Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот YddG Escherichia coli

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

03.01.03. - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПОРТЕРА АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТ YddG ESCHERICHIA COLI

ЦЫРЕНЖАПОВА ИРИНА СЕРГЕЕВНА

Москва - 2010

Работа выполнена в лаборатории №4 Закрытого Акционерного Общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Дорошенко Вера Георгиевна ЗАО «АГРИ»

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Вейко Владимир Петрович ФГУП «ГосНИИгенетика» доктор биологических наук, доцент Голденкова-Павлова Институт общей генетики Ирина Васильевна им. Н.И. Вавилова РАН

Ведущая организация:

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева

Защита диссертации состоится «____» декабря 2010 г. в 1400 на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Автореферат диссертации разослан «____» ноября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Т. Л. Воюшина

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Значительные успехи последних десятилетий в производстве аминокислот связаны, прежде всего, с конструированием микроорганизмов-продуцентов методами метаболической инженерии. Такой способ конструирования включает в себя последовательное целенаправленное изменение метаболизма клетки для раскрытия ее возможностей к сверхсинтезу конкретной аминокислоты и должен быть основан на молекулярно-генетической характеристике участвующих в нем элементов.

Escherichia coli, в силу ее генетической и биохимической изученности и из-за разработанности методов манипулирования с ее геномом, является удобным микрорганизмом для рационального конструирования на ее основе штаммов-продуцентов различных биологически активных соединений и, прежде всего, аминокислот. Для последних можно не изобретать новый путь биосинтеза: клетка E. coli синтезирует для своих нужд все 20 аминокислот. Для получения суперпродукции конкретной аминокислоты ликвидируют контролирующие элементы ее синтеза и перестраивают общий метаболизм клетки для увеличения синтеза ее предшественников. При достижении определенного уровня продукции аминокислоты актуальной проблемой становится ее транспорт из клетки. Усиление активного экспорта аминокислоты из клетки в настоящее время достигается за счет увеличения экспрессии гена аминокислотного экспортера. Несмотря на то, что в последние два десятилетия идентифицированы десятки генов, кодирующих экспортеры аминокислот у промышленно значимых бактерий E. coli и Corynebacterium glutamicum, их детальное исследование только начинается.

В частности, объектом исследования данной работы является экспортер ароматических аминокислот YddG E. coli. На момент начала исследования было показано, что амплификация гена yddG придает клеткам E. coli устойчивость к ароматическим аминокислотам и их аналогам, а также увеличивает накопление ароматических аминокислот в культуральной жидкости продуцирующих их штаммов (Doroshenko et al., 2007).

Идентификация регуляторных элементов гена yddG и возможных факторов, влияющих на его экспрессию, представляла интерес и могла иметь практическое применение для оптимизации экспрессии гена yddG в штаммах-продуцентах ароматических аминокислот.

Экспортеры аминокислот относятся к интегральным мембранным белкам. Они высокогидрофобны, состоят из нескольких б-спиральных структур, которые образуют трансмембранные (ТМ) сегменты. Такие особенности мембранных белков затрудняют экспериментальный анализ их трехмерных структур, поэтому построение топологических моделей, т.е. определение количества ТМ сегментов и их ориентации в мембране является важным этапом исследования интегральных мембранных белков. К началу данной работы отсутствовали экспериментально подтвержденные топологические модели известных экспортеров аминокислот E. coli. Таким образом, несомненный интерес представляло экспериментальное определение топологии экспортера ароматических аминокислот YddG. Полученные результаты могли быть использованы для разработки новых стратегий оптимизации аминокислотных экспортеров в цитоплазматической мембране штаммов-продуцентов аминокислот.

Цели и задачи исследования. Таким образом, целью настоящей диссертационной работы было изучение регуляции гена yddG и характеристика YddG как интегрального мембранного белка.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Провести идентификацию промотора гена yddG;

2. Разработать систему и исследовать регуляцию гена yddG in vivo;

3. Исследовать локализацию YddG в клетке;

4. Построить топологическую модель YddG.

Научная новизна и практическая ценность работы. Картирован промотор гена yddG, исследована экспрессия этого гена in vivo в различных условиях культивирования. Ген yddG экспрессируется в клетках E. coli MG1655 на низком уровне, что следует как из анализа его регуляторной области, так и из тестирования активности LacZ для гибридного гена yddG'-lacZ. Увеличение экспрессии гена yddG наблюдалось в условиях, приводящих к замедлению роста клеток E. coli. Неблагоприятные или стрессовые условия, замедляющие рост культуры, индуцировались такими факторами, как ингибирующие концентрации фенилаланина, NaCl или сахарозы в среде. Экспрессия yddG в этих условиях не зависела от уS-РНК полимеразы.

С помощью сконструированных гибридных белков YddG-LacZ и YddG-ZsGreen экспериментально доказана локализация YddG в цитоплазматической мембране E. coli. Построена топологическая модель YddG. Экспериментально показано наличие у YddG 10 ТМ и расположение N- и C-концов в цитоплазме. С помощью флуоресцентной микроскопии установлено, что YddG локализуется на полюсах клетки.

В результате замены природной регуляторной области yddG на эффективную регуляторную область оптимизирована экспрессия гена yddG в клетках продуцентов фенилаланина. Генетические конструкции с повышенной экспрессией гена yddG введены в штаммы-продуценты ароматических аминокислот, которые используются в биотехнологическом производстве.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК, и 1 патентная заявка.

Материалы диссертации докладывались на конкурсе работ сотрудников ЗАО «АГРИ» (июнь 2007), были представлены на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008) и Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008).

Диссертация апробирована на совместном заседании секций «Молекулярная биология» и «Генетика микроорганизмов» Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика» и Научно-технического совета НИИ «Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ») 5 октября 2010 г.

Благодарности. Автор искренне признателен к.б.н. Айрих Л.Г. за сотрудничество и практическую помощь в методологии исследования YddG. Автор благодарит д.б.н., проф. Миронова А.С. (ФГУП «ГосНИИгенетика») за оказанное содействие в постановке экспериментов по определению стартовой точки транскрипции; д.б.н., доцента Феофанова А.В. и Воронцову О.В. (Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова) за помощь при проведении флуоресцентной микроскопии клеток E. coli. Автор признателен также к.б.н. Казаковой С.М. и Кулагиной Ю.В. (ЗАО «АГРИ») за содействие в проведении культивирований штаммов-продуцентов в ферментерах.

Особую благодарность автор выражает своему руководителю к.б.н., доценту Дорошенко В.Г., а также д.б.н., проф. Машко С.В., способствовавшему выполнению данной диссертационной работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на _____ страницах, включая _____ рисунков и ____ таблиц. Список литературы содержит _____ цитируемых источников, в том числе _____ на русском языке.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы и среды. Все штаммы E. coli, использованные в работе, были получены на основе MG1655 (F-, л-, rph-1) или BW25113 (lacIq rrnBT14 lacZWJ16 hsdR514 ?araBA-DAH33 ?rhaBADLD78). Штаммы выращивали на средах известного состава (Sambrook and Russell, 2001): LB, SOB или минимальной среде М9 с глюкозой (0.4%) или глицерином (0.8%) в качестве источников углерода и добавлением при необходимости L-аминокислот (5 мМ). Для плотных сред использовали агар (1.5%). Антибиотики добавляли в концентрациях (мкг/мл): хлорамфеникол (Cm) - 25, ампициллин (Ap) - 100, тетрациклин (Tc) - 12.5.

Конструирование штаммов. Все модификации (делеции, инсерции, замены) хромосомы были выполнены прецизионно с помощью Red системы фага (Datsenko and Wanner, 2000) и удаляемого in vivo маркера CmR (ген cat), находящегося в составе фрагмента attL-cat-attR (Doroshenko et al., 2007). При делетировании генов сохраняли рамку считывания.

Этапы получения гибридного гена yddG'-lacZ схематично представлены на Рис. 1. В клетки MG1655lacZ PL-yddG интегрировали lacZ таким образом, что в полученной конструкции гибридного гена yddG'-lacZ к первым 15 нуклеотидам yddG была присоединена последовательность lacZ без ATG-кодона. Для отбора клонов, содержащих интегрированные в хромосому фрагменты, использовали как маркер CmR, так и ген левансахаразы Bacillus subtilis sacB. Последний маркер, ген которого находился под контролем промотора лактозного оперона E. coli (Plac), позволял отбирать замещающие его целевые фрагменты ДНК на среде с сахарозой (20%).

Условия культивирования и определение фенилаланина в культуральной жидкости. Аэробное культивирование штаммов-продуцентов фенилаланина проводили в ферментерах Biostat Q (1 л, BBI, Германия) в 0.3 л среды: 50 г/л глюкозы, 0.6 г/л (NH4)2SO4, 0.6 г/л KH2PO4, 10 мг/л FeSO4, 10 мг/л MnSO4, 2 г/л дрожжевого экстракта и 125 мг/л тирозина. Клетки культивировали при 37єС, уровень pH 6.7 поддерживали добавлением NH4OH. Посевные культуры (0.03 л) выращивали в 0.75 л колбах в среде LB с перемешиванием (240 об/мин). Концентрацию фенилаланина в культуральной жидкости определяли с помощью ВЭЖХ.



Рис. 1. Схема получения гена гибридного белка YddG-LacZ в хромосоме E. coli: a. Замещение регуляторной области гена yddG на PL-RBSlacZ; б. Замещение гена yddG на yddG'-lacZ; в. Интеграция cat-sacB вместо attB-PL, селекция колоний CmR; г. Замещение cat-sacB на исходную регуляторную область yddG, отбор колоний на среде с сахарозой.

Культивирование в пробирках штаммов-продуцентов фенилаланина проводили аэробно (240 об/мин) при 34єС в течение ~26 ч (до истощения глюкозы) в среде следующего состава: 40 г/л глюкозы, 2 г/л дрожжевого экстракта, 16 г/л (NH4)2SO4, 0.6 г/л KH2PO4, 10 мг/л FeSO4, 8 мг/л MnSO4, 30 г/л CaCO3 и 125 мг/л тирозина. Концентрация фенилаланина в среде определялась с помощью тонкослойной хроматографии.

Конструирование рекомбинантных плазмид. Для определения стартовой точки транскрипции ген yddG с собственной регуляторной областью (280 п.н.) клонировали в многокопийной плазмиде pMDV3 (репликон pUC). Фрагмент ДНК для клонирования получали с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК штамма MG1655 и специально сконструированные праймеры. Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды, были устойчивы к L-фенилаланину (30 мг/мл).

Для получения плазмиды pMW118-tyrR (репликон pSC101) ген tyrR с собственной регуляторной областью (150 п.н.) амплифицировали с помощью ПЦР с хромосомной ДНК штамма MG1655.

Для получения плазмиды pBRyddG-blaM ген гибридного белка Plac-yddG-blaM клонировали в pBR322. Предварительно фрагмент ДНК Plac-yddG-blaM был сконструирован с помощью перекрывающейся ПЦР. Фрагменты ДНК, содержащие полноразмерный ген yddG или промотор Plac, амплифицировали с хромосомной ДНК штамма MG1655. Фрагмент ДНК, содержащий ген blaM, а также ген ZsGreen (см. ниже) амплифицировали с ДНК плазмиды pZsGreen (Clontech).

Для конструирования плазмид pBRyddG'-blaM, содержащих укороченные варианты гена yddG, между генами yddG и blaM на плазмиде pBRyddG-blaM были предусмотрены сайты рестрикции NcoI и SacI. Для получения таких плазмид ДНК pBRyddG-blaM обрабатывали рестриктазами NcoI и SacI, в результате чего между генами yddG и blaM образовывался разрыв с 5'- и 3'-выступающими концами ДНК. Далее использовали эндонуклеазу III, которая гидролизовала одну цепь ДНК только с 5'-выступающего конца. Чтобы получить различные делеционные варианты, отбирали аликвоты с интервалом 45 сек (при 30єC), обрабатывали S1 нуклеазой и проводили достройку выступающих концов ДНК с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli и лигирование.

Для конструирования плазмид pBRyddG-ZsGreen, в которых варианты кодирующей области yddG заданной длины были соединены с полноразмерным ZsGreen, фрагменты ДНК Plac-yddG'-ZsGreen получали с помощью перекрывающейся ПЦР.

Структуры всех полученных плазмид были подтверждены с помощью секвенирования.

Манипуляции с ДНК и РНК, включая определение стартовой точки транскрипции (primer extension) проводили согласно руководству (Sambrook and Russell, 2001). Концентрацию РНК определяли, измеряя отношение абсорбции при 260/280 нм.

Определение активности в-галактозидазы проводили с использованием О-нитрофенил-в-D-галактопиранозида (Sigma) в качестве субстрата (Миллер, 1976). Измеренная активность клеточных экстрактов приведена в единицах Миллера (ЕМ).

Определение устойчивости клеток TG1 (pBRyddG'-blaM) к ампициллину. Клетки выращивали в среде LB до середины логарифмической фазы (3Ч108 кл/мл), затем отмывали свежей средой и высевали на агаризованную среду LB, содержащую 0, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 мкг/мл Ap и 1 мМ ИПТГ (100-400 клеток на чашку).

Измерение флуоресценции. Флуоресценцию клеток штамма E. coli TG1 (pBRyddG'-ZsGreen) определяли, выращивая клетки в среде LB до середины логарифмической фазы (3Ч108 кл/мл) в присутствии 1 мМ ИПТГ. Измерение флуоресценции белка ZsGreen проводили с помощью спектрофлуорофотометра Synergy 2 (BioTek Instruments, Inc., USA).

Выделение фракции мембранных белков. Мембранные фракции выделяли согласно протоколу Rouanet & Nasser (2001). Для растворения полученных мембранных белков добавляли Triton X-100 до концентрации 2% и инкубировали 1 ч при 4єС. Концентрацию белка определяли по Bradford (1976).

Иммуноблоттинг. Белки разделяли в 0.1% ДСН - 12% ПААГ и переносили на PVDF-мембрану с помощью Trans-Blot SD semidry transfer cell (Bio-Rad). В качестве первичных антител использовали мышиные анти-в-лактамазные (Abcam) и анти-RCFP (Clontech) антитела. В качестве вторичных антител использовали анти-мышиные и анти-кроличьи коньюгаты с щелочной фосфатазой (Sigma) соответственно.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Микрофотографии клеток штамма E. coli TG1 были получены с помощью микроскопа LSM510 META (Carl Zeiss) с водно-иммерсионным объективом 63Ч/1.2 NA C-Apochromat. Флуоресценция детектировалась с помощью оптического ответвителя HFT UV/488/543/633 через фильтр LP505.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Изучение регуляции гена yddG

1.1. Картирование промотора гена yddG

Картирование промотора и определение старта транскрипции yddG было проведено методом «удлинения олигонуклеотидной затравки» (primer extension). Синтезированную в клетках РНК выделяли из логарифмически растущих бактерий штамма TG1 (pMDV3-yddG) и использовали ее для определения старта транскрипции. В соответствии с полученными экспериментальными данными (Рис. 2 а) старту транскрипции (+1) соответствовал T в положении «_36» относительно предполагаемого ATG-кодона yddG. Относительно точки «+1» были обнаружены близкие к каноническим области «extended_10» и «-35» с расстоянием между этими участками 18 нуклеотидов.

Анализ регуляторной области yddG позволил предположить низкую эффективность экспрессии этого гена и накопление небольших количеств соответствующего белкового продукта в клетке. Действительно, 1) в районе старта расположено два нуклеотида Т подряд, что могло приводить к снижению эффективности инициации и появлению транскриптов, несущих дополнительную гомополимерную структуру случайной длины на 5'-конце молекулы мРНК («слиппадж-эффект») (Xiong and Reznikoff, 1993). Этот эффект, действительно, наблюдался экспериментально. На электрофореграмме выше зоны основного транскрипта были видны дополнительные минорные зоны (Рис. 2 б). 2) Перед инициирующим кодоном yddG на допустимом расстоянии присутствовал лишь динуклеотид AG, способный выполнять функцию SD-последовательности (для генов E. coli более характерна SD длиной от 3 до 9 нуклеотидов (Lewin, 2004)), что позволяло предполагать низкую эффективность инициации трансляции yddG.



Рис. 2 а. Регуляторная область гена yddG. Жирным шрифтом обозначены: «_10» и «_35» участки, старт транскрипции, SD-последовательность, ATG-кодон. Над последовательностью показана область, замещенная на attB, при делетировании промотора PyddG; б. Определение сайта инициации транскрипции методом «удлинения олигонуклеотидной затравки». кДНК синтезирована на основе препарата РНК, взятого в концентрации 1, 2, 3, 4 мкг/мкл (дорожки 1, 2, 3, 4 соответственно).

1.2. Получение гена гибридного белка YddG-LacZ в хромосоме E. coli

Для исследования экспрессии гена yddG in vivo в месте его природной локализации в хромосоме E. coli осуществили конструирование гена гибридного белка - YddG-LacZ. Первоначально предполагалось интегрировать lacZ вместо дистальной части гена yddG (после 15 нуклеотида) непосредственно в клетках MG1655?lacZ с последующим отбором колоний, растущих на минимальной среде с лактозой в качестве единственного источника углерода. Однако, селективно отобрать такие колонии не удалось. Предполагая, что они могли не образоваться из-за низкого уровня экспрессии yddG'-lacZ под контролем промотора PyddG, интеграцию повторили в штамме MG1655?lacZ PL-RBSlacZ-yddG. Требуемая конструкция была отобрана и получен штамм MG1655?lacZ PL-RBSlacZ-yddG'-lacZ (Рис. 1 а, б).

Далее регуляторная область PL-RBSlacZ была замещена на фрагмент ДНК, содержащий гены cat (CmR) и sacB, кодирующий левансахаразу Bacillus subtilis (Рис. 1 в). В этом случае устойчивость к хлорамфениколу, кодируемая первым геном, использовалась для селекции интеграции фрагмента, а второй ген - для последующего удаления фрагмента в результате контрселекции клеток, сохраняющих ген sacB в хромосоме при росте на среде с 20% сахарозой. В результате последующей интеграции фрагмента ДНК, содержащего PyddG, был сконструирован штамм MG1655?lacZ yddG'-lacZ, содержащий ген гибридного белка на месте yddG дикого типа (Рис. 1 г). Штамм MG1655?lacZ yddG'-lacZ, несмотря на тестируемую активность в-галактозидазы ~100 ЕМ (см. ниже), не рос на среде с лактозой в качестве единственного источника углерода.

1.3. Активность промотора yddG in vivo при росте штамма MG1655 ?lacZ yddG'-lacZ на лабораторных средах LB и M9

Экспрессия yddG'-lacZ была проанализирована с помощью определения активности в-галактозидазы при росте клеток MG1655?lacZ yddG'-lacZ в LB и M9 с добавлением глюкозы и глицерина. В качестве контрольного штамма в этих экспериментах использовали MG1655?lacI PlacI-lacZ, в котором в результате делеции гена lacI и регуляторной области гена lacZ кодирующая область lacZ была подставлена под конститутивный промотор гена lacI, активность которого зависела только от уровня РНК-полимеразы в клетке (Lewin, 2004). Штаммы по ростовым характеристикам не отличались друг от друга (Рис. 3 а).

Активность в-галактозидазы не зависела от фазы роста (Рис. 3 б). Исследованные штаммы отличались соотношениями этих активностей на разных средах. Тем не менее, различия в активностях для обоих штаммов на разных средах составляли не более 40%, поэтому можно было сделать вывод о конститутивной экспрессии yddG в тестированных условиях.

Рис. 3. Активность в-галактозидазы при росте клеток MG1655?lacZ yddG'-lacZ и MG1655?lacI PlacI-lacZ на средах LB (), М9 с глюкозой () или глицерином (): а. Оптическая плотность; б. Относительная активность в-галактозидазы (%). 100% активности для MG1655?lacZ yddG'-lacZ и MG1655?lacI PlacI-lacZ соответствует 120 ЕМ и 500 ЕМ. Здесь и далее приведены средние результаты трех опытов, доверительные интервалы не превышают 5%. ген аминокислота клетка культивирование

Для подтверждения того, что экспрессия yddG'-lacZ происходит с идентифицированного промотора PyddG, он был прецизионно делетирован в штамме MG1655?lacZ yddG'-lacZ (Рис. 2 а). В клетках нового штамма MG1655?lacZ ?PyddG-yddG'-lacZ, выращенных на средах LB, M9 с глюкозой или глицерином, активность в-галактозидазы была ниже порога регистрации (<10 ЕМ).

1.4. Изучение влияния транскрипционного регулятора CRP на экспрессию yddG'-lacZ

Как было установлено выше, экпрессия yddG'-lacZ, выраженная в активности в-галактозидазы, была выше на среде с глюкозой (Рис. 3), следовательно, комплекс cAMP-CRP мог участвовать в регуляции экспрессии гена yddG. Для проверки этого предположения мы сравнили активности в-галактозидазы в штамме MG1655?lacZ yddG'-lacZ и его ?crp и ?cyaA-вариантах (Рис. 4). В обоих мутантах наблюдалось небольшое снижение активности LacZ (~20%). Кроме того, при добавлении в среду культивирования штамма MG1655?lacZ yddG'-lacZ ?cyaA (не способного образовывать cAMP) 10 мМ cAMP активность LacZ не изменялась. Следовательно, был сделан вывод, что ген yddG не находится под контролем глобального регулятора CRP.

Рис. 4. Активность в-галактозидазы (ЕМ) при росте MG1655?lacZ yddG'-lacZ (к) и его ?crp и ?cyoA-производных на среде LB.

1.5. Изучение влияния глобального регулятора Lrp на экспрессию yddG'-lacZ

Для генов rhtB, rhtC, leuE, кодирующих другие известные экспортеры аминокислот E. coli, была показана зависимость их экспрессии от глобального регулятора Lrp (Закатаева и др., 2006). Для исследования влияния Lrp на экспрессию yddG мы сравнили активности в-галактозидазы в штамме MG1655?lacZ yddG'-lacZ и его ?lrp-варианте (Рис. 5).

Известно, что экспрессия ранее исследованных генов, кодирующих экспортеры аминокислот, снижалась или увеличивалась в lrp--мутантах в несколько раз (Кутукова и др., 2005; Kutukova et al., 2005). Активность в-галактозидазы в наших lrp+ и lrp- штаммах существенно не изменилась (? ~ 5%). Добавление в среду лейцина - эффектора Lrp, который мог бы усилить или ослабить эффект Lrp, не оказало влияния на активность репортерного белка. Следовательно, белок Lrp не участвует в регуляции гена yddG.



Рис. 5. Активность в-галактозидазы (ЕМ) при росте MG1655?lacZ yddG'-lacZ (к) и его ?lrp-производного на среде М9 с глюкозой без L-лейцина и в его присутствии. Черные, серые и белые столбцы - 3, 6, 8 часов.

1.6. Экспрессия yddG при росте MG1655?lacZ yddG'-lacZ в присутствии некоторых аминокислот

С целью выявления индуктора экспрессии гена yddG анализировали влияние добавления аминокислот в среду М9, использованную для роста клеток MG1655?lacZ yddG'-lacZ, на активность в-галактозидазы. В качестве контроля использовали штамм MG1655?lacI PlacI-lacZ с конститутивным синтезом LacZ (Рис. 6).

Рис. 6. Активность в-галактозидазы клеток MG1655?lacZ yddG'-lacZ и MG1655?lacI PlacI-lacZ (серые и белые столбцы соответственно)

при культивировании в среде М9 с глюкозой в присутствии L-аминокислот (5мМ). 100% активности для MG1655?lacZ yddG'-lacZ и MG1655?lacI PlacI-lacZ соответствует 120 и 260 ЕМ.

Активность в-галактозидазы для yddG'-lacZ увеличивалась только в присутствии фенилаланина на ~15%, и метионина - на ~10%. Для уточнения этих результатов активность в-галактозидазы была проанализирована в динамике при росте клеток обоих штаммов на среде М9 с фенилаланином или метионином и без них. (Рис. 7, 8).

Рис. 7. Активность в-галактозидазы (%) при росте MG1655?lacZ yddG'-lacZ (а) и MG1655?lacI PlacI-lacZ (б) на среде М9 с глюкозой. Светлые символы - оптическая плотность, черные символы - активность в-галактозидазы: () - без добавок, () - в присутствии 5мМ L-фенилаланина. 100% активности для MG1655?lacZ yddG'-lacZ и MG1655?lacI PlacI-lacZ соответствует 120 и 260 ЕМ.

Как видно из Рис. 7, добавление фенилаланина в среду замедляло рост () обоих штаммов c 0.4 ч-1 до 0.3 ч-1. На этом фоне активность в-галактозидазы MG1655?lacI PlacI-lacZ оставалась практически неизменной, в то время как для MG1655?lacZ yddG'-lacZ она была достоверно выше в присутствии фенилаланина на этапе поздней логарифмической фазы роста клеток. Добавление метионина увеличивало активность в-галактозидазы как в штамме MG1655?lacZ yddG'-lacZ, так и в контрольном штамме MG1655?lacI PlacI-lacZ, но на меньшую величину ~10%. Возможно, эффект добавления метионина был вызван глобальным перераспределением молекул РНК-полимеразы в клетке.



Рис. 8. Относительная активность в-галактозидазы (%) при росте MG1655?lacZ yddG'-lacZ (а) и MG1655?lacI PlacI-lacZ (б) на среде М9 с глюкозой. Светлые символы - оптическая плотность, черные символы - активность в-галактозидазы: () - без добавок, () - в присутствии 5 мМ L-метионина. 100% активности для MG1655?lacZ yddG'-lacZ и MG1655?lacI PlacI-lacZ соответствует 120 и 260 ЕМ.

1.7. Изучение влияния TyrR на экспрессию yddG'-lacZ

Посредником влияния фенилаланина на экспрессию гена yddG мог быть регулятор синтеза ароматических аминокислот - TyrR. Для выяснения роли TyrR в регуляции экспрессии гена yddG сравнили активности в-галактозидазы в штамме MG1655?lacZ yddG'-lacZ и его ?tyrR-варианте (Рис. 9 а, б). Активность была одинаковой (~120 ± 5 ЕМ), но только в штамме MG1655?lacZ yddG'-lacZ она увеличивалась в присутствии 5 мМ фенилаланина (145 ± 5 ЕМ). Отсутствие эффекта добавления фенилаланина в штамме ?tyrR могло указывать на прямое участие TyrR в регуляции транскрипции yddG. Предполагая, что это влияние может быть усилено за счет амплификации гена tyrR, специально сконструированную плазмиду pMW118-tyrR, трансформировали в штамм MG1655?lacZ yddG'-lacZ. Однако, активность в-галактозидазы практически не изменилась (~150 ЕМ) (Рис. 9 в), тогда как трансформация плазмидой pMW118-tyrR штамма MG1655?lacZ yddG'-lacZ ?tyrR привела к повышению активности в-галактозидазы по сравнению со штаммом, содержащим pMW118.

Как видно из Рис. 9, добавление фенилаланина замедляло рост штаммов TyrR+, но не TyrR-. Возможно, влияние добавления фенилаланина на экспрессию yddG могло быть обусловлено возникновением общей стрессовой ситуации в клетке, приводящей к замедлению скорости роста.

Рис. 9. Относительная активность в-галактозидазы (%) при росте MG1655?lacZ yddG'-lacZ (а), MG1655?lacZ yddG'-lacZ ?tyrR (б) и MG1655?lacZ yddG'-lacZ (pMW118-tyrR) (в) на среде М9 с глюкозой. Светлые символы - оптическая плотность, черные символы - активность в-галактозидазы: () - без добавок, () - в присутствии 5мМ L-фенилаланина. 100% активности соответствует 120 ЕМ.

1.8. Влияние скорости роста клеток на экспрессию yddG

Предположение о влиянии ингибирования роста, обусловленного стрессовым воздействием, на экспрессию yddG было проверено путем добавления в среду культивирования высоких концентраций NaCl. Действительно, в среде LB + 0.6 М NaCl (м = 0.42 ч-1) наблюдалась повышенная ~ в 2 раза, по сравнению со средой LB (м = 0.8 ч-1), экспрессия yddG'-lacZ в штамме MG1655?lacZ yddG'-lacZ (Рис. 10 а). В то же время добавление NaCl в среду М9 увеличивало уровень экспрессии yddG'-lacZ в этом же штамме всего на 20% (Рис. 10 б). Влияние стресса, приводящего к снижению скорости роста, на экспрессию yddG было исследовано на среде с высоким содержанием сахарозы. При выращивании штаммов MG1655?lacZ yddG'-lacZ и MG1655?lacI PlacI-lacZ на среде LB в присутствии 30% сахарозы скорости роста обоих штаммов одинаково снижались по сравнению с ростом на среде LB, с 0.8 ч-1 до 0.24 ч-1. При этом активность в-галактозидазы в клетках MG1655?lacZ yddG'-lacZ увеличивалась в ~5 раз, а в штамме MG1655?lacI PlacI-lacZ - в ~2.5 раза (Рис. 11).

Рис. 10. Влияние добавления NaCl на уровень экспрессии гена yddG при росте MG1655?lacZ yddG'-lacZ на средах LB (а) и М9 с глюкозой (б). Столбцы - активность в-галактозидазы (ЕМ): белые - без добавок, серые - в присутствии 0.6 М NaCl; линии - оптическая плотность: () - без добавок, () - в присутствии 0.6 М NaCl.

Рис. 11. Влияние добавления 30% сахарозы на уровень экспрессии гена yddG при росте штаммов MG1655?lacZ yddG'-lacZ (а) и MG1655?lacI PlacI-lacZ (б) на среде LB.

Столбцы - активность в-галактозидазы (%): белые - без добавок, серые - в присутствии 30% сахарозы; линии - оптическая плотность: () - без добавок, () - в присутствии 30% сахарозы. 100% активности для MG1655?lacZ yddG'-lacZ и MG1655?lacI PlacI-lacZ соответствует 70 и 560 ЕМ.

Таким образом, при снижении скорости роста клеток, обусловленном стрессовым воздействием, наблюдалось возрастание активности репортера.

1.10. Экспрессия yddG'-lacZ в штаммах RpoS+ и RpoS-

Известно, что при снижении скорости роста в клетках E. coli накапливается уS (Lange and Hengge-Aronis, 1991). Возможно, возрастание уровня экспрессии гена yddG при снижении скорости роста связано с тем, что в этих условиях транскрипция осуществляется комплексом РНК полимеразы с уS. Для проверки этого предположения был сконструирован штамм MG1655?lacZ yddG'-lacZ ?rpoS. Однако, кинетика активности в-галактозидазы в обоих штаммах при замедлении скорости роста, обусловленном стрессовым воздействием, а именно добавлением в среду L-фенилаланина или 0.6 М NaCl не отличалась друг от друга. Вероятно, повышение уровня экспрессии при снижении скорости роста не связано с участием уS-субъединицы РНК-полимеразы.

2. Структурные исследования YddG как интегрального мембранного белка

2.1. Топологическая модель YddG, предлагаемая в экспериментах in silico

Первичной характеристикой мембранного белка является его гидрофобный профиль, определяемый, в частности, с помощью алгоритма Kyte & Doolittle (1982) (Рис. 12).

Рис. 12. Профиль гидрофобности белка YddG «с окном в 9 а.о.».

Топологическая модель YddG, рассчитанная на основе доступных через Интернет компьютерных программ (TopPredII (Claros and von Heijne, 1994), TMHMM 2.0 (Krogh et al., 2001), TM Finder (Deber et al., 2001), TMpred (Hoffman and Stoffel, 1993), SOSUI (Hirokawa et al., 1998), TOPCONS (Bernsel et al., 2009)), состояла из 9 или 10 ТМ сегментов (Рис. 13).

Различия в предсказании количества ТМ сегментов касались С-концевой части белка (после 240 а.о.). Таким образом, по предсказаниям in silico YddG состоял из 9 или 10 ТМ сегментов.

Рис. 13. Предсказание топологии YddG с использованием компьютерных программ. Серые прямоугольники соответствуют ТМ сегментам, места «слияния» с репортерными белками BlaM и ZsGreen обозначены сплошной и пунктирной линиями соответственно.

2.2. Конструирование и анализ yddG'-blaM гибридов

Картирование сегментов YddG, локализующихся в периплазме, проводили с помощью получения гибридов YddG с в-лактамазой, кодируемой геном blaM. в-лактамаза придает клеткам высокую устойчивость к ампициллину только при локализации в периплазме.

Для конструирования, так называемых, «случайных» гибридов yddG'-bla, первоначально получили плазмиду pBRyddG-blaM. С этой целью в вектор pBR322 под контролем Plac промотора клонировали ген yddG (без стоп-кодона) таким образом, чтобы он образовал трансляционный гибрид с геном blaM (без лидерной последовательности). В присутствии ИПТГ в среде культивирования (от 0.1 до 1 мМ), эта рекомбинантная плазмида сообщала штамму E. coli TG1 устойчивость к Ap (до ~10 мкг/мл) и к фенилаланину (до 20 мг/мл). Повышенная устойчивость к фенилаланину свидетельствовала о функциональной активности YddG, как экспортера ароматических аминокислот (Doroshenko et al., 2007). В то же время наблюдавшийся низкий уровень устойчивости клеток к Ap мог свидетельствовать о цитоплазматической локализации BlaM, прикрепленного к C-концу полноразмерного белка YddG. Таким образом, эти результаты согласовывались с полученными ранее данными о цитоплазматической локализации С'-конца YddG (Rapp et al., 2004).

Структурную часть гена yddG укорачивали на плазмиде pBRyddG-blaM случайным образом, как описано в Материалах и Методах. Полученные in vitro рекомбинантные плазмиды были трансформированы в клетки E. coli TG1 и отобраны независимые клоны на среде с Tc. В результате из 500 TcR клонов, выросших на агаризованной среде LB, содержащей 1 мМ ИПТГ и 50 мкг/мл Ap, было отобрано около 100 ApR клонов. Известно, что клетки, содержащие функциональную в-лактамазу в периплазме растут при 50 мкг/мл Ap (Rouanet and Nasser, 2001). Рекомбинантные плазмиды из 12 клонов были секвенированы в области «слияния» генов yddG и BlaM.

Области соединения YddG с BlaM располагались по всей длине исходного YddG и группировались в пяти участках, соответствующих периплазматическим областям YddG или прилегающим к ним районам согласно топологической модели с 10 ТМ сегментами. Ни один из укороченных гибридов YddG-BlaM не придавал клеткам E. coli устойчивости к фенилаланину.

Уровень устойчивости к Ap для полученных 12 гибридов находился в пределах от 75 до 200 мкг/мл (Рис. 14). Более низкая устойчивость к Ap, 75 мкг/мл, соответствовала гибридам Val21, Tyr85 и Lys218, с точками присоединения BlaM в TM сегментах I, III и VIII. Более высокая устойчивость, 200 и 150 мкг/мл, соответствовала гибридам Gly30 и Ser265, где BlaM локализовался в периплазматических петлях между ТМ сегментами I и II, а также IX и X. Таким образом, были подтверждены экспериментально наличие этих периплазматических петель и, соответственно, локализация N- и C-концов белка YddG в цитоплазме. Полученная топологическая модель YddG согласовывалась с «правилом положительного заряда» (von Heijne, 1988) (рис. 14).

Рис. 14. Модель топологии YddG в мембране, построенная на основе свойств YddG-BlaM гибридов, профиля гидрофобности, c учетом «правила положительного заряда».

Места присоединения репортерных белков BlaM и ZsGreen к N-концевым фрагментам YddG обозначены стрелками и прямоугольниками соответственно. Цифры внутри стрелок означают номер аминокислотного остатка и уровень устойчивости к Ap (мкг/мл), цифры внутри прямоугольников - уровень флуоресценции (%). Расположение заряженных аминокислотных остатков Asp, Glu обозначено «-», Arg, Lys - «+».

2.3. Иммунодетекция YddG-BlaM гибридов

Для подтверждения того, что различие в уровне экспрессии yddG'-blaM гибридов не исказило интерпретацию результатов топологического анализа, нами был проведен количественный анализ содержания YddG-BlaM в экстрактах мембранных фракций с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител к в-лактамазе (Рис.15).

Рис. 15. Вестерн блоты YddG-BlaM гибридов.

1 - Ser271; 2 - Ser265; 3 - Lys218; 4 - Gln206; 5 - Ile148; 6 - Asp146; 7 - Gly142; 8 - Glu94; 9 - Tyr85; 10 - Tyr41; 11 - Gly30; 12 - Val21; к (контроль) - клеточный экстракт TG1 (pBR322). Растворимые белки мембранных фракций (100 мкг) были разделены с помощью ДСН-электрофореза в 12% ПААГ. Гибридные белки визуализированы с помощью иммуноблоттинга с моноклональными антителами к в-лактамазе.

В отличие от растворимого белка (в данном случае в-лактамазы), гибриды YddG-BlaM, как гидрофобные белки, обладали большей электрофоретической подвижностью в ДСН-электрофорезе в 12% ПААГ. Тем не менее, относительные размеры созданных в работе гибридов соответствовали ожидаемым структурам.

Как видно из рис. 15, все исследуемые гибриды синтезировались примерно с одинаковой эффективностью. Таким образом, различия в устойчивости к Ap у клеток, содержащих разные гибриды (Рис.14), могли быть обусловлены различной локализацией соответствующих белков в бактериальной мембране.

2.4. Конструирование и анализ YddG'-ZsGreen гибридов

Для подтвреждения топологии YddG, установленной с помощью гибридов YddG-BlaM, провели картирование сегментов YddG, локализующихся в цитоплазме с помощью репортерного белка ZsGreen. Все конструкции генов гибридных белков yddG'-ZsGreen, включая конструкцию, кодирующую полноразмерный YddG, были получены с помощью перекрывающейся ПЦР. Точки присоединения ZsGreen к фрагментам укороченного белка YddG были выбраны с целью подтверждения наличия у YddG четырех цитоплазматических петель (согласно модели с 10 ТМ сегментами). Две точки (Gln59 и Pro61) были выбраны между ТМ сегментами II и III, точка Lys117 - между ТМ сегментами IV и V, точка Arg181 - между ТМ сегментами VI и VII и точка Leu238 - между ТМ сегментами VIII и IX. Три точки Val247, Tyr250 и Pro253, расположенные в ТМ сегменте IX, были спланированы для подтверждения сложного профиля гидрофобности в этой части белка (Рис. 14). Гибриды с точками присоединения ZsGreen к Glu94 и Gln206 YddG соотвествовали двум ранее полученным гибридам YddG-BlaM с установленной периплазматической локализацией С-концевого домена были отрицательными контролями. В результате получили 11 конструкций yddG'-ZsGreen, включая и конструкцию с полноразмерным YddG.

Наиболее интенсивный сигнал флуоресценции, принятый за 100%, наблюдали для гибрида Gly293, содержащего полноразмерный YddG (Рис. 14). Плазмида, содержащая этот ген гибридного белка, придавала клеткам E. coli устойчивость к фенилаланину до 20 мг/мл в присутствии 1 мМ ИПТГ в отличие от плазмид, содержащих гены гибридов с укороченным YddG.

Низкий уровень флуоресценции (~3%) наблюдался у клеток, синтезировавших гибриды с локализацией ZsGreen в периплазме (Glu94 и Gln206), являвшихся отрицательными контролями. Остальные YddG-ZsGreen гибриды обеспечивали флуоресценцию клеток с интенсивностью 20-30%, что в 10 раз превосходило уровень отрицательного контроля. Следовательно, ZsGreen в этих гибридах имел цитоплазматическую локализацию.

Гибриды Val247, Tyr250 и Pro253 обеспечивали флуоресценцию с большим разбросом в значении величин (17, 37 и 27%, соответственно). Поэтому нельзя было исключить сложный характер топологии YddG в IX ТМ сегменте. Однако, разброс в уровне флуоресценции в 10% был зарегистрирован и для гибридов Gln59, Pro61, где ZsGreen присоединялся к YddG в двух близкорасположенных точках первой цитоплазматической петли (см. Рис. 14). На основании этих результатов мы сделали вывод, что «тонкую» топологию отдельных участков YddG, вероятно, следует определять более совершенными способами, чем использованный в работе метод конструирования генов гибридных белков.

2.5. Иммунодетекция YddG-ZsGreen гибридов

Гибриды YddG-ZsGreen тестировали в экстрактах белков из мембранных фракций с помощью вестерн-блоттинга с антителами к флуоресцентным белкам рифовых кораллов. Как видно из рис. 16, подвижности всех исследуемых гибридов относительно друг друга соответствовали ожидаемым размерам полипептидов. Причем, гибриды YddG-ZsGreen, с локализацией репортерного белка в цитоплазме, детектировались примерно с одинаковой интенсивностью, тогда как гибриды Glu94 и Gln206, в которых ZsGreen предположительно экспортировался в периплазму, обнаруживались в следовых количествах. По-видимому, вследствие неправильного фолдинга ZsGreen в периплазме большая часть гибридного белка подвергалась действию протеолитических ферментов (Feilmeier et al., 2000).

Рис. 16. Вестерн блоты гибридных белков YddG-ZsGreen.

1 - Gly293; 2 - Pro253; 3 - Tyr250; 4 - Val247; 5 - Leu238; 6 - Gln206; 7 - Arg181; 8 - Lys117; 9 - Glu94; 10 - Pro61; 11 - Gln59; к (контроль) - клеточный экстракт TG1 (pZsGreen). Белки мембранных фракций клеток TG1 (pBRyddG-ZsGreen), нанесенные по 50 мкг на дорожки 1-5 и по 100 мкг - на дорожки 6-11, были разделены с помощью ДСН-электрофореза в 12% ПААГ. Гибриды визуализировали с помощью иммуноблоттинга с поликлональными антителами к флуоресцентным белкам рифовых кораллов (anti-RCFP).

На основании совокупного анализа гибридов YddG-BlaM и YddG-ZsGreen показана мембранная локализация YddG и построена топологическая модель YddG с 10 ТМ сегментами.

2.6. Определение внутриклеточной локализации YddG-ZsGreen гибридов

Использование ZsGreen в качестве белка-репортера позволило исследовать внутриклеточную локализацию гибридов YddG-ZsGreen с помощью флуоресцентной микроскопии. Несколько плазмид, кодирующих гибриды YddG-ZsGreen (Lys117, Arg181, Gln206, Leu238), а также вариант с полноразмерным YddG (Gly293), трансформировали в клетки TG1. В качестве контролей использовали клетки TG1, содержащие pZsGreen и pBR322. Клетки всех плазмидных штаммов выращивали в LB-среде в присутствии ИПТГ для индукции синтеза гибридных белков и использовали для флуоресцентной микроскопии. Как видно из представленных результатов (Рис. 17), флуоресцентные сигналы детектировали на полюсах клеток, синтезирующих гибридные белки Gly293, Lys117, Arg181 и Leu238. При этом, как правило, флуоресценция была ярче на старом полюсе клетки (Рис. 17 а). В популяции присутствовали также клетки с практически одинаковой интенсивностью флуоресценции на обоих полюсах (Рис. 17 г). Флуоресценция не наблюдалась в клетках, содержащих гибрид Gln206, с картированной периплазматической локализацией ZsGreen-домена (Рис. 17 д). Клетки контрольных штаммов имели ожидаемый характер флуоресценции: TG1 (pBR322) не давали флуоресцентного сигнала (Рис. 17 в), а в TG1 (pZsGreen) свечение было равномерным по объему клетки (Рис. 17 б).



Рис. 17. Локализация YddG-ZsGreen гибридов в клетках E. coli TG1: pBR-YddG(Gly293)-ZsGreen (а); pZsGreen (б); pBR322 (в); pBR-YddG(Arg181)-ZsGreen (г); pBR-YddG(Gln206)-ZsGreen (д). Шкала 5 мкм. Конфокальные флуоресцентные микрофотографии (левая панель) и микрофотографии в проходящем свете (правая панель).

3. Влияние сверхэкспрессии yddG на продукцию фенилаланина

3.1. Замена регуляторной области гена yddG

С целью оптимизации экспрессии yddG мы провели замену области природной регуляции этого гена на две искусственные, интегрированные независимо. Это были комбинации сильного промотора PL фага или его ослабленного варианта, обозначенного PL**, с участком связывания рибосом гена lacZ (RBSlacZ). Штаммы BW25113, BW25113 PL**-yddG и BW25113 PL-yddG имели различающиеся в сторону увеличения уровни устойчивости к фенилаланину (Рис. 18 а). Препараты тотальной РНК, выделенные из клеток штаммов BW25113, BW25113 PL**-yddG и BW25113 PL-yddG, тестировали с помощью ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), на присутствие мРНК yddG. Препарат РНК из BW25113 PL-yddG образовал более интенсивную полосу в агарозном геле после ОТ-ПЦР, чем препарат РНК из BW25113 PL**-yddG. При этом, наличие мРНК yddG в штамме с интактным геном визуально не регистрировалось (Рис. 18 б). Таким образом, различие в устойчивости к фенилаланину коррелировало с разными уровнями тестируемой мРНК.



Рис. 18 Характеристика штаммов BW25113 (), BW25113 PL**-yddG () и BW25113 PL-yddG () по уровню устойчивости к L-фенилаланину (а) и ОТ-ПЦР на мРНК yddG (б).

Введение PL**-yddG или PL-yddG в штамм MG1655tyrA ?tyrR привело к увеличению конверсии глюкозы в L-фенилаланин (~ 1.5 раза) только в случае PL-yddG (Табл. 1).

Таблица 1. Влияние уровня экспрессии гена yddG на накопление L-фенилаланина в культуральной жидкости при культивировании в ферментерах.

Штамм	Аллель yddG	Конверсия глюкозы в L-фенилаланин, %
MG1655 tyrA tyrR	ген yddG дик. типа	1.6
MG1655 tyrA tyrR PL-yddG	PL-yddG	2.4

3.2. Эффект сверхэкспрессии yddG в штаммах-продуцентах на продукцию фенилаланина

При первоначальной характеристике YddG как экспортера ароматических аминокислот было показано, что повышение экспрессии YddG увеличивает продукцию фенилаланина, тирозина и триптофана для продуцентов с небольшой активностью (Doroshenko et al., 2007). Эти продуценты были сконструированы на основе MG1655 по единому принципу: у каждого из них на фоне дерепрессии общего ароматического пути (tyrR) были инактивированы пути образования альтернативных ароматических аминокислот. Очевидно, что в таких продуцентах снижение внутриклеточной концентрации аминокислоты могло активировать соответствующий фермент биосинтеза, ингибируемый этой аминокислотой. Так, в биосинтезе фенилаланина такими ферментами являлись ДАГФ-синтаза (AroG) и хоризмат мутаза-префенат дегидратаза (PheA). Мы проверили эффект сверхэкспрессии yddG для продуцента фенилаланина DV269 (MG1655 tyrA), содержащего гены aroG4 и pheAB, интегрированные в хромосому с помощью mini-Mu, которые кодировали устойчивые к фенилаланину ферменты. Были получены изогенные производные этого штамма, различающиеся как по количеству копий гена aroG4, так и аллелями гена yddG. К исходной копии гена aroG4mini-Mu, находящейся под контролем собственного промотора добавляли копию aroG4 под контролем промотора Pho-регулона, PpstS. В отличие от собственного промотора этого гена, проявлявшего максимальную активность во время роста клеток, промотор PpstS активировался в условиях лимитации по фосфору. Действительно, в условиях лимитации по фосфору штаммы 3 и 4, содержащие PpstS-aroG4, синтезировали больше фенилаланина, чем их изогенные варианты 1 и 2, не содержащие PpstS-aroG4 (Табл. 2). С другой стороны, штаммы 1 и 3, 2 и 4 отличались наличием «молчащего» и активированного гена yddG: htrE::(PT7-yddG) и htrE::(PL-yddG). В обоих случаях дополнительная копия гена yddG была интегрирована в несущественный для продукции фенилаланина ген htrE, но в первом случае перед геном был «молчащий» в отсутствии полимеразы бактериофага Т7 промотор, а во втором случае - промотор PL фага .

Таблица 2. Влияние аллельного состояния гена yddG на продукцию фенилаланина изогенными производными штамма DV269

№ штамма	aroG4	yddG	OD540	L-Phe, г /л
1	aroGwt aroG4mini-Mu	yddGwt htrE::(PT7-yddG)	21±1	2.7±0.1
2	aroGwt aroG4 mini-Mu	yddGwt htrE::(PL-yddG)	18±1	3.8±0.2
3	aroGwt::(PpstS-aroG4) aroG4 mini-Mu	yddGwt htrE::(PT7-yddG)	17±1	5.8±0.3
4	aroGwt::(PpstS-aroG4) aroG4 mini-Mu	yddGwt htrE::(PL-yddG)	17±1	6.7±0.1

Как видно из Табл. 2, продукция фенилаланина у исходного штамма с одной копией aroG4 была выше на ~30% в присутствии PL-yddG. У более активного штамма DV269 (?tyrA PpstS-aroG4) продукция была выше на ~15% в присутствии PL-yddG. Очевидно, что вторая копия aroG4 под контролем промотора PpstS стабилизировала продукцию фенилаланина, но даже на фоне этого активный экспорт фенилаланина из клетки повышал активность штамма.

ВЫВОДЫ

1. Локализован промотор и определена точка инициации транскрипции yddG в клетках E. coli K-12. С использованием LacZ в качестве репортера показано, что yddG экспрессируется на низком уровне, который увеличивается при снижении скорости роста бактерий, индуцированном стрессовыми воздействиями (уровень активации в 1.2-5 раз при изменениях м~1.2-3 ч-1). Эта активация экспрессии не зависит от активности известных регуляторов (CRP, Lrp, TyrR) и комплекса РНК полимеразы с S, а, возможно, обусловлена общим изменением спектра транскрибируемых генов в неблагоприятных для роста бактерий условиях.

2. С использованием репортерных белков избирательно активных в периплазме или цитоплазме (-лактамазы и ZsGreen) экспериментально доказана локализация YddG в цитоплазматической мембране E. coli. Определена топология YddG: показаны наличие 10 ТМ сегментов и локализация его N и C-концов в цитоплазме. Для бактериальных экспортеров аминокислот E. coli экспериментально подтвержденная топология получена впервые. C помощью флуоресцентной микроскопии c использованием гибридных белков YddG-ZsGreen определена локализация YddG на полюсах клетки E. coli.

3. Обеспечено увеличение экспрессии гена yddG в результате замены его нативной регуляторной области на более сильный промотор PL, и участок связывания рибосом RBSlacZ. Показано, что повышение уровня экспрессии yddG приводит к увеличению накопления фенилаланина штаммами-продуцентами. Конструкции, повышающие экспрессию yddG, введены в штаммы-продуценты аминокислот, которые используются в биотехнологическом производстве.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Имаизуми А., Айрих Л.Г., Дорошенко В.Г., Цыренжапова И.С. Способ получения L-аминокислоты // Патентная заявка РФ №2008133840, 2008.

2. Цыренжапова И.С., Дорошенко В.Г., Айрих Л.Г., Миронов А.С., Машко С.В. Ген yddG Escherichia coli, кодирующий потенциальный экспортер ароматических аминокислот: конститутивная транскрипция и зависимость уровня экспрессии от скорости роста клеток // Генетика. 2009. Т. 45. №5. С.601-609.

3. Airich L.G., Tsyrenzhapova I.S., Vorontsova O.V., Feofanov A.V., Doroshenko V.G., Mashko S.V. Membrane topology analysis of the Escherichia coli aromatic amino acid efflux protein YddG // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2010. V.18. P.189-197.

4. Doroshenko V.G., Tsyrenzhapova I.S., Krylov A.A., Kiseleva E.M., Ermishev V.Y., Kazakova S.M., Biryukova I.V., Mashko S.V. Pho regulon promoter-mediated transcription of the key pathway gene aroG (Fbr) improves the performance of an L-phenylalanine-producing Escherichia coli strain // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V.88. P.1287-1295.

Размещено на Allbest.ru