Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из тканей млекопитающих

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из тканей млекопитающих

03.00.02 биофизика

03.00.23 биотехнология

Москва 2007

Введение

Актуальность темы

В последние годы наблюдается возрастающий интерес исследователей к действию сверхмалых доз (СМД) биологически активных веществ.

Опубликованы данные для разнообразных групп биологически активных веществ (гормонов, эндогенных регуляторных пептидов, ряд веществ не пептидной природы и др.). Исследование влияния СМД представляет интерес, так как может привести к созданию новых лекарственных веществ или к выявлению новых существенно важных свойств уже известных. Наблюдаемые эффекты возможно объяснить при помощи различных гипотез: концентрирование лекарственного вещества, наличие высокоэффективных систем проведения и усиления рецепторного сигнала, "адаптации" рецепторов к действию СМД [Сазанов, Зайцев, 1992; Бурлакова и др., 2004], существованием супервысокоаффинных рецепторов и др. [Бурлакова и др., 1990]. Но неоспоримым является факт достоверного воздействия СМД на биологический объект, которые могут совпадать или не совпадать с действием больших доз. Для многих веществ было показано, что эффекты сверхмалых доз примерно совпадают по силе и величине с наблюдаемыми при действии больших доз [Sergeeva et al., 1996].

Благодаря разработке методов выделения и биотестирования удалось выделить и охарактеризовать ранее не идентифицированные регуляторные факторы, белковой природы, проявляющие биологическую активность в СМД [Ямскова и др., 1978; Ямскова, Резникова, 1991]. Действие регуляторных белков (РБ) данной группы в СМД реализуется в рамках концепции, в основе которой лежат представления о нарушениях регуляции органно-тканевого гомеостаза как первопричины развития любой патологии и об изменении состояния воды в биологических жидкостях под действием РБ в СМД, причем вода является матрицей для переноса регуляторного сигнала [Ямскова и др., 1998; Ямсков и др., 1999, Бурлакова и др., 2004].

Цель и задачи исследования. Исследование мембранотропной, специфической биологической активности регуляторных белков, действующих в сверхмалых дозах, а также некоторых физико-химических свойств.

В отдельные задачи входили:

1. Выделение регуляторных белков из печени, легкого, тонкого кишечника, желчи млекопитающих и получение их в высокоочищенном состоянии.

2. Изучение дозовой зависимости мембранотропной активности регуляторных белков.

3. Изучение физико-химических свойств регуляторных белков.

4. Изучение локализации регуляторных белков в ткани печени позвоночных животных.

5. Разработка новой экспериментальной модели роллерного органного культивирования ткани печени тритона in vitro для исследования специфической биологической активности регуляторных белков, выделенных из печени, сыворотки крови и желчи млекопитающих.

6. Изучение биологического действия регуляторных белков, выделенных из печени, желчи и сыворотки крови млекопитающих на органной культуре печени тритона in vitro.

Впервые в тканях печени, легкого, тонкого кишечника и желчи млекопитающих, были идентифицированы РБ, действующие в СМД. Было показано, что в тканях РБ присутствуют в виде нескольких фракций, преобладающими из которых являются фракции кислых и основных белков. Изучение физико-химических свойств данных РБ показало, что они представляют собой низкомолекулярные белки, во вторичной структуре которых преобладают Я-структуры и статистический клубок. Показано, что в водных растворах РБ ассоциированы и присутствуют в виде наноразмерных частиц. По физико-химическим свойствам данные белки сходны с РБ, которые были ранее идентифицированы в других тканях млекопитающих. Для РБ печени и сыворотки крови была изучена их локализация в ткани печени позвоночных животных и показано, что оба белка являются внеклеточными. Впервые была разработана модель роллерного органного культивирования ткани печени тритона, на которой было изучено специфическое действие РБ, выделенных из ткани печени, сыворотки крови и желчи. Установлено, что только РБ печени и сыворотки крови проявляют специфическое действие на состояние печени тритона при культивировании: РБ печени стимулирует клетки макрофагального ряда, а РБ сыворотки стимулирует клетки кроветворного ряда. В отдельном эксперименте была продемонстрирована способность РБ желчи уменьшать размеры частиц желчи человека in vitro. Таким образом, благодаря применению различных экспериментальных моделей для изучения специфической активности РБ, выделенных из различных источников, было установлено, что их биологическое действие различается, несмотря на проявление ими сходных физико-химических свойств и мембранотропной активности в СМД.

Практическая значимость

В данной работе впервые показано специфическое действие в СМД РБ, выделенных из печени, сыворотки крови и желчи. Полученные данные позволяют поставить вопрос о разработке новых фармакологических препаратов на основе данных РБ. Результаты проведенного исследования указывают на проявление РБ печени гепатопротекторных свойств, а также на возможность применения РБ сыворотки крови для лечения некоторых гематопатологий, а РБ желчи - для лечения и профилактики желчекаменной болезни. Разработанная роллерная органная культура ткани печени тритона может быть рекомендована в качестве модели для первичного скрининга веществ, для которых предполагается проявление гепатопротекторных свойств. В отдельной серии экспериментов была продемонстрирована выраженная лечебно-профилактическая активность РБ тонкого кишечника на развитие инфекции, вызванной высокопатогенным штаммом вируса гриппа птиц A/H5N1. В этом же опыте была показана профилактическая активность РБ сыворотки крови.

Апробация результатов исследования

Материалы диссертации доложены: на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Москва, 8 декабря, 2004; на V Всероссийском научном семинаре и молодежной научной школе «Химия и медицина» Уфа, 5-8 сентября, 2005; на конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» 17-18 ноября, 2005, Москва; на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Москва, 21 декабря, 2005; на V ежегодной Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, 14-16 декабря, 2005; на IV Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 3-7 июля, 2006.

Структура и объем диссертации

Введение, в котором рассмотрены актуальность, новизна, практическая значимость работы.

Обзор литературы, в котором рассмотрены общие положения клеточной адгезии, компоненты внеклеточного матрикса, а также белки участвующих в адгезии по типу "клетка-клетка". Рассмотрена пространственная организация межклеточного пространства в печени млекопитающих. Охарактеризованы известные до настоящей работы РБ, биологически активные в СМД, а также адгезиометрические методы исследования РБ из ткани печени.

Экспериментальная часть, посвящена описанию материалов и основных методов, с помощью которых было проведено данное исследование.

Результаты и их обсуждение, глава, в которой представлены результаты, полученные при идентификации РБ в печени, легком, тонком кишечнике и желчи, а также при исследовании их физико-химических свойств и изучения мембранотропной и специфической активности, проявляемой в СМД.

Заключение - раздел, который также входит в данную главу в котором представлены предположения о возможном механизме биологического действия изучаемых РБ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

1. Результаты и их обсуждение

Выделение и очистка регуляторных белков печени, легкого, тонкого кишечника крыс Wistar, а также желчи КРС

РБ выделяли из ткани печени, легкого, тонкого кишечника, а также из желчи, по методике, разработанной для РБ данной группы, которая исключает механическую и ферментативную обработку ткани и способствует переходу в экстракт секретируемых белков [Ямскова и др., 1977; Ямсков и др., 1999]. После высаливания основной массы белков из экстрактов РБ остаются в растворенном состоянии. Полученные супернатанты подвергали фракционированию с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ). В процессе очистки фракции, содержащие РБ, идентифицировали с помощью метода биотестирования, специально разработанного ранее для определения биологически активных в СМД РБ [Ямскова, Резникова, 1991].

Изучение мембранотропной активности фракций регуляторных белков, выделенных из печени, легкого, тонкого кишечника и желчи млекопитающих

Во всех изучаемых тканевы экстрактах, а также в желчи, были обнаружены фракции кислых и основных РБ. Следует отметить, что кислые белки всегда были представлены в больших количествах в сравнении с другими фракциями РБ. На рис. 1 в качестве примера приведена картина разделения супернатанта печени крыс с помощью ИЭФ.

В таблице 1 представлены данные биотестирования фракций кислых РБ, которые показывают, что идентифицированные РБ проявляют мембранотропную активность в концентрациях, соответствующих 10^-12-10^-16 мг белка в мл, аналогичные данные были получены для основных РБ.

Биотестирование РБ показало, что мембранотропный эффект имеет полимодальную дозовую зависимость, а проявление биологической активности наблюдается как в области низких, так и в области сверхнизких концентраций.

Рис.1. Изоэлектрофокусирование супернатанта печени крыс Wistar. По ординате 1 - значения рН, соответствующие номерам фракций. По ординате 2-значения оптической плотности соответствующих фракций при длине волны 280 нм; по абсциссе - номера фракций.

Таблица 1. Биотестирование кислых и основных фракций супернатантов содержащих регуляторные белки

Таблица 2. Характеристики ИЭФ-фракций супернатанта печени, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах*

*- данные приводятся для тканевого экстракта, полученного из 230 г влажного веса ткани.

Как видно из таблицы 2, в тканевом экстракте печени кроме кислых и основных РБ присутствуют еще два РБ, проявляющих мембранотропную активность в СМД. Можно предположить, что РБ со значением изоэлектрической точки в интервале рН 4.5-5.1, представляет собой РБ, ранее обнаруженный в сыворотках крови позвоночных животных, который характеризовался отсутствием тканевой специфичности мембранотропного действия (т.е. изменял свойства плазматической мембраны как клеток печени, так и клеток легкого in vitro) [Ямскова, Резникова, 1991; Ямсков и др., 2001].

Возможно, что данный РБ синтезируется клетками печени, как и многие белки сыворотки крови [Энгельгардт, 1984]. Для изучения этого вопроса был поставлен отдельный эксперимент, в котором было проведено сравнительное исследование фракций РБ, собранных в интервале рН 4.5-5.1 после ИЭФ, как тканевых экстрактов печени и легкого крыс, так и их супернатантов (таб. 3). Для изучения тканевой специфичности мембранотропного действия фракций, собранных в интервале рН 4.5-5.1, применяли метод биотестирования на органных культурах ткани печени и легкого мышей.

Таблица 3. Сравнительное исследование фракций регуляторных белков выделенных из печени и легкого, собранных в области рН 4,5-5,1

Было установлено, что фракции РБ, выделенные из тканевого экстракта печени и его супернатанта, в СМД проявляли мембранотропное действие, как на клетки печени, так и на клетки легкого in vitro, т.е. характеризовались отсутствием тканевой специфичности биологического действия. Фракция РБ, собранная в интервале рН 4.5-5.1, после изоэлектрофокусирования, как тканевого экстракта легкого, так и его супернатанта, была биологически неактивна. Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют в пользу высказанного предположения о том, что в печени позвоночных животных синтезируется РБ сыворотки крови. Эти данные нашли подтверждение в иммуногистохимическом исследовании локализации в ткани печени РБ сыворотки крови.

Фракция в области рН 6.7-7.2, возможно, представляет собой ранее изученный РБ печени, биологически активный в СМД, который характеризовался значением изоэлектрической точки в интервале рН 6.7-7.2, а также отсутствием резистентности к воздействию различных физико-химических факторов (температура, воздействие деионизованной среды, хелатирующих агентов) [Ямскова и др., 1977а; Ямскова, 1978; Ямскова и др.,1978].

Таким образом, в настоящем исследовании были обнаружены ранее не идентифицированные фракции кислых и основных РБ, выделенные из печени, легкого, тонкого кишечника и желчи млекопитающих.

Изучение физико-химических свойств фракций, содержащих регуляторные белки, выделенных из печени, легкого, тонкого кишечника и желчи млекопитающих

Изучение физико-химических свойств РБ проводили на фракциях, полученных после ИЭФ супернатантов тканевых экстрактов.

Методом электрофореза в ПААГ было показано, что основным компонентом изучаемых фракций РБ является низкомолекулярный белок.

На рис. 3 показано разделение кислых и основных РБ при электрофорезе в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия.

После электрофореза в ПААГ в отсутствии додецилсульфата натрия, было проведено элюирование из геля фракций, характеризующихся высокой электрофоретической подвижностью (Rf 0.90±0.05). Методом биотестирования было установлено, что данные низкомолекулярные РБ проявляли мембранотропную активность в СМД.

Рис. 3. Разделение фракции кислых белков, полученной после изоэлектрофокусирования супернатантов, в 12% ПААГ с добавлением додецилсульфата натрия. Окраска Кумасси G250. На рисунке: маркеры, 1- кислый РБ печени; 2- кислый РБ легкого; 3- кислый РБ тонкого кишечника; 4- кислый РБ желчи.

При обращено-фазовой ВЭЖХ в градиенте вода-ацетонитрил фракции РБ были разделены на две фракции гидрофильную и гидрофобную, соответственно, характеризующиеся временами удержания 3.0-4.0 и 13.0-15.0 мин. На рис. 4 в качестве примера представлена картина разделения кислой фракции РБ легкого.

Рис. 4. Разделение кислой фракции регуляторных белков легкого методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. По оси абсцисс - время удержания, мин; по оси ординат интенсивность поглощения при 280 нм, отн. ед.

Было показано, что обе фракции проявляют мембранотропную активность в СМД. Возможно, данные фракции представлены различающимися между собой белками. Однако не исключено, что гидрофильная и гидрофобная фракции представляют собой, соответственно, высокомолекулярные ассоциаты и низкомолекулярную фракции РБ. В пользу этого предположения свидетельствуют ранее полученные данные о проявлении молекулами РБ выраженной тенденции к агрегации [Ямскова, Резникова, 1991].

Методами лазерного динамического светорассеяния и атомно-силовой микроскопии были изучены водные растворы фракций кислых РБ и показано, что в них присутствуют наноразмерные частицы.

Результаты исследования, проведенные методом динамического рассеяния, показали, что распределение частиц во всех кислых фракциях РБ было унимодальным, средний гидродинамический радиус частиц составлял 40-60 нм. На рис. 5 представлена кривая распределения по размеру гидродинамического радиуса частиц, присутствующих во фракции РБ печени.

Рис. 5. Кривая распределения частиц регуляторного белка, выделенного из печени, по гидродинамическому радиусу (метод лазерного динамического светорассеяния).

Следует отметить, что в сравнении с другими белками, например, с белками плазмы крови, а также полисахаридами, которые отличались друг от друга по составу, структуре и молекулярной массе [Armstrong, 2004], РБ имеют большое значение гидродинамического радиуса. Одним из объяснений этого экспериментально установленного факта может быть выраженная тенденция низкомолекулярных РБ образовывать в водных растворах высокомолекулярные ассоциаты.

Результаты исследования водных растворов РБ, проведенного динамическим лазерным светорассеянием, согласуются с данными, полученными методом атомно-силовой микроскопии. Этим методом показано, что на подложке после удаления растворителя из фракции РБ обнаруживаются частицы, размером 30-100 нм (рис. 6).

Таблица 4. Исследование вторичной структуры кислых регуляторных белков методом кругового дихроизма.

Рис. 7. Локализация регуляторного белка печени в ткани печени крысы. (ув. ок. х10, об. х40; зона локализации показана стрелкой).

Рис. 8. Локализация регуляторного белка сыворотки крови в ткани печени тритона. (ув. ок. х10, об. х40; зона локализации показана стрелкой).

2. Разработка модели для изучения специфического действия регуляторных белков

Для изучения специфического действия РБ была разработана модель культивирования in vitro ткани печени тритона Pl. waltl. Ткани хвостатых амфибий проявляют большую способность к регенерации, по сравнению с млекопитающими [Stocum, 1995]. При органном культивировании клетки печени взрослых особей амфибий обладают существенно большей жизнеспособностью, по сравнению с клетками печени взрослых млекопитающих [Trowell, 1959; Campbell, Hales, 1971]. Ранее было показано, что органные культуры печени взрослых амфибий можно поддерживать в течение длительного времени [Monnickendam, 1972, 1973 a, b]. При роллерном типе культивирования тканей амфибий происходит активация клеточных источников регенерации и культура ткани остается жизнеспособной в течение длительного времени [Григорян и др., 2005]. Поэтому было проведено сравнение двух моделей культивирования: роллерная модель и культивирование ткани печени на подложке.

Основное отличие функции печени хвостатых амфибий от млекопитающих заключается в сохранении у них кроветворения во всем постнатальном периоде и присутствии пигментных клеток, которые способны синтезировать меланины и располагаются как в кортикальном слое, так и в паренхиме печени. Согласно литературным данным распределение пигмента в этих клетках печени сезонно изменяется: оно значительно уменьшается ко второй половине зимы и увеличивается весной и летом [Воронцова и др., 1952]. Установлено, что пигментированные клетки печени амфибий являются аналогами купферовских клеток печени млекопитающих и функционируют как макрофаги, поглощая различные частицы, например, микроорганизмы, вирусы, а также осуществляют детоксикацию различных ксенобиотиков [Sichel et al., 2002]. Эти клетки происходят из гемопоэтических стволовых клеток [Sichel et al., 1997], отличаются от других фагоцитов позвоночных тем, что способны синтезировать меланин в меланосомах, но, в то же время, они не являются меланоцитами, происходящими из клеток нервного гребня [Sichel et al., 2002].

Для оценки состояния ткани определяли следующие параметры: площадь кластеров пигментированных клеток и количество митозов в клетках кортикальной области. Согласно данным литературы, эти параметры отражают способность ткани печени амфибий реагировать на повреждающие воздействия [Frangioni et al., 2003].

Как показывают результаты этих экспериментальных серий, представленные в табл. 5, роллерный способ культивирования ткани печени тритона способствует увеличению площади кластеров пигментированных клеток, по сравнению с тканью печени, культивированной на подложке, а также по сравнению с интактной тканью (р<0.05).

Таблица 5. Оценка состояния интактной ткани печени тритона, а также после органного культивирования

Таблица 6. Влияние кислых регуляторных белков на органные культуры печени тритона in vitro при различных условиях культивирования