Молекулярно-генетичний поліморфізм сортів пшениці м'якої озимої та асоціації алелів мікросателітних локусів і господарсько цінних ознак

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Одним із найважливіших завдань молекулярної генетики є дослідження геному, організації та мінливості ДНК. ДНК-технології суттєво змінили сучасне рослинництво, де прогрес в селекції залежить від різноманітності вихідного матеріалу, а також від ефективності моніторингу дослідженості геномів рослин (Сиволап, 2011). Стрімкий розвиток молекулярної генетики відкриває широкі можливості використання ДНК-маркерів при оцінці генетичної мінливості, диференціації й ідентифікації нових сортів пшениці м'якої озимої. Молекулярні ДНК-маркери, що асоціативно пов'язані з генами, які відповідають за господарсько цінні ознаки сортів пшениці, дозволяють достовірно проводити добір на рівні індивідуальної рослини або селекційних ліній (Mir et al., 2012; Chang et al., 2013; Zanke et al., 2014). Таким чином, зростає роль ДНК-технологій в прискоренні процесу селекції (Matthies et al., 2014).

Пшениця м'яка озима - одна з основних продовольчих культур у світі. Сорти пшениці є об'єктом особливої форми інтелектуальної власності, авторські права на них охороняються відповідними міжнародними угодами і законодавчими актами держави, оскільки кожен з них характеризується унікальним сполученням алелів агрономічно важливих ознак. Диференціація, ідентифікація та реєстрація сортів за допомогою мікросателітного (МС) аналізу набуває особливої актуальності після вступу України до Світової Організації Торгівлі (СОТ), де однією з умов реєстрації сортів є їх однорідність. Якраз генетична неоднорідність, яка суперечить міжнародним вимогам, є одним з головних факторів, що стримують або ж блокують реєстрацію українських сортів та гібридів за кордоном.

До поширення в Україні допускаються сорти, які пройшли державну кваліфікаційну експертизу, придатні для надання прав на них як на об'єкт інтелектуальної власності та задовольняють потреби споживача. Декілька років поспіль аспекти використання молекулярних маркерів у системі диференціації та ідентифікації нових сортів рослин обговорюються в UPOV (Міжнародна організація із захисту прав на нові сорти рослин). Головними критеріями добору молекулярних методів для диференціації сортів є: відтворюваність даних ДНК-профілювання між лабораторіями, повторюваність у часі, дискримінаційна здатність, можливості для створення бази даних, розробленість методології. За цими критеріями серед інших показана доречність використання МС-аналізу, який більш ніж 15 років широко застосовується в селекції рослин і геномних дослідженнях, є основою картування генів і локусів якісних ознак, визначення філогенетичних зв'язків.

Світова практика показала, що максимальний врожай і контрольовану якість зерна можливо отримати від гомогенних «спеціалізованих» сортів-ліній, які адаптовані до відносно вузьких географічно-кліматичних зон. Таким чином, диференціація та ідентифікація сортів пшениці за МС-аналізом є актуальним дослідженням, спрямованим на досягнення нового рівня правового захисту інтелектуальної власності на сорти рослин, що сприяло б виходу українського насіння на зарубіжні ринки, знизило б ризики недобросовісної конкуренції та «запозичень» створених у нас об'єктів інтелектуальної власності. Крім того, впровадження методів молекулярної генетики, зокрема - МС-аналізу, значно додало б інформативності існуючим технологіям диференціації й ідентифікації сортів сільськогосподарських культур. Взагалі давно назріває потреба більш широкого залучення сучасних біотехнологічних методів та прийомів не тільки для контролю вихідного етапу селекції, а і до самого процесу створення нових сортів.

За МС-маркерами встановлюється не тільки однорідність сорту, але й алельний стан окремих агрономічно важливих генів. Виявлення асоціацій алелів МС-локусів і господарсько цінних ознак пшениці в умовах Півдня України здійснюється з метою підвищення продуктивності та якості зерна пшениці м'якої. Такі дослідження до теперішнього часу проводили переважно на наборах ліній та сортів в Великобританії, Сербії, Китаї, Німеччині, тому пошук асоціацій алелів МС-локусів з господарсько цінними ознаками у генотипів, адаптованих до місцевих умов вирощування, є актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження за темою дисертації виконували у відділі загальної та молекулярної генетики СГІ - НЦНС (до квітня 2012 р. - відділ молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру в рослинництві НААН) протягом 2009-2014 років в межах НТП УААН «Сільськогосподарська біотехнологія» 2006-2010 рр. за завданням 01.19. «ДНК-типування сортів пшениці за мікросателітними локусами» (№ державної реєстрації 0106U002664); в межах ПНД НААН «Сільськогосподарська біотехнологія» 2011-2015 рр., підпрограма 1. «Поліпшення генотипів рослин з використанням досягнень сучасної біотехнології» за завданням 23.01.01.03.Ф «ДНК-технології ідентифікації сортів, ліній, гібридів сільськогосподарських культур, розробка молекулярно-генетичних паспортів та поповнення бази даних ДНК-типування» (№ державної реєстрації 0111U006104).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - дослідити молекулярно-генетичний поліморфізм сучасних сортів пшениці м'якої озимої та асоціації алелів МС-локусів і господарсько цінних ознак.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

– диференціювати та ідентифікувати сучасні сорти пшениці селекції СГІ - НЦНС за алельним складом МС-локусів;

– дослідити внутрішньосортову гетерогенність сучасних сортів пшениці озимої м'якої;

– проаналізувати розподіл частот алелів МС-локусів у сучасних сортів пшениці м'якої озимої;

– кластеризувати та здійснити паспортизацію сучасних сортів пшениці м'якої озимої за даними МС-аналізу;

– провести моделювання мінімально необхідної системи МС-маркерів для забезпечення однозначної диференціації та ідентифікації сортів пшениці;

– виявити асоціації алельного складу МС-локусів і господарсько цінних ознак пшениці м'якої озимої в умовах Півдня України.

Об'єкт дослідження: молекулярно-генетичний поліморфізм сортів пшениці м'якої озимої.

Предмет дослідження: алелі МС-локусів сортів пшениці м'якої озимої та їх асоціації з господарсько цінними ознаками пшениці.

Методи дослідження: молекулярно-генетичні методи (екстракція та очищення ДНК, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), електрофорез продуктів ампліфікації) використовували для дослідження поліморфізму ізольованої ДНК; морфометричні (визначення морфологічних характеристик зерна та маси 1000 зерен) та колориметричні методи (визначення забарвлення зерна) застосовували для отримання характеристики зернівок сортів пшениці за їх цифровими зображеннями; фенологічні спостереження за датою колосіння та аналіз ознаки «висота рослин»; візуальні оцінки кольору та довжини колоса; статистичні методи (визначення індексу поліморфності, частот алелів МС-локусів, кластерний аналіз, побудова дендрограм, Мантель тест, дисперсійний аналіз) використовували для виявлення статистичної значимості отриманих даних і для визначення ступеню подібності дендрограм, побудованих за алельним складом МС-локусів та низкою господарсько цінних ознак сортів пшениці; групи сортів, складені за наявністю певного алеля визначеної молекулярної маси, порівнювали між собою, а значення відмінностей між групами оцінювали за допомогою параметричного критерію Ст'юдента (t-критерій).

Наукова новизна одержаних результатів. Досліджене алельне різноманіття за МС-локусами на виборці сучасних сортів Півдня України. Визначені молекулярно-генетичні характеристики, диференційовані та ідентифіковані сучасні сорти пшениці селекції СГІ - НЦНС 2003 - 2013 років реєстрації за алельним складом МС-локусів. Досліджена внутрішньосортова гетерогенність та розподіл частот алелів МС-локусів, проведена паспортизація сучасних сортів пшениці м'якої озимої за даними алельного складу МС-локусів. Виявлені асоціації алельного складу МС-локусів і господарсько цінних ознак у генотипів сортів, адаптованих до умов вирощування Півдня України. Здійснене моделювання мінімально необхідної системи МС-маркерів для забезпечення однозначної диференціації та ідентифікації сортів пшениці із спільним походженням з одного селекційного центру.

Практичне значення отриманих результатів полягає у встановленні асоціацій алельного стану МС-локусів і господарсько цінних ознак пшениці, що надає можливість рекомендувати певні МС-маркери для використання в селекції. Створені у дисертаційній роботі мінімально необхідні робочі набори МС-маркерів, що близькі за диференційною здатністю та складаються з шести - восьми МС-локусів, рекомендовано використовувати для проведення однозначної диференціації та ідентифікації сортів із спільним походженням з одного селекційного центру. Практичне значення роботи полягає у використанні отриманих результатів і розроблених методичних підходів для досліджень в галузі молекулярної генетики та селекції пшениці.

Апробація результатів дослідження. Основні результати роботи були представлені на Міжнародних конференціях: «Фундаментальні та прикладні проблеми біології» (Україна, Донецьк, 2009, 2011); «Молодь і поступ біології» (Україна, Львів, 2009, 2011, 2012, 2015); «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution» (Україна, Одеса, 2009, 2011); «Сучасна біотехнологія сільськогосподарських рослин та біобезпека (Геном рослин VI)» (Україна, Одеса, 2010); «Molecular Biology: Advances and Perspectives» (Україна, Київ, 2011); «Биология - наука XXI века» (РФ, Пущино, 2012, 2014); Міжнародної конференції «Фактори експериментальної еволюції організмів» (Україна, Алушта, 2012); «Стан і перспективи формування сортових рослинних ресурсів в Україні» (Україна, Київ, 2012); «Новітні досягнення біотехнології» (Україна, Київ, 2013); «Global Genome Biodiversity Network» (Великобританія, Лондон, 2014); «EWAC-EUCARPIA Cereals Section» (Польща, Люблін, 2015); «Fundamental and applied sciences today V» (США, Північний Чарльстон, 2015).

Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлено у 24 друкованих працях, у тому числі в шести статтях, які опубліковані у виданнях, що включено до переліку фахових (з них одна - у зарубіжному виданні), а також у 18 тезах за матеріалами міжнародних та національних наукових конференцій.

Структура та об'єм дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, розділу матеріалів та методів, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаної літератури та додатків. Повний обсяг становить 248 сторінок комп'ютерного тексту та включає 19 таблиць, 28 рисунків, складається з семи розділів. Список використаної літератури складається з 182 джерел. Додаток включає 14 таблиць.

1. Напрями молекулярно-генетичних досліджень геному пшениці м'якої озимої (Triticum aestivum L.)

Наведений огляд літератури щодо сучасних напрямів молекулярно-генетичних досліджень та організації геному пшениці м'якої озимої. Систематизовані дані щодо основних типів молекулярних маркерів та галузі їх застосування, викладена інформація про використання МС-аналізу для досліджень геному пшениці м'якої озимої, наведені дані щодо виявлення асоціацій алелів МС-локусів і господарсько цінних ознак. Представлено морфологічний та молекулярно-генетичний методи диференціації для захисту нових сортів пшениці м'якої озимої, проаналізовані проблеми диференціації сучасних сортів пшениці. Обґрунтовано актуальність та доцільність проведення досліджень за темою дисертаційної роботи.

2. Матеріали і методи досліджень

Матеріалом для дослідження слугували 46 cортів пшениці м'якої озимої (Triticum aestivum L.) селекції СГІ - НЦНС, зареєстровані в Державному реєстрі сортів України у 2003 - 2013 роках. Сорти Альбатрос одеський та Безоста 1 (два колекційні зразки) залучені в якості еталонних зразків згідно (http://sops.gov.ua/uploads/files/documents/Metodiki/12.pdf). Насіння 48 сортів було висіяне в полі (46° 27' 3" північної широти, 30° 39' 18" східної довготи) мікроділянками. Від кожного сорту рендомізованим способом взято по п'ять типових колосів для МС-аналізу, з них один використаний для подальшого розмноження за схемою «колос-ряд» та досліджень за господарсько цінними ознаками. Кожного сезону проводили МС-аналіз для визначення чистоти насіння та попередження можливого засмічення. Дисертант висловлює вдячність за надання матеріалу к.с.г.н. Хохлову О.М.

ДНК виділяли з етиольованих проростків згідно методики (Сиволап и др., 1998). ПЛР-аналіз проводили в ампліфікаторі «Терцик» («ДНК-технология», РФ) за 17 локусами: Xgwm357-1A, Xgwm18-1B, Xtaglgap-1B, Xgwm095-2A, Xgwm155-3A, Xgwm389-3B, Xgwm3-3D, Xgwm165/I-4A, Xgwm186-5A, Xgwm408-5B, Xgwm190-5D, Xgwm325-6D, Xgwm577-7B, Xgwm437-7D, Хbarc126-7D, Xgwm44-7D, Xwmc405-7D. Електрофорез продуктів ампліфікації проводили в 2 % агарозному гелі та 10 % денатуруючому поліакриламідному гелі (ПААГ), які фарбували за допомогою етідіум броміду та срібла, відповідно. Отримання відеозображень електрофореграм та оцінку довжини отриманих продуктів ампліфікації проводили за допомогою системи документації і аналізу гелів «Image Master VDS» («Amersham Pharmacia Biotech», Австрія) згідно з інструкцією користувача.

Протягом двох - чотирьох сільськогосподарських років проводили визначення таких ознак сортів пшениці м'якої озимої: дата колосіння (ДатК), висота рослини (ВР), довжина колосу (ДК), забарвлення колосу (ЗК), довжина остюків (ДО), забарвлення зерна (ЗЗ), площа проекції зернівки на площину (ПЗ), довжина зернівки (ДЗ), ширина зернівки (ШЗ), периметр проекції зернівки на площину (РЗ), округлість зернівки (ОЗ), маса 1000 зерен (МТЗ). ДатК оцінена, як дні з 1 травня. ВР (см) визначали вимірюванням довжини стебла, включаючи довжину колосів. Бальна оцінка показників ДК, ЗК та ДО здійснена за рекомендованою UPOV та Держслужбою методикою проведення експертизи сортів пшениці м'якої (Triticum aestivum L.) на відмінність, однорідність і стабільність. МТЗ вимірювали за методикою ГОСТ 10838-64 (1977). Ознаки ЗЗ, ПЗ, ДЗ, ШЗ, РЗ, ОЗ визначали за допомогою технології аналізу розмірів зернівок (Хохлов, 2009) за комп'ютерною програмою "ImageJ" 1.49h (оригінатор Wayne Rasband, National Institute of Mental Health, США; Ліцензія: не потрібна).

Для кожного МС-локусу розраховано індекс поліморфності (Polymorphic Information Content, PIC) згідно (Botstein et al., 1980). Генетичні дистанції обчислено відповідно до (Nei, Li, 1973), використано програми SimFit, ver.7.0.5 Academic 32-bit (автор: W.G. Bardsley; University of Manchester, Великобританія; Ліцензія: не потрібна), TREES 4.0 (автор: Р.Н. Календар; National Center for Biotechnology, Казахстан; Ліцензія: не потрібна) та MEGA5 (автори: K. Tamura, G. Stecher, D. Peterson, S. Kumar; Arizona State University, США; Ліцензія: не потрібна; програма використана згідно персональних рекомендацій професора S. Kumar, Carnell Professor of Biology, Temple University, Philadelphia, США). Побудову дендрограм здійснювали незваженим парно-груповим методом з арифметичним усередненням - Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA). Для визначення ступеню подібності дендрограм був виконаний Мантель тест за допомогою програми PASSaGE, ver. 2.0.11.6 (автори: M. S. Rosenberg, C. D. Anderson; Arizona State University, США; Ліцензія: не потрібна).

Статистичний аналіз отриманих результатів проводили за загальноприйнятими методиками (Рокицкий, 1973; Доспехов, 1985; Атраментова та ін., 2014) з використанням програми Excel із Microsoft Office 2010, ver. 14.0.7128.5000 (Microsoft Corporation, США, Ліцензія: 01631-551-4295762-27539). Відповідність нормальному розподілу перевіряли у програмі SimFit. Визначення асоціацій полягало у виявленні статистично значимих відмінностей між групами сортів, складеними із носіїв певних алелів відомої молекулярної маси, які оцінювалися за допомогою критерію t Ст'юдента. Дисперсійний аналіз виконано процедурою GLM (генеральна лінійна модель) із спеціалізованого програмного комплексу AGROBASE 21 (Agronomics Software Inc., Канада; Ліцензія: AGX-98-118).

3. Результати досліджень та їх обговорення

Аналіз генетичного різноманіття сучасних українських сортів пшениці м'якої озимої. Поліморфізм сучасних українських сортів за мікросателітними локусами. Досліджували молекулярно-генетичний поліморфізм сортів пшениці м'якої озимої селекції СГІ - НЦНС 2003 - 2013 років реєстрації. Загалом 114 алелів детектовані за 17 МС-локусами серед 48 сортів пшениці, кількість алелів на локус варіювала в діапазоні від 4 до 10, із середнім значенням 6,71 (табл. 1).

Таблиця 1. Генетичний поліморфізм сортів пшениці м'якої озимої за МС-локусами

Найбільша кількість алелів (10) детектована для локусів Xgwm155-3A, Xgwm325-6D та Xbarc126-7D, в той час як лише чотири алелі виявлені у локусі Xgwm190-5D. Середнє значення індексу поліморфності PIC складало 0,67 та варіювало від 0,48 для Xgwm190-5D до 0,84 для Xgwm155-3A.

Внутрішньосортова гетерогенність сучасних сортів пшениці м'якої озимої. Для аналізу сортів використовували по одній індивідуальній рослині від кожної з п'яти ліній цього сорту. Встановлено, що 41 проаналізований сорт пшениці м'якої озимої селекції СГІ - НЦНС 2003 - 2013 років реєстрації виявився гетерогенним за 1 - 14 дослідженими МС-локусами з 17 протестованих.

За результатами визначення генотипного складу сортів виявлені 18 сортів, що складаються з п'яти генотипів: Безмежна, Бунчук, Ватажок, Годувальниця одеська, Голубка одеська, Господиня, Довіра, Заможність, Зміна, Косовиця, Ліона, Місія одеська, Подяка, Скарбниця, Служниця одеська, Турунчук, Ужинок, Хист. Кожен виявлений генотип характеризується появою певних алелів, які відрізнялися від знайдених в інших генотипах. Сорти Дюк, Епоха одеська, Запорука, Зорепад, Княгиня Ольга, Лебідка одеська (другий зразок) були презентовані чотирма генотипами, які відрізнялися один від одного. У 10 сортів пшениці відзначено по три генотипи в межах кожного сорту, відповідно, а у сортів Дальницька, Доброчин, Єдність, Жайвір, Істина одеська, Небокрай, Отаман, Пилипівка - по два. Сорти Гурт, Кірія, Ластівка одеська, Литанівка, Оксана були гомогенними за результатами МС-аналізу за 17 МС-локусами, тобто складалися лише з одного генотипу, що характеризувався унікальним поєднанням алелів для кожного сорту відповідно. Загалом знайдено 172 генотипи на виборці протестованих за 17 МС-локусами українських сортів пшениці м'якої озимої.

Розподіл частот алелів мікросателітних локусів. Проаналізовано розподіл частот алелів МС-локусів на загальній виборці сортів пшениці м`якої озимої за 17 МС-локусами. Так, за локусом Xgwm186-5А детектували дев'ять алелів (рис. 1 а), з яких найменшу частоту мали алелі 107 та 139 п.н. - 0,04, виявлені у сортів Скарбниця, Подяка, Дальницька, Істина одеська та Зміна. МС-локус Xgwm186-5А показаний фланкуючим маркером для QTL QYr.osu-5A для стеблової іржі, спричиненою Puccinia striiformis, що також асоційована з геном, який фланкується МС-маркерами Xbarc165-5А та Xbarc40-5А. Натомість, за локусом Xgwm095-2А виявили шість алелів, з яких до рідкісних віднесено алель 124 п.н. - 0,004, що детектували у сорті Бунчук. Чотири алелі виявлено за локусом Xgwm190-5D. Алель 208 п.н., що характеризувався найбільшою частотою, зустрічався в 62 % досліджених сортів. Алелі 210 п.н. та 212 п.н. можна віднести до рідкісних, їх детектовано у сорту Подяка. Водночас за локусом Xgwm18-1B на представленій виборці сортів детектували п'ять алелів (рис. 1 б), з яких найбільшу частоту мав алель 192 п.н., що зустрічався у 40 % сортів; найменшу частоту - алель 194 п.н., що виявлений у сортів Турунчук та Ужинок. За інформацією (Brbaklic et al., 2013) МС-маркер Xgwm18-1B показав асоціацію з локусами кількісних ознак, що відповідають за ознаки дат колосіння та цвітіння.

За даними аналізу локусів Xgwm165/I-4А та Xgwm155-3А найменшою частотою характеризувалися, відповідно, алелі 189 п.н. (рис. 1 в, г), що спостерігався у гетерогенних сортів Запорука, Благодарка одеська та Зміна, та 129 п.н., що зустрічався з частотою 0,012 у сорту Подяка. П'ять алелів, один з яких зустрічався в 52 % досліджених сортів та мав розмір 107 п.н., виявлено за локусом Xgwm437-7D. Алель 111 п.н., який можна віднести до рідкісних, виявлено у гетерогенного за 14 МС-локусами сорту Подяка. PIC за цим локусом має значення 0,55, що узгоджується з дослідженням (Khanjari et al., 2007), де індекс поліморфності теж склав 0,55.

мікросателітний геном молекулярний алельний

Рис. 1. Діаграми розподілу частот алелів за МС-локусами: а - Xgwm186-5A; б - Xgwm18-1B; в - Xgwm165/I-4A; г - Xgwm155-3A; д - Xgwm3-3D; е - Xgwm357-1A; є - Xgwm325-6D; ж - Хbarc126-7D; з - Xgwm44-7D серед генотипів сортів пшениці м'якої озимої

Сім алелів детектовано за локусом Xgwm3-3D. Алелі 86 та 88 п.н., що характеризувалися найбільшою частотою (рис. 1 д), зустрічалися в 24 % та 18 % досліджених сортів, відповідно. Алель 75 п.н. можна вважати рідкісним, його виявлено у гетерогенного сорту Польовик. Відомо, що МС-локус Xgwm3-3D разом з Xgwm314-3D фланкують з генетичною дистанцією 2,1 cM та 2,5 cM, відповідно, домінантний ген R-D1 на довгому плечі 3D хромосоми, що кодує червону окраску зерна пшениці (Li et al., 2010).

За локусом Xgwm389-3В визначили сім алелів, з яких найбільш розповсюдженим був алель 117 п.н., в той же час до рідкісних віднесено алель 145 п.н. з частотою 0,03, який детектовано у сортів Голубка одеська та Безмежна.

Водночас за даними аналізу локусу Xgwm357-1А на дослідженій виборці сортів виявлено сім алелів (рис. 1 е), що на три перевищує кількість алелів, знайдених Khanjari et al. (2007) у оманських сортів. У дослідженнях Zanke et al. (2014) встановлено, що алель Xgwm357-1A128 значно асоційований з величиною висоти рослин та виявився таким, що має сильний вплив на зменшення висоти рослин.

10 алелів виявлено за локусом Xgwm325-6D (рис. 1 є), найбільш розповсюдженим з яких був алель 144 п.н. - він зустрічався у 28 % сортів. В той самий час за локусом Xbarc126-7D на представленій вибірці генотипів детектували також 10 алелів (рис. 1 ж), з яких найбільшу частоту мав алель 164 п.н., а найменшу - алель 162 п.н., виявлений у сорті Запорука. За результатами дослідження (Rцder et al., 2008) з картування локусів кількісних ознак, асоційованих з показником маси 1000 зерен (МТЗ), визначено, що головний QTL QTgw.ipk-7D пшениці, асоційований з МТЗ з інтервалом приблизно біля 1 cM, фланкується маркерами Xbarc126-7D, Xwmc405-7D та Xgwm44-7D на хромосомному плечі 7DS. Тому доцільним представлялось дослідити розподіл частот алелів МС-локусів Xgwm44-7D та Xwmc405-7D.

За локусом Xgwm44-7D найбільшою частотою характеризувався алель 185 п.н. - 0,576 (рис. 1 з); до рідкісних віднесено алель 178 п.н. - 0,02, який детектували у сорті Гурт. Mir et al. (2012) проведене асоціативного картування за 25 МС-маркерами, що пов'язані з масою зерна, серед яких знаходився МС-маркер Xgwm44-7D, присутній в інтервалі QTL (QGw.ccsu-7D) для маси зерна, ідентифікованого Huang et al. (2003) та щільно картованого Rцder et al. (2008).

По шість алелів детектовано за локусами Xwmc405-5D, Xgwm408-5B та Xtaglgap-1В. За Leonova et al. (2003) відомо, що МС-маркер Xgwm408-5B показує тісний зв'язок з геном, що відповідає за яровизацію Vrn-B1 на хромосомі 5BL. У роботі (Landjeva et al., 2006) відзначено, що наявність алеля Xtaglgap-1B244 пов'язана з червоним кольором колоскової луски пшениці. Khlestkina et al. (2007) запропоновано, що алелі розміром 250, 241, 244 та 247 п.н. МС-локусу Xtaglgap-1B можуть мати відношення до гену Rg-B1b, що визначає колір колоскової луски. За локусом Xgwm577-7B на представленій вибірці сортів детектували п'ять алелів, з яких найменшу частоту мав алель 152 п.н., що виявлений у сортів Скарбниця, Заможність та Бунчук. Встановлено, що МС-маркер Xgwm577-7B фланкує ген, зчеплений зі стійкістю до борошнистої роси та з геном стійкості Stb8 до септоріозу (Nelson et al., 1995). Визначені статистично значимі відмінності розподілу частот алелів за дослідженими МС-локусами свідчать про селекційну та адаптивну цінність певних алелів цих локусів для умов Півдня України.

Кластеризація сортів пшениці м'якої озимої за даними мікросателітного аналізу. Для визначення генетичної подібності досліджуваних сортів пшениці розраховували генетичні дистанції (ГД) між ними та проводили кластерний аналіз сучасних сортів, які були всі диференційовані на дендрограмі (рис. 2). Обліку підлягали всі алелі досліджених зразків кожного сорту.

Рис. 2. Дендрограма сортів пшениці, побудована за ГД, розрахованими при використанні методу UPGMA за даними аналізу 17 МС-локусів

На дендрограмі виділено три основні кластери. Сорти Запорука та Подяка, які є дуже гетерогенними, не входять до жодного з кластерів. Наявність пшениці ярої Olesen's Dwarf із Замбії в родоводі сорту Запорука та ярої пшениці Костенко у родоводі сорту Подяка, а також і те, що обидва сорти Запорука та Подяка, за результатами МС-аналізу складаються з чотирьох - п'яти генотипів, відповідно, можуть пояснити їх відокремлене розташування на дендрограмі. Для більшості досліджених сортів пшениці модель кластеризації відповідала походженню зазначених сортів.

Паспортизація сортів пшениці м'якої озимої за даними мікросателітного аналізу. За отриманими результатами складені ідентифікаційні формули досліджених сортів пшениці. Записували генетичні формули сортів на основі аналізу молекулярно-генетичного поліморфізму шляхом визначення алельного стану МС-локусів п'яти досліджених ліній кожного сорту. У разі виявлення сортової гетерогенності, записували молекулярно-генетичні формули кожної лінії, знайденої у окремого сорту. Наприклад, ідентифікаційна формула гомогенного сорту Оксана така: A123B110C149D195E115F188H138L86M204O107P144Q164R185S218T188U173V215, де буквами латинського алфавіту позначені МС-локуси: A - Xgwm357-1A; B - Xgwm095-2A; C - Xgwm155-3A; D - Xgwm165/I-4A; E - Xgwm186-5A; F - Xgwm18-1B; H - Xgwm389-3B; L - Xgwm3-3D; M - Xgwm190-5D; O - Xgwm437-7D; P - Xgwm325-6D; Q - Barc126-7D; R - Xgwm44-7D; S - Xwmc405-7D; T - Xgwm408-5B; U - Xgwm577-7B; V - Xtaglgap-1B.

Моделювання системи мікросателітних маркерів для забезпечення однозначної диференціації та ідентифікації сортів пшениці. Створення наборів мікросателітних маркерів для однозначної диференціації та ідентифікації сортів пшениці. Для диференціації відносно малої сукупності сортів (чисельністю близько 50) система із 17 МС-маркерів, яка теоретично, при умові реалізації всіх можливих комбінацій алелів, здатна розпізнати однозначно до 1,93 х 1013 сортів, була б надмірною. Через велику кількість різнорідної інформації, яку треба враховувати, неможливо обмежитися суто формальними правилами добору мінімально необхідних множин маркерів, тому це певною мірою емпіричний процес. Усього за матеріалами дослідження сформовано три набори маркерів. Спочатку добирали маркери до локусів з найбільшою кількістю алелів (набір 1: Xgwm357-1A, Xgwm155-3A, Xgwm186-5A, Xgwm408-5B, Xgwm325-6D, Xbarc126-7D), далі пріоритет був за показниками поліморфності РІС (набір 2: Xgwm18-1B, Xgwm095-2A, Xgwm389-3B, Xgwm3-3D, Xgwm165/I-4A, Xgwm408-5B). До третього набору (Xtaglgap-1B, Xgwm095-2A, Xgwm408-5B, Xgwm190-5D, Xgwm577-7B, Xgwm437-7D, Xgwm44-7D, Xwmc405-7D) ввійшла вся решта маркерів. МС-локуси Xgwm408-5B, Xgwm095-2A входять до декількох наборів одночасно та забезпечують однозначну диференціацію сортів. Криві покрокового росту числа однозначно ідентифікованих сортів для всіх трьох наборів показані на рис. 3; з них найбільш пологою була крива для набору 3, складеного із восьми найменш поліморфних МС-локусів.

Добір сортів-еталонів. Для створення компактної робочої колекції, яка складається із сортів, адаптованих до умов Півдня України та містить у собі всі необхідні для однозначної ідентифікації алелі, із загального числа сортів виділено два набори, кожен з них містить усі алелі, які були знайдені за дослідженими 17 МС-локусами. Перший (мінімальний) набір складається із 26 ліній, а другий (35 ліній) відрізняється від першого відносно вищою кількісною представленістю рідкісних алелів. Сформовані у даному дослідженні набори у подальшому стануть основою спеціалізованих колекцій сортів-еталонів. Колекції будуть впроваджені у практику сортовивчення, склад колекцій буде удосконалюватись.

Рис. 3. Ріст розподільної здатності маркерної системи при покроковому залученні маркерів

Таким чином, дослідження алельного складу МС-локусів сортів пшениці м'якої озимої селекції СГІ-НЦНС показало, що для їх однозначної диференціації та ідентифікації достатньо обрати шість - вісім найбільш інформативних МС-локусів. Також було відібрано 26-35 ліній сортів, що могли б скласти колекцію сортів-еталонів, носіїв усіх алелів, виявлених за 17 МС-локусами, які притаманні сортам СГІ - НЦНС.

Виявлення зв'язку між поліморфізмом сортів за алельним складом мікросателітних локусів та низкою господарсько цінних ознак. Диференціація та ідентифікація ліній сортів пшениці за молекулярно-генетичною характеристикою алельного складу мікросателітних локусів. З метою розробки ефективних методів диференціації та ідентифікації генотипів, встановлення генетичної чистоти ліній, віднесення ліній до того або іншого сорту проводили диференціацію та ідентифікацію ліній сортів пшениці за алельним складом МС-локусів, а також їх кластеризацію на основі генетичної схожості. Побудовано дендрограму, на якій кожен сорт, як гомогенний, так і гетерогенний, - представлений набором п'яти складових ліній (рис. 4). Це свідчить про спроможність системи відрізнити складові лінії одного сорту в єдину гілку і, таким чином, відрізнити його від інших близькоспоріднених сортів, що були створені у тому ж селекційному центрі за близьких умов середовища вирощування та вихідного матеріалу. Сорти згруповано в два загальних кластери, субкластеризація яких подібна до субкластеризації окремих сортів пшениці, представлених на рис. 2. Звертає на себе увагу те, що сорт Подяка, який є гетерогенним, показав різну локалізацію ліній в межах сорту на дендрограмі. Для більшості ж сортів лінії кожного сорту об'єднані між собою на дендрограмі. Гомогенні у межах кожного сорту за аналізованими локусами сорти Гурт, Кірія, Ластівка одеська, Литанівка, Оксана на дендрограмі не поділяються. Таким чином, застосування МС-аналізу для диференціації близькоспоріднених сортів надало можливість висвітлити внутрішню генетичну структуру сортів, розділити їх на сорти лінійного типу та гетерогенні, й зафіксувати серед гетерогенних сортів такі генотипи окремих рослин, які значно відрізняються від решти досліджених генотипів даного сорту, а також виявити можливі засмічення.

Рис. 4. Дендрограма, побудована за ГД, розрахованими при використанні методу UPGMA, за результатами кластерного аналізу ліній, виділених із сортів пшениці м'якої озимої селекції СГІ - НЦНС, за даними алельного складу 17 МС-локусів. Цифри поряд із назвами сортів вказують порядкові номери ліній

Диференціація та ідентифікація сортів пшениці за низкою господарсько цінних ознак. За результатами кластерного аналізу за ознаками ВР, МТЗ, ДатК, ДК та ЗК, ДО, ПЗ, РЗ, ДЗ та ШЗ, ОЗ, ЗЗ (середні за два - чотири роки) сорти розділилися на 4 кластери (для порогу 4-5 у.о.). Із закономірностей слід зазначити, що три субкластери кластера ІІ містять тільки сорти, створені в лабораторії селекції інтенсивних сортів пшениці СГІ - НЦНС. Два субкластери кластера ІІІ включають сорти, створені у відділі селекції та насінництва пшениці СГІ - НЦНС, а також одну з ліній сорту Безоста 1. Сорт пшениці м'якозерної Оксана, створений у відділі генетичних основ селекції СГІ - НЦНС, фактично являє собою окрему гілку, найближчим до якої є сорт Єдність. Слід зазначити, що показник твердозерності не входив до 12 ознак, за якими проводили кластерний аналіз.

Кореляція міжсортових дистанцій, оцінених за мікросателітними маркерами та господарсько цінними ознаками. Для визначення ступеню подібності дендрограм, побудованих за МС-маркерами та господарсько цінними ознаками, порівнювали між собою відповідні матриці дистанцій (Мантель тест). Для коректності порівнянь із п'яти проаналізованих за МС-локусами ліній (п'ять по кожному сорту) в аналіз брали лише дані, які стосувалися ліній, оцінених за морфологією (одна по кожному сорту). Результати показали повну відсутність відповідності між двома методами диференціації сортів пшениці м'якої озимої (рис. 5), хоча помірні кореляції знайдені деякими дослідниками (Kwon et al., 2005).

Рис. 5. Кореляція міжсортових дистанцій, оцінених за МС-маркерами та господарсько цінними ознаками. По осі абсцис відображені дистанції за 17 МС-локусами; по осі ординат - господарсько цінними ознаками; рівняння лінії тренда: Y = -0,0082х + 4, 5586; R2 = 0,0002, де R2 - коефіцієнт детермінації

На наш погляд, пояснення полягає у тім, що деякі з використаних нами МС-локусів можуть мати генетичну локалізацію, відмінну від локалізації генів господарсько цінних ознак, бо відомо, що більшість господарсько цінних ознак є полігенними. Крім того, характеристика за алельним складом МС-локусів є кількісною, тоді як за господарсько цінними ознаками - може бути як кількісною, так і якісною. Ще одна причина може полягати у відносній близькості характеристик сортів, що досліджували. В значній мірі інформація, отримана двома групами методів диференціації та ідентифікації сортів пшениці за МС-аналізом та за низкою господарсько цінних ознак пшениці, є незалежною.

Асоціації алелів мікросателітних локусів і господарсько цінних ознак. Молекулярні маркери становлять інтерес у двох основних аспектах - як диференціатори та ідентифікатори сортів та як власне маркери селекційних ознак. В дисертаційному дослідженні застосовували МС-маркери для пошуку асоціацій з господарсько цінними ознаками пшениці. Здійснене виявлення асоціацій між наявністю у генотипі певних алелів конкретного МС-локусу та рівнем розвитку ознаки, що вивчається. Визначення асоціацій полягало у виявленні статистично значимих різниць між групами, складеними із носіїв певних алелів, застосуванням підходів варіаційної статистики, основними критеріями якої є наявність достовірної різниці та стабільність її прояву на протязі двох - чотирьох сільськогосподарських років. У табл. 2 та 3 наведено розподіл алелів МС-локусів, асоційованих зі збільшенням або зменшенням величин декотрих досліджених ознак.

Таблиця 2. МС-алелі залежно від їх асоціацій з ознаками «площа проекції зернівки на площину» (ПЗ), «довжина зернівки» (ДЗ), «ширина зернівки» (ШЗ), «периметр проекції зернівки на площину» (РЗ), «округлість зернівки» (ОЗ)

Примітка. * - Під альтернативними маються на увазі алелі, що статистично значимо асоціювалися як зі зменшенням, так і зі збільшенням величин досліджених ознак у різні роки

Таблиця 3. МС-алелі залежно від їх асоціацій з ознаками «забарвлення зерна» (ЗЗ), «забарвлення колосу» (ЗК) та «маса 1000 зерен» (МТЗ)

Примітка. * - Збільшення величин ознак «забарвлення зерна» та «забарвлення колосу» означає більш світле забарвлення; збільшення величини ознаки «дата колосіння» означає більш пізнє колосіння; ** - Під альтернативними маються на увазі алелі, що статистично значимо асоціювалися як зі зменшенням, так і зі збільшенням величин досліджених ознак у різні роки

Знайдені асоціації є стабільними та значущими. МС-маркер Xgwm186-5A був статистично значимо пов'язаний з усіма аналізованими ознаками й характеризувався стабільністю протягом одного - чотирьох сільськогосподарських років для різних господарсько цінних ознак пшениці, що може свідчити про селекційну та адаптивну цінність певних алелів цього МС-локусу для умов Півдня України. МС-маркери, які були стабільно та статистично значимо асоційованими з господарсько цінними ознаками пшениці в різні сільськогосподарські роки, можуть бути використані при доборі генотипів з поліпшеними морфологічними та агрономічними ознаками з метою підвищення ефективності селекції.

Аналіз та узагальнення результатів дослідження. В результаті проведених досліджень визначені алелі МС-локусів для сучасних сортів пшениці селекції СГІ - НЦНС 2003 - 2013 років реєстрації, згідно яким сорти диференційовані та ідентифіковані. Досліджена внутрішньосортова гетерогенність та розподіл частот алелів МС-локусів, проведене моделювання мінімально необхідної системи МС-маркерів для забезпечення однозначної диференціації та ідентифікації близькоспоріднених сортів пшениці. Виявлені асоціації алельного складу МС-локусів і господарсько цінних ознак у генотипів сортів, адаптованих до умов вирощування Півдня України.

Висновки

В дисертаційній роботі проаналізовано молекулярно-генетичний поліморфізм сортів пшениці м'якої озимої селекції СГІ - НЦНС 2003 - 2013 років реєстрації та встановлені асоціації алелів МС-локусів і господарсько цінних ознак пшениці. Результати проведених досліджень відповідають поставленим завданням і дозволяють зробити наступні висновки:

1. Визначений молекулярно-генетичний поліморфізм сучасних сортів пшениці м'якої озимої селекції СГІ - НЦНС за 17 МС-локусами, згідно якого серед 48 сортів пшениці детектовано 114 алелів, кількість яких варіювала в діапазоні від 4 до 10 на локус із середнім значенням 6,71. Загалом виявлено 172 генотипи на протестованій виборці сортів пшениці м'якої озимої.

2. Встановлено, що 41 з проаналізованих сортів є гетерогенним за 1 - 14 дослідженими МС-локусами. Сорти Гурт, Кірія, Ластівка одеська, Литанівка, Оксана є гомогенними за результатами аналізу 17 високополіморфних МС-локусів.

3. Визначені статистично значимі відмінності розподілу частот алелів на виборці 48 сортів пшениці за МС-локусами Xgwm357-1A, Xgwm18-1B, Xtaglgap-1B, Xgwm095-2A, Xgwm155-3A, Xgwm389-3B, Xgwm3-3D, Xgwm165/I-4A, Xgwm186-5A, Xgwm408-5B, Xgwm190-5D, Xgwm325-6D, Xgwm577-7B, Xgwm437-7D, Хbarc126-7D, Xgwm44-7D, Xwmc405-7D, що свідчить про селекційну та адаптивну цінність певних алелів цих локусів для умов Півдня України.

4. На основі розрахунку генетичних дистанцій між дослідженими сортами пшениці встановлена їх молекулярно-генетична відмінність, що дозволило провести їх диференціацію. Створені молекулярно-генетичні ідентифікаційні формули сортів пшениці з урахуванням їх лінійного складу.

5. Оптимізовано мінімальну кількість та склад МС-маркерів, необхідних для однозначної диференціації та ідентифікації сортів. Із 17 МС-локусів сформовано три мінімально необхідні робочі набори, близькі за диференційною здатністю, кожен з яких оцінює шість - вісім МС-локусів та здатний розрізнити сорти, споріднені походженням з одного селекційного центру.

6. Виявлені статистично значимі асоціації алелів МС-локусів і господарсько цінних ознак пшениці. Протягом двох - чотирьох сільськогосподарських років (2010-2011, 2011-2012, 2012-2013, 2013-2014) встановлено 34 статистично значимих асоціацій алелів МС-локусів з ознакою «дата колосіння», 37 - з ознакою «висота рослин», вісім - з ознакою «довжина колосу», 18 - з ознакою «забарвлення колосу», дев'ять - з ознакою «забарвлення зерна», 32 - з ознакою «довжина остюків», вісім - з ознакою «площа проекції зернівки на площину», 16 - з ознакою «периметр проекції зернівки на площину», 17 - з ознакою «довжина зернівки», три - з ознакою «ширина зернівки», 21 - з ознакою «округлість зернівки», чотири - з ознакою «маса 1000 зерен». МС-маркер Xgwm186-5A був статистично значимо пов'язаний з усіма аналізованими ознаками й характеризувався стабільністю протягом одного - чотирьох сільськогосподарських років для різних господарсько цінних ознак пшениці, що свідчить про селекційну та адаптивну цінність певних алелів цього МС-локусу для умов Півдня України.

Практичні рекомендації.

1. Рекомендовано використовувати оптимізовані мінімально необхідні робочі набори МС-маркерів, які є близькими за диференційною здатністю та складаються з шести - восьми МС-локусів, спроможних однозначно розрізнити сорти, із спільним походженням з одного селекційного центру, що узгоджується з рекомендацією UPOV щодо використання восьми МС-локусів для диференціації сортів пшениці, а також може бути корисним для потреб сортовивчення, контролю селекційних та насіннєвих розсадників.

2. Рекомендовано використовувати створену компактну робочу колекцію, яка складається з ліній сортів, адаптованих до умов Півдня України, для створення спеціалізованих наборів ліній-еталонів пшениці м'якої озимої. Два сформовані набори колекційних сортів, кожен з яких містить у собі всі необхідні для однозначної диференціації та ідентифікації сортів алелі МС-локусів, рекомендуються до впровадження у практику сортовивчення з метою розширення бази даних сортів-еталонів для дослідження колекцій сортів і пошуку сортів-претендентів на еталони для доповнення методик ВОС-тесту.

3. Виявлені статистично значимі асоціації алельного стану МС-локусів і низки господарсько цінних ознак пшениці рекомендується брати до уваги при доборі з метою підвищення ефективності селекції.

Література

1. Колесник О.О. Диференційна здатність методів ідентифікації сортів пшениці за допомогою мікросателітного аналізу та комп'ютерного визначення морфометричних параметрів зерна / О.О. Колесник, С.В. Чеботар, О.М. Хохлов, Ю.М. Сиволап // Вісник ОНУ імені І. І. Мечникова. Сер.: Біологія. - Одеса. - 2009. - Т. 14. - Вип. 8. - С. 27-42. (Здобувачем проведено пошук літератури, спільно з співавторами проведено планування, експериментальні дослідження, аналіз і підготовка статті до друку).

2. Колесник О.О. Диференціація сучасних сортів озимої м'якої пшениці півдня України за алельним складом мікросателітних локусів / О.О. Колесник, С.В. Чеботар, О.М. Хохлов, Ю.М. Сиволап // Збірник наукових праць СГІ - НЦНС. - 2012. - Вип. 19 (59). - С. 47-59. (Здобувачем проведено пошук літератури, спільно з співавторами проведено планування, експериментальні дослідження, аналіз і підготовка статті до друку).

3. Kolesnyk O.О. The courses of nurseries control and variety investigation systems founded on molecular markers / О.O. Kolesnyk, S.V. Chebotar, Yu.M. Sivolap, V.M. Tsevma, O.M. Khokhlov, M.A. Litvinenko // Зб. наук. праць СГІ - НЦНС. - 2013. - Bип. 22 (62). - C. 89-99. (Здобувачем проведено пошук літератури, спільно з співавторами проведено планування, експериментальні дослідження, аналіз і підготовка статті до друку).

4. Kolesnyk O. Association analysis of TKW in Ukrainian bread wheat varieties using SSR markers / O. Kolesnyk, A. Khokhlov // Modern Science. - 2015. - No 1. - P. 150-158. (Здобувачем проведено пошук літератури, спільно з співавтором проведено планування, експериментальні дослідження, аналіз і підготовка статті до друку).

5. Kolesnyk O. Microsatellite markers associated with grain colour of Ukrainian bread wheat varieties / O.O. Kolesnyk, S.V. Chebotar, O.M. Khokhlov // Наукові доповіді НУБіП України. - 2015. - Т. 51. - № 2. - електронне видання. (Здобувачем проведено пошук літератури, спільно з співавторами проведено планування, експериментальні дослідження, аналіз і підготовка статті до друку).

6. Колесник О.О. Співставлення методів диференціації та ідентифікації сортів пшениці м'якої озимої за низкою агрономічних ознак й морфометричними параметрами зерна та за алельним складом мікросателітних локусів / O.О. Kолесник, С.В. Чеботар, О.М. Хохлов, В.І. Файт // Вісн. Харк. нац. аграр. ун-ту. Сер. Біологія. - 2015. - Вип. 1 (34). - С. 46-54. (Здобувачем проведено пошук літератури, спільно з співавторами проведено планування, експериментальні дослідження, аналіз і підготовка статті до друку).

7. Колесник О.О. Порівняння методів опису та ідентифікації сортів пшениці / О.О. Колесник, С.В. Чеботар, О.М. Хохлов, В.М. Цевма, Ю.М. Сиволап // Збірник наукових праць «Фактори експериментальної еволюції організмів». - Київ.: Логос. - 2012. - Т. 2. - С. 104-112.

8. Колесник О.О. ДНК-типування сучасних українських сортів озимої м'якої пшениці за допомогою мікросателітних маркерів / О.О. Колесник, С.В. Чеботар, Ю.М. Сиволап // Матеріали міжнародної конференції «Фундаментальні та прикладні проблеми біології». - Донецьк, 23-26.02.2009 р. - Т. 2. - С. 131-132.

9. Колесник О. Аналіз гетерогенності сучасних українських сортів озимої м'якої пшениці за допомогою мікросателітних маркерів / О. Колесник, С. Чеботар, О. Хохлов, Ю. Сиволап // Матеріали V міжнародної конференції «Молодь і поступ Біології». - Львів, 12-15.05.2009 р. - Т. 2. - С. 233.

10. Kolesnik O. Grain morphometric characterization of the modern Ukrainian wheat varieties using computer analysis / О. Kolesnik, S. Chebotar, А. Khokhlov, Yu. Sivolap // Мaterials of IV International Conference «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution». - Odesa, 16-19.09.2009. - С. 32-33.

11. Колесник О.О. Тестування генетичної однорідності сучасних українських сортів пшениці за даними мікросателітного аналізу / О.О. Колесник, С.В. Чеботар, О.М. Хохлов, Ю.М. Сиволап // Матеріали VІ міжнародної конференції «Сучасна біотехнологія сільськогосподарських рослин та біобезпека» («Геном рослин VI»). - Одеса, 07-10.09.2010 р. - С. 49.

12. Колесник О. Аналіз розподілу частот алелів мікросателітних локусів на вибірці сортів озимої пшениці української селекції різних років / О. Колесник, С. Чеботар, О. Хохлов, Ю. Сиволап // Матеріали VІІ міжнародної конференції «Молодь і поступ біології». - Львів, 05-08.04.2011 р. - С. 296-297.

13. Kolesnyk O. Molecular genetic characterization of the modern Ukrainian bread wheat varieties by microsatellite analysis / О. Kolesnyk, S. Chebotar, А. Khokhlov, Yu. Sivolap // Мaterials of V International Conference «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution». - Odesa, 13-17.06.2011. - С. 152-153.

14. Kolesnyk O. Genetic diversity of modern winter wheat varieties according to microsatellite analysis / О. Kolesnyk, S. Chebotar, А. Khokhlov, Yu. Sivolap // Матеріали ІІ міжнародної конференції «Фундаментальні та прикладні дослідження в біології». - Донецьк, 19-22.09.2011 р.- С. 240-241.

15. Kolesnyk O. Clustering of modern Ukrainian bread wheat varieties on the base of analysis of microsatellite loci / О. Kolesnyk, S. Chebotar, А. Khokhlov, Yu. Sivolap // Мaterials of the 4th International IMBG Conference «Molecular Biology: Advances and Perspectives». - Kyiv, 14-17.09.2011. - P. 115.

16. Колесник О. Генетичний поліморфізм за мікросателітними локусами, що пов'язані з QTL маси 1000 зерен у сучасних українських сортів м'якої пшениці селекції СГІ - НЦНС / О. Колесник, С. Чеботар, О. Хохлов, Ю. Сиволап // Матеріали VІІІ міжнародної конференції «Молодь і поступ біології». - Львів, 03-06.04.2012 р. - С. 283.

17. Колесник О.А. Молекулярно-генетическая характеристика современных сортов озимой мягкой пшеницы на основе анализа микросателлитных локусов / О.А. Колесник, С.В. Чеботар, А.Н. Хохлов, Ю.М. Сиволап // Материалы тезисов 16-ой международной Пущинской школы-конференции «Биология - наука XXI века». - Пущино, 16-21.04.2012 г. - С. 117-118.

18. Колесник О.О. Ідентифікація та диференціація нових сортів м'якої пшениці (Triticum aestivum L.) селекції СГІ - НЦНС за допомогою мікросателітного аналізу / О.О. Колесник, С.В. Чеботар, О.М. Хохлов, Ю.М. Сиволап // Матеріали І міжнародної конференції, присвяченої 10-й річниці від Дня утворення Українського інституту експертизи сортів рослин «Стан і перспективи формування сортових рослинних ресурсів в Україні». - Київ, 11-13.07.2012 р. - С. 315-316.

19. Колесник О.О. Конструювання систем ідентифікації сортів озимої пшениці за молекулярними маркерами / О.О. Колесник, С.В. Чеботар, О.М. Хохлов, Ю.М. Сиволап // Матеріали ІІ міжнародної науково-практичної конференції «Новітні досягнення біотехнології». - Київ, 24-25.10.2013 р. - С. 70.

20. Kolesnyk O. The ways of efficient applying of molecular markers for plant breeding and variety investigation / О. Kolesnyk, S. Chebotar, А. Khokhlov, Yu. Sivolap // Материалы тезисов 18-ой международной Пущинской школы-конференции «Биология - наука XXI века». - Пущино, 21-25.04.2014 г. - С. 236.