В рамках настоящей работы поиск белков, способных взаимодействовать с зиксином, был проведен с помощью дрожжевой двугибридной системы. В результате было обнаружено взаимодействие зиксина с несколькими белками, входящими в состав сигнального каскада, запускаемого секретируемыми белками семейства Hedgehog. Данный каскад играет ключевую роль в регуляции множества процессов в нормальном эмбриогенезе, а также при паталогии, например, при некоторых онкологических заболеваниях. Очевидно, что дальнейшее изучение роли зиксина в регуляции сигнального каскада Hedgehog будет представлять большой интерес, как для понимания фундаментальных механизмов координации морфогенеза и дифференцировки, так и с точки зрения возможного использования результатов таких исследований в различных биомедицинских приложениях.

Цель и задачи работы

Целью данной работы была идентификация белков, способных физически взаимодействовать с гомеодоменным фактором транскрипции Xanf1 и изучение функций этих взаимодействий в раннем эмбриональном развитии головного мозга шпорцевой лягушки Xеnopus laevis.

В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Найти новые белки-партнеры транскрипционного фактора Xanf1. Клонировать полную нуклеотидную последовательность кДНК гомолога LIM-доменного белка зиксина шпорцевой лягушки, идентифицированного в результате проведенного поиска. Провести сравнительный анализ аминокислотной последовательности зиксина Xеnopus laevis с последовательностями известных гомологов зиксина у других позвоночных.

2. Изучить пространственно-временную динамику экспрессии гена зиксина в процессе раннего развития зародышей шпорцевой лягушки.

3. Подтвердить независимыми методами способность Xanf1 связываться с зиксином и локализовать белковые домены, отвечающие за это связывание.

4. Изучить на модели эмбрионов шпорцевой лягушки влияние зиксина на транскрипционную активность Xanf1.

5. Идентифицировать другие белки, взаимодействующие с зиксином в процессе эмбриогенеза.

Научная новизна

В ходе работы впервые был идентифицирован гомолог цитоскелетного LIM-доменного белка зиксина у шпорцевой лягушки. Клонирована полная последовательность кДНК этого белка и проведен структурный и сравнительный анализ его аминокислотной последовательности.

Впервые изучен пространственно-временной паттерн экспрессии гена зиксина в эмбриогенезе шпорцевой лягушки.

Впервые показана способность зиксина физически взаимодействовать с гомеодоменным транскрипционным фактором Xanf1 и локализованы области взаимодействия этих белков.

Продемонстрировано ингибирующее влияние зиксина на репрессорную активность Xanf1 в клетках зачатка головного мозга эмбрионов шпорцевой лягушки.

Впервые установлена способность зиксина связываться с тремя участниками сигнального каскада, запускаемого Hedgehog-белками: рецептором Ptc2 и транскрипционными факторами Gli1 и Zic1.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на III и IV Российских симпозиумах «Белки и пептиды» (Пущино, 16-21 сентября 2007 г. и Казань, 23-27 июня 2009 г., соответственно); ХХ зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико- химической биологии и биотехнологии» (Москва, 11-15 февраля 2008 г.); международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 28 сентября - 2 октября 2009 г.); XVIII международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Гурзуф, 31 мая-10 июня 2010 г.).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 5 тезисов.

2. Основное содержание работы

Поиск белков, взаимодействующих с транскрипционным фактором Xanf1, при помощи дрожжевой двугибридной LexA-системы

Для поиска потенциальных партнеров транскрипционного фактора Xanf1 мы использовали дрожжевую двугибридную LexA-систему (CLONTECH), основанную на детекции взаимодействия двух белков по активации транскрипции репортерных генов в дрожжевых клетках. В качестве целевой последовательности в bait-векторе pGilda была использована кДНК, кодирующая полноразмерный белок Xanf1. Данная конструкция была трансформирована в дрожжевые клетки штамма EGY48 совместно с кДНК-библиотекой из зародышей шпорцевой лягушки Xenopus laevis на стадии поздней гаструлы - ранней нейрулы (ст.12,5) в prey-векторе pB42AD (Matchmaker LexA two-hybrid system, CLONTECH). После выращивания трансформированных дрожжей на селективной среде без Leu, было отобрано 67 клонов с активированным колометрическим репортерным геном LacZ с помощью метода Colony-lift filter assay.

Плазмиды pB42AD, содержащие вставки кДНК, были выделены из отобранных дрожжевых колоний, ре-трансформированы в клетки E. сoli для последующего выделения и повторной трансформации в дрожжевой штамм EGY48 вместе с контрольной плазмидой pLexA-laminС, кодирующей гибридный белок LexA-ламин С человека (66-230 а.о.). После проверки белок-белковых взаимодействий по вышеописанной методике, только 19 клонов оказались истинно положительными.

В результате секвенирования фрагментов кДНК, содержащихся в выделенных из найденных клонов плазмидах, и последующего анализа полученных последовательностей при помощи пакета программ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, было показало, что они кодируют С-концевые фрагменты 4 различных белков, в том числе фрагмент не описанного ранее у шпорцевой лягушки белка, гомологичного цитоскелетному белку зиксину человека, мыши и курицы.

Как известно, зиксин участвует в регуляции динамики цитоскелета, включая формирование клеточных контактов и сборку актиновых стресс-фибрилл, крепящихся к контактам. В тоже время, зиксин способен перемещаться в ядро и влиять на экспрессию генов. Важно отметить, что одним из сигналов, вызывающих изменение внутриклеточной локализации зиксина в культуре клеток, являются приложенные к клетке механические напряжения (Cattaruzza et al., 2004; Yoshigi et al., 2005). Как известно, в индивидуальном развитии такие напряжения закономерно создаются в тканях эмбриона в результате морфогенетических движений самих клеток. Таким образом, в эмбриогенезе зиксин может участвовать в регуляции транскрипционной активности Xanf1 в ответ на изменение морфогенетического статуса клетки, что в свою очередь является возможным звеном механизма, координирующего морфогенез с экспрессией генов. В связи с этим, дальнейшее изучение роли возможного взаимодействия зиксина c гомеодоменным транскрипционным фактором Xanf1 в регуляции раннего развития зачатка головного мозга представляет значительный интерес.

Клонирование полноразмерной последовательности кДНК зиксина Xenopus laevis.

В результате скрининга кДНК библиотеки был идентифицирован фрагмент кДНК из 889 п.о., включающий последовательность, кодирующую 293 а.о. полипептид, гомологичный С-концевому региону белка зиксина у человека и курицы, а также 3'-некодирующую последовательность. Фрагмент кДНК, включающий 5'-некодирующую последовательность и последовательность, кодирующую недостающий N-концевой регион зиксина, был получен методом ПЦР с использованием праймеров, созданных на основе анализа перекрывающихся последовательностей из EST-базы данных. В качестве матрицы использовали исходную кДНК библиотеку из зародышей Xеnopus laevis на стадии ранней нейрулы. Имеющиеся 5`- и 3`- концевые фрагменты кДНК зиксина были клонированы в открытой рамке считывания в экспрессионный вектор pSp64-poly(A) (Promega). Таким образом, была получена кДНК, кодирующая полноразмерный зиксин шпорцевой лягушки длиной 663 а.о. (GenBank EF051627). С помощью программ ExPASy Proteomics Server была определена расчетная молекулярная масса зиксина 70725,46Да.

Рис.1: Детекция белка зиксина в лизатах ооцитов X. laevis, инъецированных синтетической мРНК, кодирующей зиксин (дорожка 1), методом иммуноблота с использованием поликлональных кроличьих антител, специфичных к С-концевому фрагменту зиксина шпорцевой лягушки. Для детекции эндогенного зиксина использовали лизаты неиъецированных (контрольных) ооцитов (дорожка 2).

На основе созданной конструкции была синтезирована мРНК, кодирующая зиксин. В результате трансляции полученной мРНК в ооцитах Xеnopus laevis было показано, что синтезирующийся на данной матрице белок идентичен по молекулярной массе эндогенному нативному зиксину (105кДа; Pис.1, дорожка 1). Эндогенный и экзогенный белок детектировали методом иммуноблота с использованием полученных в нашей лаборатории поликлональных кроличьих антител, специфичных к С-концевой области зиксина из шпорцевой лягушки (373-664 а.о.). Разницу между расчетной и фактической молекулярной массой можно объяснить тем, что в клетках белок зиксин подвергается посттрансляционным модификациям, в частности, фосфорилированию, как и его гомологи у других позвоночных (Crawford and Beckerle, 1991; Macalma et al., 1996). C помощью программы NetPhos2 мы определили в молекуле зиксина из Xеnopus laevis 38 потенциальных сайтов фосфорилирования (Ser: 31, Thr: 5, Tyr: 2), в то время как его гомологи у человека и курицы содержат 30 таких остатков.

Рис.2: Cравнение аминокислотных последовательностей гомологов белка зиксина у шпорцевой лягушки (Xenopus laevis), курицы (Gallus gallus) и человека (Homo sapiens).

Черным цветом отмечены полностью гомологичные участки последовательностей, серым цветом - частично гомологичные. Доменная структура у приведенных белков высоко консервативна, но зиксин у шпорцевой лягушки длиннее по сравнению с его гомологами (строчными буквами обозначены последовательности, имеющиеся только у зиксина из Xenopus laevis, в последовательностях зиксина курицы и человека в этих участках поставлены прочерки).

С помощью пакета программ GeneBee нами был проведен сравнительный анализ полученной полноразмерной последовательности белка зиксина у Xеnopus laevis с последовательностями его гомологов у курицы (GenBank CAA48936) и человека (GenBank NP_003452) (Рис.2). В молекуле зиксина лягушки содержится три структурных элемента, характерных для всех изученных зиксинов: N-концевая часть с высоким содержанием остатков пролина, сигнальная последовательность экспорта из ядра (NES, nuclear export signal) и три LIM-домена, тандемно расположенные в С-концевой области. Наиболее консервативной частью найденного белка (80% гомологии) является его С-концевая часть (остатки 373-664), включающая NES и три LIM-домена, тогда как общая степень гомологии приведенных последовательностей составляет 53.2%.

Экспрессия гена зиксина в эмбриональном развитии Xenopus laevis

Поскольку ген зиксина у Xenopus laevis был описан нами впервые, мы провели подробное исследование пространственно-временной динамики его экспрессии в ходе раннего развития эмбрионов шпорцевой лягушки, начиная со стадии средней бластулы (ст.8), заканчивая стадией хвостовой почки (ст.26), на которой зародыш начинает совершать спонтанные движения.

Временную динамику экспрессии гена зиксина изучали с помощью метода ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) (Рис.3A).

Рис.3: Анализ пространственно-временной динамики экспрессии гена зиксина в ходе раннего развития зародышей Xenopus laevis.

Для этого из зародышей на последовательных стадиях развития выделяли тотальную РНК, синтезировали на ее основе первую цепь кДНК, которую использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР. В качестве контроля общего количества мРНК в используемых образцах анализировали уровень экспрессии гена фактора трансляции EF-1б (elongation factor 1 alpha), который в норме должен быть приблизительно одинаковым в рассмотренном ряду стадий. В результате было установлено, что на стадии средней бластулы (ст.8) мРНК зиксина синтезируется сравнительно слабо. В процессе развития к стадии поздней гаструлы-ранней нейрулы (ст.12,5) уровень синтеза постепенно усиливается и сохраняется в дальнейшем на постоянном уровне.

A. Результаты OT-ПЦР с использованием праймеров к кДНК зиксина и в качестве матрицы образцов тотальной РНК, выделенной из зародышей на указанных стадиях развития. «-к»- контрольная реакция, проведенная без добавления фермента обратной транскриптазы. В качестве контроля приведен уровень экспрессии гена EF-1б на соответствующих стадиях развития. Б. Детекция белка зиксина в лизатах зародышей Xеnopus laevis на указанных стадиях развития методом иммуноблотинга с использованием поликлональных кроличьих антител, специфичных к зиксину. В качестве контроля приведен уровень синтеза белка альфа-тубулина.

В. Анализ паттерна экспрессии гена зиксина в зародышах шпорцевой лягушки методом гибридизации in situ. Темно-синее окрашивание, проявляющееся в результате реакции, маркирует клетки зародыша, содержащие мРНК исследуемого гена. В1. Стадия ранней гаструлы, вид зародыша анимальным полюсом вверх. В2. Стадия маленькой желточной пробки. Пунктирная линия обозначает границы будущей нервной пластинки. B3. Ранняя стадия нервных валиков, вид со спины и с правого боку. B4. Стадия нервного желобка. B5. Стадия хвостовой почки. Дорс - вид зародыша со спины (дорсальная сторона); латер - вид сбоку (латеральная сторона). Ст.10 - стадия развития 10 (Nieuwkoop P.D., 1956) и т.д.

Для проверки полученных данных, определяли уровень синтеза белка зиксина в лизатах зародышей на нескольких последовательных стадиях развития методом иммуноблота с использованием поликлональных кроличьих антител, специфичных к зиксину (Рис.3Б).

В качестве контроля общего уровня синтеза белков оценивали количество белка альфа-тубулина в исследуемых образцах лизатов методом иммуноблота с помощью мышиных моноклональных антител к б-тубулину (клон DM1A, Sigma). Полученные данные свидетельствуют о том, что на стадии поздней бластулы синтез белка зиксина находится на низком уровне, но плавно усиливается к началу нейруляции (ст.13) и в дальнейшем развитии поддерживается на относительно постоянном уровне, что полностью согласуется с результатами ОТ-ПЦР. Тот факт, что уровень синтеза зиксина увеличивается в ходе гаструляции и нейруляции, когда происходят наиболее интенсивные морфогенетические движения клеток и клеточных пластов, указывает на важную роль зиксина в регуляции клеточной подвижности в раннем развитии.

Рис. 4. Сравнение паттернов экспрессии генов Xanf1 (А) и зиксина (Б) в зародышах Xеnopus laevis на стадии средней нейрулы (ст.15).

Границы нервной пластинки отмечены пунктиром. Зародыши показаны с дорсально-антериорной стороны. А`-Б`. Схематическое изображение окрашенных зародышей. Желтой пунктирной линией обозначена зона экспрессии Xanf1, красной пунктирной линией - антериорная граница нервной пластинки. В. Половинки одного зародыша шпорцевой лягушки на стадии средней нейрулы, окрашенные по отдельности методом гибридизации in situ с антисмысловым зондом, комплементарным мРНК Xanf1 (слева) или зиксина (справа). В`. Схема продольных срезов зародыша. 1- передняя (антериорная) часть нервной пластинки.

Распределение мРНК зиксина в тканях развивающихся зародышей исследовали методом гибридизации in situ на целых зародышах с использованием антисмысловых РНК-зондов, комплементарных мРНК зиксина (Рис.3В). В результате было показано, что на стадии ранней гаструлы (ст.10) слабая экспрессия наблюдается в анимальной части зародыша (Рис.3В1). К концу гаструляции - началу нейруляции (ст.12,5) экспрессия возрастает в клетках головной эктодермы эмбриона, особенно в области формирующейся нервной пластинки (Рис.3В2).

В течение нейруляции экспрессия продолжает усиливаться в передней части нервной пластинки и в граничащей с ней области не-нейральной эктодермы, в т.ч. в области будущей присоски, тогда как в задней части нервной пластинки (будущий спинной мозг) экспрессия ослабляется (Рис. 3В3-4). На стадии хвостовой почки (ст.26) экспрессия наблюдается в наибольшей степени в области зачатка головного мозга, несколько слабее - в глазных и слуховых пузырях, сомитах и вокруг присоски, хотя в области самой присоски экспрессии нет (Рис.3В5).

Зоны экспрессии гена зиксина не имеют четких границ. Очевидно, это связано с тем, что белок зиксин участвует в формировании клеточных контактов и регуляции сборки актиновых филаментов и поэтому должен синтезироваться в каждой клетке организма. Наиболее высокий уровень экспрессии наблюдается в клетках зачатка центральной нервной системы, особенно в его передней части, из которой формируется головной мозг. Исходя из этого, можно предположить, что зиксин играет специфическую роль в развитии ЦНС.

Подробное исследование паттерна экспрессии гена зиксина в ходе раннего развития позвоночных животных на примере шпорцевой лягушки, проведенное в данной работе, было сделано впервые. В работах, посвященных изучению гомологов зиксина у курицы, мыши и человека, содержатся данные только о распределении белка в тканях взрослого организма и в культивируемых клетках.

Сравнение зон экспрессии генов зиксина и Xanf1 в зародышах на стадии средней нейрулы (ст.15) показало, что они перекрываются (Рис.4А-Б), причем трапециобразная область экспрессии гена Xanf1 в передней части нервной пластинки целиком лежит внутри области, в которой ген зиксина экспрессируется наиболее сильно (Рис. 4Б`).

Для более детального анализа распределения мРНК исследуемых генов по клеточным слоям, фиксированные зародыши шпорцевой лягушки продольно разрезали на две половинки, которые по отдельности окрашивали методом гибридизации in situ с антисмысловым зондом, комплементарным мРНК Xanf1 или зиксина (Рис. 4В). Сопоставление окрашенных половин показало, что оба гена экспрессируются в клетках нейроэктодермы, из которой в ходе развития формируются конечный (большие полушария) и промежуточный отделы головного мозга и глаза (Kazanskaya et al., 1997; Zaraisky et al., 1995; Zaraisky et al., 1992). При этом область экспрессии гена зиксина распространяется более широко, выходя за границы будущего переднего мозга в антериорном и постериорном направлениях.

Полученные данные подтверждают возможность взаимодействия белков зиксина и Xanf1 in vivo.

Зиксин способен связываться с Xanf1 in vivo

Для тестирования способности зиксина взаимодействовать с белком Xanf1 in vivo мы использовали метод ко-иммунопреципитации. Синтез белков проводили в клетках развивающихся эмбрионов шпорцевой лягушки, поскольку в данной системе могут быть реализованы все возможные посттрансляционные модификации белков. Для этого в зародыши на стадии 2-4 бластомеров были инъецированы следующие смеси синтетических мРНК, полученных на основе соответствующих плазмидных конструкций: 1) мРНК FLAG-С`Zyxin, кодирующая С-концевой участок зиксина, содержащий NES и три LIM-домена (373 - 664 а.о.), слитый с FLAG-пептидом; и мРНК myc-Xanf1, кодирующая полноразмерный Xanf1, слитый с шестью myc-эпитопами; 2) мРНК myc-Xanf1. Иъецированные зародыши инкубировали до стадии ранней нейрулы (ст.12,5-13) и лизировали. В первом случае комплексы гибридных белков FLAG-С`Zyxin и myc-Xanf1 осаждали из лизата зародышей двумя способами: 1) с использованием анти-myc антител, иммобилизованных на протеин-G агарозе, и анализировали методом иммуноблота с анти-FLAG антителами, конъюгированными со щелочной фосфатазой (Рис.5, дорожка 1); 2) с использованием анти-FLAG антител, ковалентно пришитых на агарозный носитель (Red ANTI-FLAG M2 Agarose Affinity Gel (Sigma), и анализировали методом иммуноблота с анти-myc антителами, конъюгированными со щелочной фосфатазой (Рис.5, дорожка 3).

Во втором случае комплексы гибридного белка myc-Xanf1 с эндогенным зиксином осаждали с использованием анти-myc антител, иммобилизованных на протеин-G агарозе, и детектировали при помощи иммуноблота с использованием поликлональных кроличьих антител, специфичных к С-концевому участку зиксина, с последующей инкубацией с вторичными антителами, связанными со щелочной фосфатазой (Рис.5, дорожка 8). В обоих случаях на иммуноблоте был детектирован четкий сигнал, что свидетельствует об образовании вышеуказанных белковых комплексов в клетках зародышей.

Результаты иммуноблота белковых комплексов, осажденных при помощи анти-myc (дорожки 1,8) или анти-FLAG (дорожка 3) антител из лизатов зародышей, инъецированных мРНК myc-Xanf1 вместе с мРНК FLAG-C`Zyxin (дорожки 1-4), или только мРНК myc-Xanf1 (дорожки 8-9). Для детекции уровня синтеза белков использовали исходные лизаты зародышей (дорожки 5-7 и 10-11).

Рис.5. Анализ взаимодействия белков зиксина и Xanf1 в зародышах Xеnopus laevis методом ко-иммунопреципитации (Ко-ИП).

Второй LIM-домен зиксина отвечает за связывание с Engrailed-подобным репрессорным доменом Xanf1

Для локализации областей взаимодействия зиксин и Xanf1 были созданы делеционные мутанты обоих белков и проанализировано их связывание в дрожжевой двугибридной LexA- системе.

Поскольку в результате скрининга кДНК библиотеки было обнаружено взаимодействие Xanf1 с С-концевым фрагментом зиксина, содержащим три LIM-домена, которые, как известно, отвечают за белок-белковые взаимодействия (Schmeichel and Beckerle, 1994; Schmeichel and Beckerle, 1997), можно предположить, что связывание зиксина с Xanf1 опосредовано одним из трех LIM-доменов. Для проверки данного предположения фрагменты кДНК, кодирующие LIM-домены зиксина попарно и по отдельности, были клонированы в bait-вектор pMW103 в открытой рамке считывания с кДНК, кодирующей LexA белок. В качестве prey-вектора использовали плазмидную конструкцию на основе вектора pB42AD, кодирующую гибрид полоразмерного Xanf1 с белком B42, активатором транскрипции. После ко-трансформации этих плазмид в дрожжевые клетки оценивали уровень экспрессии двух репортерных генов, который напрямую зависит от силы взаимодействия исследуемых гибридных белков: ауксотрофного гена LEU2 по росту дрожжевых колоний на селективной среде без лейцина и колометрического гена LacZ по активности фермента в-галактозидазы с помощью цветной ферментативной реакции с использованием субстрата ONPG в жидкой среде. В результате было выявлено, что второй LIM-домен зиксина сильнее других доменов связывается с Xanf1 (Рис.6А).

Ранее было показано, что некоторые фрагменты зиксина, расположенные на N-конце его молекулы (110-167 и 345-362 а.о., содержащие два пролин-богатых мотива и NES, соответственно), способны самостоятельно активировать экспрессию репортерных генов в дрожжах (Li and Trueb, 2001). Поэтому для того, чтобы проверить взаимодействие N-концевого участка (1-455 а.о.) белка зиксина с Xanf1 в двугибридной системе, фрагмент кДНК, кодирующий этот участок зиксина, был клонирован в вектор pB42AD. В этом случае в качестве bait-вектора использовали плазмидную конструкцию на основе вектора pMW103, кодирующую гибрид Xanf1 с LexA. В результате ко-трансформации описанных плазмид в дрожжевые клетки и анализа транскрипционной активности репортерных генов не было выявлено значимое взаимодействие данного фрагмента зиксина с Xanf1 (Рис.6А).

Рис. 6. Определение участков в молекуле белка зиксина, отвечающих за связывание транскрипционного фактора Xanf1. А.

Анализ взаимодействия делеционных мутантов белка зиксина с полноазмерным Xanf1 с помощью дрожжевой двугибридной LexA-системы. Доменная организация делеционных мутантов зиксина представлена в виде схем; знаком «+» напротив каждой схемы отмечена способность соответствующего мутанта активировать экспрессию двух репортерных генов (LEU2 и LacZ) в дрожжах. Б. Результаты иммуноблота белковых комплексов myc-Xanf1 с GST-гибридами различных LIM-доменов зиксина, полученных в результате осаждения myc-Xanf1 из лизатов зародышей шпорцевой лягушки, инъецированных соответствующей синтетической мРНК, на глутатион-сефарозе (дорожки 2-4). Для детекции уровня синтеза myc-Xanf1 использовали исходные лизаты зародышей (дорожка 1).

Данные, полученные с помощью двугибридной системы, были проверены в системе in vitro с помощью метода pull-down. Каждый из трех LIM-доменов зиксина (первый (454-530 а.о.), второй (530-590 а.о.) и третий (592-664 а.о.)) был синтезирован в бактериях E.coli (штамм CodonPlus BL21(DE3)) в виде гибрида с ферментом глутатион S-трансферазой (glutathione S-transferases, GST) и специфично связан с глутатион-сефарозой. Гибридный белок myc-Xanf1 нарабатывали в ооцитах лягушки, инъецированных соответствующей синтетической мРНК. Грубые лизаты ооцитов затем использовали для анализа способности различных LIM-доменов зиксина, слитых с GST, осаждать myc-Xanf1. Белковые комплексы элюировали со смолы и анализировали методом иммуноблота с использованием анти-myc антител, конъюгированных со щелочной фосфатазой. В результате было показано, что только GST-гибрид второго LIM-домена зиксина обладает способностью связываться с myc-Xanf1 в условиях in vitro (Рис.6 Б, дорожка 2).

А. Анализ взаимодействия делеционных мутантов белка Xanf1 с C-концевым участком или вторым LIM-доменом зиксина с помощью дрожжевой двугибридной LexA-системы. Доменная организация делеционных мутантов Xanf1 представлена в виде схем; знаком «+» напротив каждой схемы отмечена способность соответствующего мутанта активировать экспрессию двух репортерных генов (LEU2 и LacZ) в дрожжах.

Рис.7: Определение участков в молекуле белка Xanf1, отвечающих за связывание цитоскелетного белка зиксина.

Б. Результаты иммуноблота белковых комплексов myc-Xanf1 или myc-Xanf1-deltaEH1 с GST-гибридом второго LIM-домена зиксина, полученных в результате осаждения myc-Xanf1 (дорожка 3) или myc-Xanf1-deltaEH1 (дорожка 4) из лизатов зародышей шпорцевой лягушки, инъецированных соответствующей синтетической мРНК, на глутатион-сефарозе. Для детекции уровня синтеза гибридных белков myc-Xanf1 (дорожка 1) или myc-Xanf1-deltaEH1 (дорожка 2) использовали исходные лизаты зародышей. В. Результаты иммуноблота белковых комплексов myc-Xanf1 (дорожка 2) или myc-Xanf1-deltaEH1 (дорожка 3) с FLAG-C`Zyxin, осажденных при помощи анти-myc антител из лизатов зародышей, инъецированных смесью соответствующих синтетических мРНК. Для детекции уровня синтеза белков использовали исходные лизаты зародышей (дорожки 4-6). Г. Схематичное изображение доменной структуры белков зиксина и Xanf1 с указанием доменов, отвечающих за взаимодействие этих белков.

Аналогичный подход был применен для локализации участка в молекуле Xanf1, отвечающего за взаимодействие со вторым LIM-доменом зиксина.

Белок Xanf1 содержит два консервативных домена: N-концевой Engrailed-подобный домен (Engrailed Homology 1, ЕН1), отвечающий за взаимодействие c транс-регуляторными факторами, например, с Groucho-подобным ко-репрессором TLE1 (Dasen et al., 2001), и ДНК-связывающий гомеодомен на C-конце молекулы (Kazanskaya et al., 1997). Логично предположить, что именно EH1-домен непосредственно участвует в связывании LIM2-домена зиксина. Для проверки этого предположения фрагменты кДНК, кодирующие полноразмерный белок Xanf1 и его N- и С-концевые части (1-77 и 77-187 а.о., соответственно), а также делеционный мутант Xanf1 без EH1-домена (Xanf1-deltaEH1, удалены остатки 16-33), были клонированы в prey-вектор pB42AD. В качестве bait-векторов использовали плазмидную конструкцию на основе вектора pMW103, кодирующую гибрид LexA либо с тремя LIM-доменами зиксина (455 - 664 а.о.), либо только со вторым LIM-доменом (530-590 а.о.). В результате котрансформации этих плазмид в клетки дрожжей и анализа активности двух репортерных генов было определено, что EH1-домен необходим для связывания Xanf1 со вторым LIM-доменом зиксина (Рис.7А).

Для подтверждения полученных данных мы синтезировали полноразмерный Xanf1 и его делеционный мутант без EH1-домена в виде белков слияния с шестью myc-эпитопами в зародышах Xеnopus laevis и сравнили их способность связываться с: 1) GST-гибридом второго LIM-домена зиксина, иммобилизованным на глутатион-сефарозе (Рис.7Б); 2) гибридным белком FLAG-C`Zyxin в клетках развивающихся зародышей (Рис.7В). Результаты, полученные методами pull down и ко-иммунопреципитации, показали, что делеционный мутант Xanf1-deltaEH1 гораздо слабее связывается с указанными фрагментами зиксина по сравнению с целым белком Xanf1.

Таким образом, по совокупности данных, полученных в различных экспериментах, можно утверждать, что связывание зиксина с Xanf1 опосредовано вторым LIM-доменом зиксина и EH1-доменом Xanf1 (Рис.7Г). Консервативность доменов, участвующих в связывании, может свидетельствовать о наличии некоторого эволюционно значимого механизма передачи сигнала из области межклеточных контактов в ядро, приводящего к изменению работы специфических генов и особой важности функциональных исследований этого механизма.

Ко-локализация белков Xanf1 и зиксина в клетках линии CV-1

Ко-локализации белков-партнеров в определённых компартментах клетки является хорошим подтверждением возможности их взаимодействия в живых клетках, поэтому мы изучили внутриклеточную локализацию белков зиксина и Xanf1 в культуре клеток CV-1 (эпителиальные клетки почки зеленой мартышки). Поскольку Xanf1 является фактором транскрипции, логично предположить, что в клетках он будет находиться в ядре. Проведенные исследования распределения известных гомологов зиксина в клетках показали, что зиксин преимущественно локализован в фокальных контактах и вдоль стресс-фибрилл (пучков актиновых филаментов, крепящихся к контактам) (Beckerle, 1986; Macalma et al., 1996), но способен перемещаться в ядро (Nix and Beckerle, 1997). Поэтому, можно ожидать, что белки Xanf1 и зиксин могут одновременно находиться в клеточных ядрах.

Клетки CV-1 были трансфицированы следующими экспрессионными конструкциями по отдельности: 1) pZyxin-EGFP, кодирующей гибрид полноразмерного зиксина человека с зеленым флуоресцентным белком, 2) pCS-MT-Xanf1, кодирующей полноразмерный транскрипционный фактор Xanf1, слитый с шестью myc-эпитопами. После проведения трансфекции клетки инкубировали 24 часа и фиксировали 4% параформальдегидом. Для визуализации myc-Xanf1 клетки последовательно окрашивали мышиными анти-myc антителами и специфичными к иммуноглобулинам мыши кроличьими антителами, конъюгированными с красителем Texas Red. Распределение в клетках EGFP-Zyxin наблюдали по естественному свечению зеленого флуоресцентного белка. Анализ трансфицированных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии выявил следующие особенности распределения гибридов исследуемых белков в клетках: EGFP-Zyxin преимущественно находится в фокальных контактах и вдоль стресс-фибрилл (Рис.8Б), а myc-Xanf1 - в ядре (Рис.8А), как мы и предполагали.

Далее мы проверили, изменяют ли исследуемые гибридные белки свою локализацию, когда синтезируются в клетках вместе. Для этого клетки линии СV-1 были ко-трансфицированы вышеописанными плазмидными конструкциями. В результате анализа ко-трансфицированных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии было показано, что во многих клетках происходит перераспределение обоих белков-партнеров: EGFP-Zyxin появляется в ядре (Рис.8Г), а myc-Xanf1 равномерно распределяется между ядром и цитоплазмой (Рис.8В). Таким образом, оба белка могут находиться в одном и том же клеточном компартменте и влиять на распределение друг друга, что подтверждает реальность взаимодействие зиксина с Xanf1.

Зиксин подавляет активность транскрипционного репрессора Xanf1 в клетках зачатка переднего мозга зародышей шпорцевой лягушки Xenopus laevis

Как известно, работа транскрипционных факторов, в том числе гомеодоменных белков, часто регулируется посредством физического взаимодействия с различными белками, которые влияют на их внутриклеточное распределение, связывание с ДНК или другими белками - ко-факторами и т.п. Поскольку нами было показано, что зиксин способен связываться с Xanf1 и способствовать его накоплению в цитоплазме клеток, было решено выяснить, влияет ли зиксин на транскрипционную активность Xanf1. Принимая во внимание известную способность зиксина активировать транскрипцию репортерных генов в дрожжах (Li and Trueb, 2001) и в культуре клеток млекопитающих (Degenhardt and Silverstein, 2001), предварительно было сделано предположение, что данный белок играет роль отрицательного регулятора репрессорной активности Xanf1.

В качестве экспериментальной модели были выбраны зародыши шпорцевой лягушки. Ранее в нашей лаборатории с помощью данной модели было показано, что Xanf1 подавляет в зачатке переднего мозга экспрессию двух гомеобоксных генов, регулирующих развитие среднего и промежуточного отделов мозга: Otx2 и Pax6. В связи с этим, паттерны экспрессии данных генов имеют характерный «пробел» в передней части нервной пластинки, как раз в той области, в которой экспрессируется ген Xanf1 (Ermakova et al., 1999; Ermakova et al., 2007) (Рис. 9А1-2). Ингибирование трансляции эндогенной мРНК Xanf1 с помощью морфолиновых анти-смысловых олигонуклеотидов (МО) вызывает эктопическую экспрессию генов Otx2 и Pax6 в передней части нервной пластинки на стадии нейрулы (Рис.9Б1-2), а в ходе дальнейшего развития приводит к сильной редукции переднего мозга и циклопии (сближение или слияние глаз) (Рис.10Б). В то же время, эктопическая экспрессия гена Xanf1 приводит к развитию аномальных выростов переднего и среднего мозга (Ermakova et al., 1999). Принимая во внимание эти данные, можно предположить, что, если зиксин действительно влияет на транскрипционную активность Xanf1, то изменение работы гена зиксина или его продукта должно повлиять на экспрессию генетических мишеней Xanf1 в передней части нервной пластинки, и, как следствие, привести к видимым морфологическим аномалиям в развитии.

Для проверки выдвинутого предположения зародыши шпорцевой лягушки были микроинъекцированы синтетической мРНК, кодирующей зиксин, на стадии 2-4 бластомеров в два бластомера со стороны анимального полюса зародыша. Чтобы отследить распределение инъецированного материала в развивающемся зародыше использовали флуоресцентный краситель Fluorescein lysine dextran (FLD).

Рис. 8: Изменения паттернов экспрессии генов Otx2 (Б1-Д1) и Pax6 (Б2-Д2) в зародышах шпорцевой лягушки на стадии средней нейрулы (ст.15), вызванные микроинъекцией морфолино олигонуклеотидов, специфичных к мРНК Xanf1 (Б1-2) или различных синтетических мРНК, кодирующих: зиксин (В1-2), мутант зиксина, содержащий NLS (Г1-2), доминантно-репрессорный гибридный белок EnR-зиксин-NLS (Д1-2).

Часть инъецированных зародышей инкубировали до стадии нервных валиков (ст.15), фиксировали и анализировали экспрессию генов Otx2 и Pax6 методом гибридизации in situ. Остальные зародыши инкубировали до стадии головастика (ст.45), когда основные органы уже сформированы, и анализировали морфологические изменения.

Области экспрессии генов Otx2 (А1) и Pax6 (А2) в нормальных, неиъецированных зародышах (ст.15). Анализ областей экспрессии исследуемых генов проводили с помощью метода гибридизации in situ. Для контроля распределения материала микроинъекции в тканях зародыша использовали флуоресцентный краситель FLD (Б1`-Д1`, Б2`-Д2`). Пунктирной линией черного цвета обозначены границы нервной пластинки, красного цвета - передний край нервной пластинки, желтого цвета - границы зоны экспрессии гена Xanf1. «Пробел» в зонах экспрессии исследуемых генов в передней части нервной пластинки обозначен звездочкой.

Рис. 9. Колокализация зиксина и Xanf1 в клетках CV-1. Микрофотографии клеток CV-1, синтезирующих myc-Xanf1 (А), EGFP-Zyxin (Б) и myc-Xanf1 совместно с EGFP-Zyxin (В, Г). Масштаб 10 мкм.

Контрольный неинъецированный зародыш, ст.45, головной отдел, вид с дорсальной стороны (А). В результате микроинъекций синтетической мРНК, кодирующей зиксин (В) или мутант зиксина, содержащий NLS (Г), наблюдается весь спектр аномалий развития, характерных для случаев нарушения трансляции мРНК Xanf1, вызванных микроинъекцией соответствующих морфолино олигонуклеотидов (Б): редукция переднего мозга, циклопия. Микроинъекции мРНК, кодирующей доминантно-репрессорную форму зиксина (EnR-зиксин-NLS), наоборот приводят к увеличению размеров переднего мозга (Д). Стрелка указывает на ту половину зародыша, в которую попал материал микроиъекции. Распределение материала микроинъекции в тканях зародыша контролировали с помощью флуоресцентного красителя FLD (В`-Д`).

В результате было обнаружено, что сверхэкспрессия гена зиксина приводит к расширению зоны экспрессии генов Otx2 и Pax6 в передней части нервной пластинки у 64 и 73% зародышей на стадии средней нейрулы (всего было проанализировано 14 и 15 зародышей, соответственно, в двух экспериментах) так, что у некоторых из этих зародышей ростральный “пробел” в экспрессии Otx2 и Pax6, в норме вызываемый активностью Xanf1, совершенно закрывался (Рис. 9В1 и B2). У инъецированных зародышей на более поздних стадиях развития наблюдался комплекс морфологических аномалий, который возникает при нарушении экспрессии гена Xanf1 в результате микроинъекции соответствующих анти-смысловых МО: редукция головного отдела зародыша (нарушение развития жаберного аппарата и головных хрящей), нарушение структуры глаза или циклопия, уменьшение размеров и слияние обонятельных ямок, редукция конечного и промежуточного мозга (81% зародышей, всего было проанализировано 21 зародыш в двух экспериментах) (Рис. 10В). Полученные данные указывают на то, что искусственно усиленный синтез белка зиксина приводит к подавлению репрессорной активности Xanf1.

Чтобы еще больше усилить влияние зиксина на работу Xanf1, мы использовали мутант зиксина, содержащий сигнал ядерной локализации (nuclear localization signal, NLS: RKKRK) вместо NES (зиксин-NLS). Благодаря такой замене сигнальных последовательностей мутант зиксина накапливается в ядрах клеток и, как следствие, с большей вероятностью взаимодействует с Xanf1 по сравнению с зиксином дикого типа, который преимущественно локализован в цитоплазме.

Рис. 10. Морфологические аномалии в зародышах шпорцевой лягушки, вызываемые нарушением нормальной работы гена зиксина и его продукта.

Инъецирование в зародыши мРНК, кодирующей зиксин-NLS, оказывает такой же по силе эффект, как и закол МО, специфичных к мРНК Xanf1, на экспрессию генов Otx2 (Рис.9Г1) и Pax6 (Рис.9Г2) и вцелом на нормальное развитие зародышей шпорцевой лягушки (Рис.10Г). Эктопическая экспрессия генов Otx2 и Pax6 в зачатке переднего мозга зародышей на 15 стадии наблюдалась, соответственно, в 88 и 89% зародышей, всего было проанализировано 16 и 18 зародышей, соответственно, в двух экспериментах. Редукция переднего мозга и циклопия развивались у 96% зародышей, доживших до стадии головастика (ст.45), всего было проанализировано 25 зародышей.

Для подтверждения ингибирующего влияния зиксина на транскрипционную активность Xanf1 нами была создана генетическая конструкция, кодирующая гибрид: 1) N-концевого фрагмента транскрипционного фактора Drosophila Engrailed (EnR, 1-288 а.о), содержащего репрессорный домен (228-282 а.о.) (Han and Manley, 1993), 2) NLS и 3) трех LIM-доменов зиксина. Синтетическая мРНК, синтезированная на основе полученной конструкции, была микроинъецирована в зародыши шпорцевой лягушки. Анализ инъецированных зародышей на стадии нервных валиков с помощью гибридизации in situ показал, что синтез доминантно-репрессорного гибрида EnR-зиксин-NLS приводит к незначительному расширению «пробела» в передней части нервной пластинки в зонах экспрессии генов Otx2 (Рис.9Д1) и Pax6 (Рис.9Д2) у 69 и 79% зародышей, соответственно (всего 16 и 19 зародышей в двух экспериментах). В ходе дальнейшего развития у 80% инъецированных зародышей (всего 15 зародышей в двух экспериментах) наблюдалось увеличение размера переднего мозга (Рис.10Д), как и в случае сверхэкспрессии гена Xanf1 (Ermakova et al., 1999). Полученные данные свидетельствуют о том, что ингибирующее влияние зиксина на транскрипционную активность Xanf1 полностью исчезает в случае функционирования зиксина в качестве транскрипционного репрессора.

Перечисленные факты подтверждают способность зиксина подавлять репрессорную активность одного из важных регуляторов эмбриогенеза - гомеодоменного белка Xanf1 в клетках зачатка переднего мозга зародышей шпорцевой лягушки X. laevis, из которого впоследствии формируются такие отделы головного мозга, как промежуточный мозг и конечный мозг, отвечающий за высшие формы нервной деятельности. Подобное влияние цитоскелетного белка зиксина на работу транскрипционных факторов в ходе раннего развития представителя позвоночных животных - шпорцевой лягушки было показано впервые. Исходя из этого, а также учитывая литературные данные о функции зиксина как регулятора динамики актинового цитоскелета, логично предположить, что в нормальном развитии зиксин может участвовать в передаче информации о состоянии клеточных контактов в ядро, осуществляя таким образом координацию морфогенеза зачатка переднего мозга с экспрессией генов в слагающих его клетках.

Поиск белков, способных взаимодействовать с зиксином в ходе раннего развития шпорцевой лягушки

Полученные данные о возможности физического взаимодействия зиксина с гомеодоменным фактором Xanf1 и его влиянии на транскрипционную функцию последнего позволяют предположить, что в эмбриональном развитии зиксин способен также взаимодействовать и с другими важными белками-регуляторами раннего развития. Очевидно, что поиск таких белков мог бы стать одним из перспективных подходов к выяснению механизмов координации морфогенетических движений и дифференцировки клеток в эмбриональном развитии.

В рамках настоящей работы нами был проведен поиск возможных новых белковых партнеров зиксина в клетках эмбриона шпорцевой лягушки с помощью дрожжевой двугибридной LexA-системы. В качестве целевой последовательности в векторе pMW103 (bait-вектор) был использован фрагмент кДНК, кодирующий три LIM-домена (455-664 а.о.) белка зиксина из Xеnopus laevis. Скрининг кДНК-библиотеки из зародышей шпорцевой лягушки на стадии поздней гаструлы - ранней нейрулы в векторе pB42AD (prey-вектор) был проведен согласно рекомендациям производителя (CLONTECH), также как и в случае поиска белковых партнеров Xanf1. В результате было выявлено 104 положительных клона, из которых 39 клонов оказались действительно положительными после проверки подлинности белок - белковых взаимодействий.

Секвенирование вставок кДНК, содержащихся в плазмидах, выделенных из найденных клонов, с последующим анализом полученных последовательностей с помощью пакета программ BLAST показало, что они кодируют 12 различных белков. Среди найденных белков оказались три белка, участвующих в сигнальном каскаде, запускаемом секреторными белками семейства Hedgehog (Hh): Patched2 (Ptc2) (GenBank AB037688), Gli1 (GenBank Q91690) и Zic1 (GenBank AAC14214), также известный как Zic-related-1 (Mizuseki et al., 1998). Данный сигнальный каскад регулирует клеточную дифференцировку в эмбриогенезе и онтогенезе как у беспозвоночных, так и у позвоночных животных (Ekker et al., 1995a; Ekker et al., 1995b). В частности, Hh-сигнализация необходима для формирования нормальной дорсо-вентральной разметки нервной трубки и сомитов. Нарушение передачи Hh-сигнала в ходе эмбриогенеза ведет к порокам развития, а в онтогенезе служит причиной развития раковых заболеваний, например, базально-клеточной карциномы и глиобластомы.

Белок Ptc2, содержащий 12 трансмембранных доменов, непосредственно связывает Hh-белки, таким образом, отвечает за первичное восприятие сигнала на клеточной поверхности. Транскрипционный фактор Gli1 относится к семейству Gli белков (Gli1, Gli2, Gli3), которые регулируют экспрессию геномных мишеней Hh-каскада (Johnson and Scott, 1998; Stone et al., 1999). При этом Gli1 в отличие Gli2 и Gli3 не подвергается протеолитическому расщеплению с образованием репрессорной формы, и поэтому всегда выполняет функцию активатора транскрипции (Dai et al., 1999; Ruiz i Altaba, 1998; Sasaki et al., 1997; Sasaki et al., 1999; Wang et al., 2000). Транскрипционный фактор Zic1 способен связываться с Gli белками, модулируя их внутриклеточную локализацию и транскрипционную активность (Koyabu et al., 2001; Nguyen et al., 2005; Ruiz i Altaba, 1999).

Найденное взаимодействие зиксина с компонентами Hh-каскада может быть одним из способов регуляции данного каскада, поэтому представляет особый интерес для дальнейшего изучения.

Зиксин связывается с белками Ptc2, Zic1 и Gli1 in vivo

Для подтверждения найденного с помощью дрожжевой двугибридной системы взаимодействия зиксина с белками Ptc2, Zic1 и Gli1, мы проверили, сохраняется ли данное взаимодействие в клетках развивающихся эмбрионов Xеnopus laevis с помощью метода ко-иммунопреципитации. Также мы посмотрели, связывается ли зиксин с другими Gli белками на примере Gli3. Для этого мы инъецировали в зародыши лягушки на стадии 2-4 бластомеров мРНК, кодирующую С-концевой участок зиксина (373 - 664 а.о.), меченный FLAG-эпитопом (FLAG-С`-Zyxin), совместно с мРНК, кодирующей С-концевой участок Ptc2 (1159 - 1413 а.о.), или полноразмерные белки Zic1, Gli1, или Gli3, меченные шестью myc-эпитопами (myc-С`-Ptc2, myc-Zic1, myc-Gli1 и myc-Gli3, соответственно). Затем зародыши инкубировали до стадии ранней нейрулы (14-15 стадия) и лизировали. Комплексы гибридных белков осаждали из лизата зародышей с использованием анти-FLAG антител, ковалентно пришитых на агарозный носитель (Red ANTI-FLAG M2 Agarose Affinity Gel (Sigma), затем специфически элюировали 3хFLAG-пептидом и анализировали при помощи иммуноблота с анти-myc антителами, конъюгированными со щелочной фосфатазой. Во всех случаях, кроме связывания фрагмента зиксина с Gli3 (Рис.11, дорожка 12), на иммуноблоте был детектирован четкий сигнал (Рис.11, дорожка 2,6,10), что свидетельствует о взаимодействии зиксина с Ptc2, Gli1 и Zic1 в клетках зародышей.

Рис.11. Анализ взаимодействия зиксина с участниками Hh-каскада методом ко-иммунопреципитации (Ко-ИП).

Результаты иммуноблота белковых комплексов, осажденных при помощи анти-FLAG антител (дорожки 2, 6, 10, 12) из лизатов зародышей после микроинъекции мРНК FLAG-C`Zyxin совместно с мРНК, кодирующей myc-C`Ptc2 (дорожки 1-2), или myc-Zic1 (дорожки 5-6), или myc-Gli1 (дорожки 9-10), или myc-Gli3 (дорожки 11-12). Для детекции уровня синтеза белков использовали исходные лизаты зародышей (дорожки 3-4, 7-8 и 13-16).

На основе полученных в данной работе результатов можно предположить, что существует универсальный механизм координации клеточной подвижности и дифференцировки, в котором ключевую роль играют цитоскелетные белки, такие как зиксин, которые, с одной стороны, обеспечивают клеточную подвижность, а с другой - взаимодействуют с ключевыми регуляторами клеточной дифференцировки и корректируют их активность в ответ на изменения состояния цитоскелета клеток, возникающее в ходе морфогенетических движений.