Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с ишемической болезнью сердца

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с ишемической болезнью сердца

03.00.03 - молекулярная биология

Никитин Алексей Георгиевич

Москва - 2008

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИ генетика»).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов», г. Москва.

Носиков Валерий Вячеславович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Институт молекулярной генетики РАН, г. Москва Сломинский Петр Андреевич

доктор медицинских наук, профессор, Московский государственный медико-стоматологическиий университет им. Н.А. Семашко, г. Москва Терещенко Сергей Николаевич

Ведущая организация:

ГУ Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук (ГУ МГНЦ РАМН, г. Москва).

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной инвалидности и смертности в экономически развитых странах, при этом на долю ишемической болезни сердца (ИБС) и инфаркта миокарда приходится примерно две трети случаев смерти от сердечно-сосудистых заболеваний.

Известно, что данные сердечно-сосудистые патологии являются многофакторными заболеваниями с многочисленными звеньями патогенеза. Для таких заболеваний характерен сложный механизм формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие генетических факторов с факторами внешней среды. Исходя из современных представлений о механизмах развития ИБС, можно выделить группы так называемых генов-кандидатов, продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие данной патологии.

Так как атеросклероз является основным этиологическим фактором ишемической болезни сердца, к генам-кандидатам, определяющим развитие ИБС и ее осложнений, можно отнести группу генов системы антиокислительной защиты, генов системы репарации ДНК и генов, кодирующих адренорецепторы и рецепторы, активируемые пролифераторами пероксисом. Современная стратегия исследования генетической составляющей многофакторных заболеваний включает в себя поиск полиморфных маркеров в генах-кандидатах и оценку их ассоциации с заболеванием.

Установление ассоциации гена с заболеванием и последующая оценка индивидуального генетического риска имеют важное значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению данной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного пациента. Поэтому в настоящее время одним из наиболее прогрессивных подходов является разработка стратегии ранней диагностики, прогнозирования и превентивной терапии заболевания с использованием генетических маркеров.

Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с развитием ишемической болезни сердца. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов, кодирующих рецептор, активируемый пролифератором пероксисом типа (PPARG3), коактиватор 1a рецептора, активируемого пролифератором пероксисом типа g (PPARGC1A), рецептор, активируемый пролифератором пероксисом типа (PPARD), адренорецепторы b1, b2 (ADRB1, ADRB2), фермент, превращающий ангиотензин I (ACE), b3-субъединицу G-белка (GNB3), поли(АДФ-рибоза)-полимеразу 1 (ADPRT1), поли(АДФ-рибоза)-гидролазу (PARG) и a-субъединицу цитохрома

2. b(-245) (CYBA) в группе больных ишемической болезнью сердца и группе здоровых индивидов среди русских г. Москвы.

3. Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров данных генов-кандидатов в исследованных выборках больных и здоровых индивидов для выявления ассоциации изученных маркеров с развитием болезни и определения вклада данных генов в наследственную предрасположенность к патологии.

Научная новизна работы. В данной работе впервые исследована ассоциация полиморфных маркеров C(-681)G гена PPARG3, Gly482Ser гена PPARGC1A, T(-87)C гена PPARD, Ser49Gly и Gly389Arg гена ADRB1, Gly16Arg и Glu27Gln гена ADRB2, G7831A гена ACE, C825T гена GNB3, Leu64Phe и Val762Ala гена ADPRT1, A(-431)G гена PARG и Tyr72His гена CYBA с ишемической болезнью сердца (ИБС). Обнаружена ассоциация полиморфного маркера Tyr72His гена CYBA с развитием ИБС. Установлено, что носители генотипа Tyr/Tyr данного полиморфного маркера имеют повышенный риск развития ИБС, тогда как носители генотипа His/His имеют пониженный риск развития ИБС. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера C825T гена GNB3 с развитием ИБС. Установлено, что носители аллеля С и генотипа СС данного полиморфного маркера имеют повышенный риск развития ИБС. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера T(-87)C гена PPARD с развитием ИБС. Установлено, что носители аллеля С и генотипа СС данного полиморфного маркера имеют повышенный риск развития ИБС. Все вышеизложенные результаты получены впервые.

Практическая ценность работы. Показано, что исследованные полиморфные маркеры генов CYBA, GNB3 и PPARD могут использоваться для прогноза течения заболевания у больных с ИБС. Выявление ассоциации полиморфных маркеров генов CYBA, GNB3 и PPARD с развитием ИБС открывает новые перспективы в выделении групп пациентов с высоким риском развития патологии.

Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ Генетика» 19 февраля 2008 г. Результаты настоящей работы докладывались на Российском национальном конгрессе кардиологов "Российская кардиология: от центра к регионам", г. Томск, Россия (12 - 14 октября 2004 г.); Российском национальном конгрессе кардиологов "От диспансеризации к высоким технологиям", Москва, Россия (10 - 12 октября 2006 г.); на международной конференции “From Human Genetic Variations to Prediction of Risks and Responses to Drugs and Environment”, остров Санторин, Греция (29 сентября - 2 октября 2006 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, включая 3 статьи, а также тезисы докладов и сообщений на конференциях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 126 страницах машинописного текста и содержат 18 таблиц и 8 рисунков. В работе процитировано 174 зарубежных и 12 отечественных литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ассоциация ген ишемическая болезнь

Исследование ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с ишемической болезнью сердца (ИБС).

Изучение ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов с ИБС проводили, используя две группы пациентов, общая характеристика которых приведена в таблице 1. В исследование включались пациенты с ИБС, поступившие в стационар Городской клинической больницы (ГКБ) № 51. Диагноз ставили на основании клинических и биохимических исследований и данных коронароангиографии (у части больных). У части больных ИБС был диагностирован инфаркт миокарда (ИМ). Контрольная группа представляла собой случайную выборку пациентов, имеющих аналогичный профиль основных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, у которых проведенная эхо- и электрокардиография не выявила достоверных признаков ИБС.

Выборки были этнически однородны и составлены из русских (на основании паспортных данных), проживающих в г. Москве. Геномную ДНК пациентов использовали для амплификации фрагментов ДНК, содержащих полиморфные маркеры ряда генов-кандидатов, предположительно вовлеченных в патогенез атеросклероза и ишемической болезни сердца.

Анализ нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью системы NCBI в сети Интернет (www.ncbi.nlm.nih.gov). Использовали следующие разделы: MapView (построение генетической карты), dbSNP (информация о полиморфных маркерах). Для подбора праймеров и рестриктаз использовали пакет программ Invitrogen Vector NTI Advance 10 (версия Education).

Таблица 1.

Общая характеристика обследованных групп больных с наличием (“ИБС+”) и отсутствием (“ИБС-”) ишемической болезни сердца.

*S.D. - cтандартное отклонение

Идентификация аллелей полиморфных маркеров проводилась с использованием полимеразной цепной реакции, последующего расщепления фрагментов ДНК рестриктазами, и электрофоретического разделения фрагментов ДНК в 8%-ном полиакриламидном геле или 2%-ном агарозном геле.

Исследование ассоциации полиморфного маркера C(-681)G гена PPARG3 c ИБС.

Продукт экспрессии гена PPARG, PPAR?, контролирует экспрессию генов, вовлеченных в регуляцию обмена жирных кислот и адипогенез. PPARg существует в виде нескольких белковых изоформ, являющихся результатом альтернативного сплайсинга на 5`-конце гена PPARG. Точный механизм транскрипционного регулирования метаболизма сердечной мышцы семейством PPARg до настоящего времени остается невыясненным, но ряд исследований показал, что наблюдается высокий уровень экспрессии этих транскрипционных факторов в миоцитах (Yamamoto et al., 2001; Asakawa et al., 2002; Gilde et al., 2003; Xu et al., 2005). Помимо прямого влияния на метаболизм сердечной мышцы, PPARg является регулятором энергетического баланса и ряд полиморфных маркеров в гене PPARG ассоциированы с повышенным индексом массы тела и распределением жировой ткани в организме, что является факторами риска для развития атеросклероза.

Известно несколько полиморфных маркеров в гене, кодирующем PPAR?, и фланкирующих его областях. Из них наиболее изучен однонуклеотидный полиморфизм C/G в экзоне 1, приводящий к аминокислотной замене Pro12Ala в аминокислотной последовательности белка PPAR?. Но по данным, полученным разными исследователями, этот полиморфизм не ассоциирован с развитием патологий сердечно-сосудистой системы (Al-Shali et al., 2004; Rhee et al., 2007; Wang et al., 2007). В нашей работе мы использовали малоизученный однонуклеотидный полиморфизм C(-681)G, который находится в промоторной области гена PPARG. Недавно было показано, что аллель G этого полиморфного маркера ассоциирован с повышенным индексом массы тела (Cecil et al., 2006), но других исследований ассоциации с патологиями сердечно-сосудистой системы не проводилось.

В нашей работе при исследовании распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера C(-681)G гена PPARG3 в группах “ИБС+” и “ИБС-” статистически достоверных различий получено не было (табл. 2).

Таким образом, полиморфный маркер C(-681)G гена PPARG3 не ассоциирован с развитием ИБС у русских г. Москвы.

Исследование ассоциации полиморфного маркера Gly482Ser гена PPARGC1A с ИБС.

Продукт экспрессии гена PPARGC1A играет ключевую роль в метаболизме клеток миокарда. Активация PGC-1? в миоцитах сердца ведет к индукции генов, кодирующих ферменты системы перекисного окисления липидов (Lehman et al., 2000), а также активирует ряд транскрипционных факторов, таких как ERRa, ERRg и NRF-1, которые стимулируют биогенез митохондрий и усиливают экспрессию генов, кодирующих компоненты системы переноса электронов в митохондриях (Huss et al., 2004). Белки семейства PGC-1 увеличивают активность транскрипционных факторов путем прямых белок-белковых взаимодействий и, помимо PGC-1?, в это семейство входит также коактиваторы PGC-1b--и PGC-1r (Andersson et al., 2001; Lin et al., 2002; Lin et al., 2005; Finck et al., 2006; Soyal et al., 2006).

PGC-1a и PGC-1b--экспрессируются в бурой жировой ткани, сердце, скелетных мышцах и почках (Puigserver et al., 1998). Несмотря на относительно большое количество информации об эффектах PGC-1a--в изолированных миоцитах и модельных системах, о его регуляторной роли в человеческом сердце известно мало. Пока неизвестно, уменьшается ли экспрессия или активность PGC-1a при сердечно-сосудистых патологиях. В гене PPARGC1A обнаружен ряд полиморфных маркеров, которые показали ассоциацию с инсулинорезистентностью и сахарным диабетом типа 2 (Ek et al., 2001; Hara et al., 2002; Andrulionyte et al., 2004; Oberkofler et al., 2004). Однако остается неясным, ассоциированы ли эти полиморфные маркеры с заболеваниями сердечно-сосудистой системы.

В нашей работе мы использовали полиморфный маркер Gly482Ser гена PPARGC1A, расположенный в экзоне 8. Ряд новых исследований показал ассоциацию этого полиморфизма с сердечно сосудистыми патологиями при сахарном диабете типа 2 (Lai et al., 2008) и гипертонией (Andersen et al., 2005; Xie et al., 2007). Данные по изучению ассоциации этого полиморфного маркера с ИБС отсутствуют.

В нашей работе при исследовании распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера Gly482Ser гена PPARGC1A в группах “ИБС+” и “ИБС-” статистически достоверных различий получено не было (табл. 3). Таким образом, полиморфный маркер Gly482Ser гена PPARGC1A не ассоциирован с развитием ИБС у русских г. Москвы.

Исследование ассоциации полиморфного маркера T(-87)C гена PPARD c ИБС.

Белки семейства PPAR регулируют экспрессию генов с помощью связывания с регуляторными элементами в промоторных областях генов. Необходимым кофактором для них является рецептор ретиноидов Х (RXR) и активность комплекса PPAR/RXR зависит от доступности лигандов для PPAR и RXR. Наиболее значимыми эндогенными лигандами для семейства PPAR являются длинноцепочечные жирные кислоты и их метаболиты. До недавних пор изоформы PPARb/д были мало изучены. PPAR?/д экспрессируются во всех тканях тела, но в миоцитах наблюдается повышенный уровень экспрессии (Gilde et al., 2003). Было показано, что изоформы PPARb/д защищают миоциты от апоптоза, вызванного окислительным стрессом, с помощью увеличения экспрессии каталазы, которая разлагает перикись водорода (Pesant et al., 2006).

В гене PPARD обнаружен ряд полиморфизмов, для одного из которых, а именно

T(-87)C, показана ассоциация с сахарным диабетом типа 2 (Andrulionyte et al., 2006), инсулинорезистентностью (Hu et al., 2006), метаболическим синдромом (Robitaille et al., 2007) и уровнем липопротеинов высокой плотности (Aberle et al., 2006).

Полиморфизм T(-87)C (также известен под обозначением T294C) находится в промоторной области гена PPARD на расстоянии 87 нуклеотидов от точки инициации трансляции. Было обнаружено, что этот полиморфизм оказывает влияние на связывание транскрипционного фактора Sp-1 и аллель С ассоциирован с повышенной транскрипционной активностью (Skogsberg et al., 2003). В этом же исследовании было установлено, что аллель С полиморфного маркера T(-87)C гена PPARD ассоциирован с пониженным уровнем липопротеинов низкой плотности, в то время как другие полиморфные маркеры (C(-409)T, C73T и A255G) не показали ассоциации с уровнями липопротеинов высокой и низкой плотности. В связи с этим в нашем исследовании мы анализировали полиморфный маркер T(-87)C гена PPARD, как наиболее вероятный функционально значимый полиморфизм промоторной области.

При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера T(-87)C гена PPARD (табл. 4) были обнаружены статистически достоверные различия. Было показано, что носители аллеля С и генотипа СС имеют повышенный риск развития ИБС (OR = 1,43 и 2,19, соотв.), в то время как носители аллеля Т и генотипа TC - пониженный риск (OR = 0,28 и 0,70, соотв.).

Таким образом, полиморфный маркер T(-87)C гена PPARD ассоциирован с развитием ИБС у русских г. Москвы.

Исследование ассоциации полиморфных маркеров Ser49Gly и Gly389Arg гена ADRB1 c ИБС.

b-адренергические рецепторы играют важную роль в функционировании сердечно-сосудистой системы и развитии ее заболеваний. b1-рецепторы превалирует в сердце, составляя примерно 80% от всех бета-рецепторов миокарда, а b1- и b2-рецепторы в почках стимулируют высвобождение ренина, который активирует ренин-ангиотензин-альдостероновую систему. b2-рецепторы также находятся в артериях, где их стимуляция ведет к расширению сосудов. b3-рецепторы были обнаружены относительно недавно и их роль до конца не установлена (Johnson et al., 2002).

Роль бета-адренорецепторов в работе сердечно-сосудистой системы подтверждается широким применением лекарственных средств, действие которых основано на связывании с b-рецепторами. Бета-адреноблокаторы используются при лечении хронических заболеваний сердца, гипертонии, инфаркта миокарда и т.д.

Исходя из этого, представляется интересным исследовать вклад генетических полиморфизмов генов, кодирующих бета-адренорецепторы, в развитие сердечно-сосудистых паталогий, таких как ИБС.

Полиморфизмы в гене ADRB1, который кодирует b1-рецептор, были обнаружены в 1999 г. (Maqbool et al., 1999). Наиболее изученными являются полиморфные маркеры Ser49Gly и Gly389Arg, так как они имеют удобные для исследований по схеме «случай-контроль» частоты минорных аллелей. Позже были найдены еще 12 однонуклеотидных полиморфизмов, пять из которых приводили к замене аминокислоты в аминокислотной последовательности белка, но так как все эти полиморфизмы обнаружены одной группой исследователей, требуется независимое подтверждение их существования (Podlowski et al., 2000).

Было показано, что полиморфизм Ser49Gly, который находится на N-концевом внеклеточном участке рецептора, не оказывает какого-либо эффекта ни на связывание лиганда с рецептором, ни на эффективность связывания с G-белком, но при длительном взаимодействии с агонистами плотность рецепторов с вариантом Ser49 оказывается на 25% выше плотности рецепторов с вариантом 49Gly. Дальнейшие исследования подтвердили, что вариант Ser49 имеет более высокий уровень экспрессии чем 49Gly (Rathz et al., 2002), что безусловно оказывает влияние на степень активации симпатической нервной системы и течение заболеваний, связанных с этим.

Аналогичные исследования, проведенные для полиморфизма Gly389Arg, расположенного в области связывания рецептора с G-белком, показали что вариант 389Arg обладает повышенно способностью связываться с G-белками и уровень аденилатциклазы в два раза превышает таковой для варианта Gly389 (Mason et al., 1999).

Все эти данные позволяют предположить, что полиморфизмы Ser49Gly и Gly389Arg гена ADRB1 имеют функциональную значимость и могут влиять на процессы лиганд-рецепторных взаимодействий в клетке. Был проведен ряд исследований для изучения ассоциации этих полиморфных маркеров с гипертонией (Bengtsson, Melander et al., 2001; Ranade et al., 2002) и сердечной недостаточностью (Tesson et al., 1999; Borjesson et al., 2000). К сожалению, полученные данные противоречивы и скудны, что требует более широких исследований этих несомненно интересных полиморфизмов.

В нашей работе при исследовании распределения частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров Ser49Gly и Gly389Arg гена ADRB1 в группах “ИБС+” и “ИБС-” статистически достоверных различий получено не было (табл. 5-6). Таким образом, полиморфные маркеры Ser49Gly и Gly389Arg гена ADRB1не ассоциированы с развитием ИБС у русских г. Москвы.

Исследование ассоциации полиморфных маркеров Gly16Arg и Glu27Gln гена ADRB2 c ИБС.

К настоящему времени обнаружено 11 полиморфизмов в гене ADRB2, который кодирует 2-адренорецептор, четыре из которых приводят к заменам аминокислот в позициях 16, 27, 34 и 164 (Liggett, 1997). Полиморфный маркер Val34Met имеет очень низкую частоту встречаемости минорного аллеля и малоинтересен для исследований ассоциации с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Функциональные эффекты полиморфизмов Gly16Arg и Glu27Gln были исследованы в нескольких работах (Green et al., 1994; Green et al., 1995; Chong et al., 2000), но никакого влияния на лиганд-рецепторное взаимодействие или экспрессию обнаружено не было.

Множество исследований ассоциации этих полиморфных маркеров с гипертонией (Timmermann et al., 1998; Gratze et al., 1999; Busjahn et al., 2000; Rosmond et al., 2000; Bengtsson, Orho-Melander et al., 2001) и сердечной недостаточностью (Liggett et al., 1998; Wagoner et al., 2000) не обнаружили значимых ассоциаций полиморфизмов Gly16Arg и Glu27Gln гена ADRB2 с заболеваниями, но одно из исследований показало изменение соотношения 1- и 2-рецепторов в сердце от 80:20 к 60:40 при сердечной недостаточности, что указывает на возможную роль полиморфных маркеров гена ADRB2 в течении заболевания (Bristow, 2000).

В нашей работе при исследовании распределения частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров Gly16Arg и Glu27Gln гена ADRB2 в группах “ИБС+” и “ИБС-” статистически достоверных различий получено не было (табл. 7-8). Таким образом, полиморфные маркеры Gly16Arg и Glu27Gln гена ADRB2 не ассоциированы с развитием ИБС у русских г. Москвы.

Несмотря на неудачный итог исследований ассоциации полиморфизмов генов ADRB1 и ADRB2 с сердечно-сосудистыми заболеваниями как в мире, так и в нашей работе, интересным представляется дальнейшее изучение эти полиморфизмов в области фармакогеномики препаратов, применямых при лечении ИБС и гипертонии, таких как бета-адреноблокаторы.

Исследование ассоциации полиморфного маркера G7831A гена ACE c ИБС.

Регуляция кровообращения осуществляется за счет сложного взаимодействия двух прессорных систем - симпато-адреналовой и ренин-ангиотензиновой. Ренин-ангиотензиновая система (РАС) отвечает за регуляцию тонуса кровеносных сосудов, поддержание водно-солевого гомеостаза, обеспечивает питание и стимулирует пролиферацию клеток гладкой мускулатуры сосудов и миокарда. Таким образом, РАС напрямую вовлечена в физиологическую регуляцию кровяного давления, и гены, кодирующие компоненты данной системы, могут рассматриваться в качестве генов-кандидатов, чьи продукты участвуют в развитии сосудистых патологий. Помимо общециркуляторной системы существуют автономные и специфичные локальные РАС (сосудистые, миокардиальная). Фермент ренин (синтезируется юкстагломерулярными клетками почек), являясь дипептидилкарбоксипептидазой, катализирует реакцию превращения неактивного белка антиотензиногена, секретируемого печенью, в ангиотензин I (AI) (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu). Последний, в свою очередь, под действием другой карбоксипептидазы (фермента, превращающего ангиотензин I, локализованного на поверхности клеток эндотелия) превращается в регуляторный вазоактивный октапептид ангиотензин II (AII) (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe). AII повышает артериальное давление, вызывая спазм артериол.

Наиболее изученным полиморфизмом гена ACE, кодирующего фермент, превращающий ангиотензин I, является полиморфизм типа вставка/отсутствие вставки (insertion/deletion, I/D). Показано, что полиморфизм типа I/D связан со степенью экспрессии данного гена и, следовательно, с содержанием фермента в плазме. К настоящему времени накоплено множество данных об ассоциации I/D полиморфизма гена ACE с инфарктом миокарда (Cambien et al., 1992; Tiret et al., 1993; Kamitani et al., 1995), заболеваниями почек (Tanaka et al., 1998) и сосудистыми осложнениями сахарного диабета (Fujisawa et al., 1995; Keavney et al., 1995; Huang et al., 1998). Но работы, посвященные изучению ассоциации этого и других полиморфных маркеров гена ACE с ИБС, показали как наличие предрасположенности, так и ее отсутствие в зависимости от рассматриваемых факторов риска, что требует дальнейшего изучения взаимосвязи полиморфизмов гена ACE и клинических проявлений сердечно-сосудистых патологий. Нами был выбран полиморфный маркер G7831A, расположенный в интроне 7 гена ACE.

В нашей работе при исследовании распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера G7831A гена ACE в группах “ИБС+” и “ИБС-” статистически достоверных различий получено не было (табл. 9). Таким образом, полиморфный маркер G7831A гена ACE не ассоциирован с развитием ИБС у русских г. Москвы.

Исследование ассоциации полиморфных маркеров Leu54Phe и Val762Ala гена ADPRT1 c ИБС.

Поли(АДФ-рибоза)-полимераза (PARP1) играет существенную роль в распознавании повреждений и репарации ДНК. PARP1 интенсивно связывается с одиночными и двойными разрывами ДНК, образовавшимися при непосредственном повреждении ДНК или при ферментативном воздействии во время репарации ДНК. Дальнейший процесс синтеза поли(АДФ-рибозы) предшествует началу репарации поврежденной ДНК. Цепи полимера, синтезированные в ядрах в ответ на мутагенное воздействие, распадаются через 1-2 минуты после завершения их синтеза благодаря действию гидролазы поли(АДФ-рибозы) - PARG.

Недавние исследования показали патогенетическую роль окислительного стресса и сопутствующих процессов, таких как активация металлопротеиназ (семейство MMP) и поли(АФД-рибоза)-полимеразы, в различных формах сердечно-сосудистых патологий (Li et al., 2001; Sorescu et al., 2002; Tyagi et al., 2003; Berry et al., 2004; Ferrari et al., 2004; Szabo et al., 2004). Была продемонстрирована повышенная активность поли(АДФ-рибоза)-полимеразы в тканях сердца при сердечной недостаточности по сравнению со здоровыми донорами, что явилось клеточным ответом на возросшие уровни конечных продуктов гликозилирования вследствие окислительного стресса (Molnar et al., 2006).

Очевидно, что гены, кодирующие компоненты ферментных систем, участвующих в защите клеток от воздействия окислительного стресса и свободных радикалов, являются генами-кандидатами для изучения ассоциации с развитием атеросклероза и дальнейших осложнений, так как окислительный стресс стал рассматриваться в последнее время как один из главных факторов возникновения атеросклеротических бляшек и эндотелиальных дисфункций.

Ген ADPRT1, кодирующий поли(АДФ-рибоза)-полимеразу PARP1, состоит из двух функционально различающихся частей: N-концевого ДНК-связывающего и С-концевого каталитического доменов. Между ними находится домен аутомодификации. Известен ряд полиморфизмов в этом гене из которых наиболее изученными являются Leu54Phe, расположенный в экзоне 2 в области «цинковых пальцев», и Val762Ala, расположенный в экзоне 17 в начале каталитического домена. Исследований ассоциации этих полиморфных маркеров с ИБС или другими сердечно-сосудистыми патологиями до настоящего времени не проводилось.

В нашей работе при исследовании распределения частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров Leu54Phe и Val762Ala гена ADPRT1в группах “ИБС+” и “ИБС-” статистически достоверных различий получено не было (табл. 10-11), но полученные значения уровней значимости для алелей и генотипов полиморфного маркера Leu54Phe указывают на возможную малочисленность выборки, что не позволило обнаружить ассоциацию с ИБС. На основе полученных данных можно говорить о тенденции повышения частоты генотипа Phe/Phe и понижения частоты генотипа Leu/Leu в группе “ИБС+” и о возможном предрасполагающем и защитном действиях этих генотипов соответственно.

Таким образом, полиморфные маркеры Leu54Phe и Val762Ala гена ADPRT1 не ассоциированы с развитием ИБС у русских г. Москвы.

Исследование ассоциации полиморфного маркера A(-431)G гена PARG c ИБС.

Ген PARG кодирует недавно открытую гидролазу поли(АДФ-рибозы) и действует в клетке в тесном взаимодействии с поли(АДФ-рибоза)-полимеразой. В настоящий момент основная часть исследований посвящена установлению структуры и функций поли(АФД-рибоза)-гидролазы и данные по изучению ассоциации гена PARG с какими-либо заболеваниями отсутствуют. Для изучения ассоциации с ИБС нами был выбран однонуклеотидный полиморфизм A(-431)G, расположенный в промоторной области гена PARG.

В нашей работе при исследовании распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера A(-431)G гена PARG в группах “ИБС+” и “ИБС-” статистически достоверных различий получено не было (табл. 12).

Таким образом, полиморфный маркер A(-431)G гена PARG не ассоциирован с развитием ИБС у русских г. Москвы.

Исследование ассоциации полиморфного маркера C242T гена CYBA c ИБС.

Выше была отмечена роль окислительного стресса в развитии сердечно-сосудистых патологий. Потенциальными источниками высокореакционных частиц в сердце являются митохондрии, NO-синтетазы и оксидазы НАДФ. Все оксидазы НАДФ состоят из каталитической субъединицы Nox (существует пять подтипов Nox1-5) и субъединицы с низкой молекулярной массой p22phox, общей для всех оксидаз НАДФ. Было установлено, что экспрессия Nox2, Nox4 (эти субъединицы являются основными субъединицами НАДФ-оксидаз в сердце) и p22phox увеличивается после инфаркта миокарда (Fukui et al., 2001), а количество супероксидных радикалов, образуемых оксидазами НАДФ, возрастает при различным эндотелиальных дисфункциях (Bauersachs et al., 1999). Все это дает основания предполагать, что полиморфные маркеры в генах, кодирующих субъединицы НАДФ-оксидаз, могут быть ассоциированы с развитием различных сердечно-сосудистых патологий.

Наиболее изученным полиморфным маркером гена, кодирующего субъединицу p22phox, является полиморфизм C/T в положении 242 мРНК, которому соответствует аминокислотная замена His на Tyr в положении 72 аминокислотной последовательности белка p22phox. Ряд исследований обнаружили ассоциацию этого полиморфного маркера с неблагоприятными исходами при ИБС (Kuroda et al., 2007), гипертонией (Moreno et al., 2006) и ишемической болезнью сердца (Mata-Balaguer et al., 2004) в различных еворопейских популяциях, но подобных исследований среди русских не проводилось.

При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера C242T гена CYBA (табл. 13) были обнаружены статистически достоверные различия. Было показано, что носители аллеля T и генотипа TT имеют повышенный риск развития ИБС (OR = 1,49 и 3,90, соотв.), в то время как носители аллеля C - пониженный риск (OR = 0,67).

Таким образом, полиморфный маркер C242T гена CYBA ассоциирован с развитием ИБС у русских г. Москвы.

Исследование ассоциации полиморфного маркера C825T гена GNB3 c ИБС.

G-белки экспрессируются во всех клетках человеческого организма и играют главную роль в передаче сигналов от множества рецепторов с поверхности клетки. G-белки являются гетеротримерами и состоят из ?-, ?- и ?-субъединиц. Семейство G-белков насчитывает 18 ?-субъединиц, 5 ?-субъединиц и 12 ?-субъединиц, кодируемых различными генами (Downes et al., 1999), что позволяет образовывать различные варианты гетеротримеров. Было показано, что вид ?-, ?- и ?-субъединиц определяет специфичность образуемого ими G-белка (Gautam et al., 1998).

Из-за ключевого положения G-белков в системе передачи сигналов, предполагается, что мутации, изменяющие экспрессию или структуру этих белков, вносят свой вклад в большое количество заболеваний. Было найдено большое количество полиморфизмов в генах, кодирующих различные субъединицы G-белков, но наиболее интересным оказался полиморфный маркер C825T гена GNB3, который кодирует G?3-субъединицу. Этот полиморфизм расположен в экзоне 10 и связан с альтернативным сплайсингом экзона 9, который приводит к укороченному варианту субъединицы G?3, называемому G?3s (Siffert et al., 1998). Позже были найдены полиморфные маркеры A(-350)G, расположенный в промоторной области гена GNB3, и C1429T, расположенный в 3`-нетраслируемой области гена GNB3, но оба они оказались функционально незначимыми (Rosskopf et al., 2000). Биохимические исследования доказали, что вариант G?3s может образовывать димеры с различными ?-субъединицами (Rosskopf, Koch et al., 2003; Rosskopf, Manthey et al., 2003). Эти исследования также подтвердили, что аллель 825T приводит к образованию варианта G?3s, обладающего повышенной биологической активностью, что значительно усиливает способности образуемых G-белков к передаче сигналов (Virchow et al., 1999; Lindemann et al., 2001). Все это вместе дает основания рассматривать аллель 825T полиморфного маркера C825T гена GNB3 в качестве генетического маркера усиленной сигнальной трансдукции.

К настоящему времени проведено большое количество исследований, посвященных изучения ассоциации полиморфного маркера C825T гена GNB3 с гипертонией (Benjafield et al., 1998; Siffert et al., 1998; Hengstenberg et al., 2001), атеросклерозом (Schafers et al., 2001; Hanon et al., 2002; Nurnberger et al., 2004) и ИБС (von Beckerath et al., 2000; von Beckerath et al., 2003). Данные этих исследований носят противоречивый характер и сравнение их затруднено в силу различных подходов к формированию выборок, этнических неоднородностей и методов обработки результатов, что безусловно потребовало проведения аналогичного исследования в России, которое для полиморфизма C825T гена GNB3 было проведено впервые.

При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера

C825T гена GNB3 (табл. 14) были обнаружены статистически достоверные различия. Было показано, что носители аллеля С и генотипа СС имеют повышенный риск развития ИБС (OR = 1,55 и 1,63, соотв.), в то время как носители аллеля Т - пониженный риск (OR = 0,65).

Таким образом, полиморфный маркер C825T гена GNB3 ассоциирован с развитием ИБС у русских г. Москвы.

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что в развитии ИБС существенную роль играют гены, кодирующие факторы, определяющие уровень образования супероксидных радикалов (CYBA), эффективность регуляции энергетичского баланса (PPARD) и скорость передачи сигналов (GNB3).

ВЫВОДЫ

1. Определены частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов PPARG3, PPARGC1A, PPARD, ADRB1, ADRB2, ACE, GNB3, ADPRT1, PARG и CYBA в группах больных ишемической болезнью сердца, а также в контрольной группе русских г. Москвы.

2. Для ряда полиморфных маркеров генов PPARG3, PPARGC1A, ADRB1, ADRB2, ACE, ADPRT1 и PARG показано отсутствие ассоциации с ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда у русских г. Москвы.

3. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера T(-87)C гена PPARD с развитием ишемической болезни сердца у русских г. Москвы. Было показано, что носители аллеля С и генотипа СС имеют повышенный риск, в то время как носители аллеля Т и генотипа TC - пониженный риск развития ИБС.

4. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера Tyr72His гена CYBA с развитием ишемической болезни сердца у русских г. Москвы. Было показано, что носители генотипа Tyr/Tyr имеют повышенный риск, в то время как носители генотипа Hys/Hys - пониженный риск развития ИБС.

5. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера C825T гена GNB3 с развитием ишемической болезни сердца у русских г. Москвы. Было показано, что носители аллеля С и генотипа СС имеют повышенный риск, в то время как носители аллеля Т - пониженный риск развития ИБС.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Никитин, А.Г., Горашко, Н.М., Минушкина, Л.О., Кудряшова, О.Ю., Затейщиков, Д.А., Сидоренко, Б.А., Носиков, В.В. (2003) Изучение ассоциации полиморфного маркера G7831A гена ACE с ишемической болезнью сердца в московской популяции. Молекулярная биология, 37(1), 54-56.

2. Никитин, А.Г., Чудакова, Д.А., Спицина, Е.В., Минушкина, Л.О., Затейщиков, Д.А., Носиков, В.В., Дебабов, В.Г. (2007) Ассоциация полиморфного маркера С825Т гена GNB3 с ишемической болезнью сердца. Генетика, 43(8), 1129-33.

3. Zateyshchikov, D.A., Minushkina, L.O., Brovkin, A.N., Savel'eva, E.G., Zateyshchikova, A.A., Manchaeva, B.B., Nikitin, A.G., Sidorenko, B.A., Nosikov, V.V. (2007) Association of CYP2D6 and ADRB1 genes with hypotensive and antichronotropic action of betaxolol in patients with arterial hypertension. Fundamental Clininical Pharmacology, 21(4), 437-43.

4. Nosikov, V.V., Zateyshchikov, D.A., Nikitin, A.G., Minushkina, L.O., Babunova, N.B., Sidorenko, B.A. Association of MTHFR and GNB3 genes with coronary artery disease among Russians. Abstracts of the Second “Biologie Prospective” Conference “From Human Genetic Variations to Prediction of Risks and Responses to Drugs and Environment”, p.A54, Santorini Island, Greece (September 30 - October 4, 2004).

5. Затейщиков, Д.А., Никитин, А.Г., Минушкина, Л.О., Затейщикова, А.А., Носиков, В.В., Сидоренко, Б.А.Ассоциация полиморфного маркера С825Т гена GNB3 с регуляцией тонуса сосудов у больных ишемической болезнью сердца. Материалы Российского национального конгресса кардиологов "Российская кардиология: от центра к регионам", стр.174, г. Томск, Россия (12 - 14 октября 2004 г.).

6. Носиков, В.В., Затейщиков, Д.А., Никитин, А.Г., Чумакова, О.С., Воронько, О.Е., Минушкина, Л.О., Бабунова, Н.Б., Сидоренко, Б.А. Генетические основы наследственной предрасположенности к ишемической болезни сердца. Анализ ассоциации генов GNB3, NOS3 и AT2R1. Материалы Российского национального конгресса кардиологов "Российская кардиология: от центра к регионам", стр. 355, г. Томск, Россия (12 - 14 октября 2004 г.).

7. Nosikov, V.V., Zateyshchikov, D.A., Nikitin, A.G., Chumakova, O.S., Savost'yanov, K.V., Minushkina, L.O., Voron'ko, O.E., Babunova, N.B., Sidorenko, B.A. Genetic basis of inherited predisposition to coronary artery disease. Abstracts of the 75th Congress of European Atherosclerosis Society, p.14 (Abstract W03-P-008), Prague, Czech Republic (April 23 - 26, 2005).

8. Никитин, А.Г., Затейщиков, Д.А., Воронько, О.Е., Минушкина, Л.О., Бабунова, Н.Б., Чумакова, О.С., Горашко, Н.М., Чудакова, Д.А., Сидоренко, Б.А., Носиков, В.В. Генетические основы наследственной предрасположенности к ишемической болезни сердца. Материалы V Съезда Российского общества медицинских генетиков, стр. 238, г. Уфа, Россия (24 - 27 мая 2005).

9. Zateyshchikov, D.A., Dankovtseva, E.N., Nikitin, A.G., Koroleva, O.S., Brovkin, A.N., Yakunina, N.Yu., Chudakova, D.A., Nosikov, V.V., Sidorenko, B.A. Genetic predisposition to early onset of coronary artery disease. Abstracts of the XIV International Symposium on Atherosclerosis, p.131 (Abstract Mo-P6:387), Rome, Italy (June 18 - 22, 2006).

10. Zateyshchikov, D.A., Nosikov, V.V., Brovkin, A.N., Minushkina, L.O., Nikitin, A.G., Sidorenko, B.A. Relationship between clinical response to betaxolol (lokren) in Russian patients with essential hypertension and polymorphous markers of ADRB1, CYP1A1, CYP1A2 and CYP2D6 genes. Abstracts of the Third “Biologie Prospective” Conference “From Human Genetic Variations to Prediction of Risks and Responses to Drugs and Environment”, p.A77 - A78, Santorini Island, Greece (September 29 - October 2, 2006).

11. Носиков, В.В., Затейщиков, Д.А., Никитин, А.Г., Чумакова, О.С., Бровкин, А.Н., Минушкина, Л.О., Чудакова, Д.А., Шестаков, А.Е., Воронько, О.Е., Бабунова, Н.Б., Сидоренко, Б.А. Генетические основы наследственной предрасположенности к ишемической болезни сердца среди этнических русских, проживающих в Москве. Материалы Российского национального конгресса кардиологов "От диспансеризации к высоким технологиям", стр. 263, Москва, Россия (10 - 12 октября 2006 г.).

Размещено на Allbest.ru