Сравнительное исследование влияния изменения внеклеточной концентрации ионов Ca2+ на электрические характеристики командных нейронов обученных и сенситизированных улиток

Размещено на http://allbest.ru

Казанский физико-технический институт КазНЦ РАН

Сравнительное исследование влияния изменения внеклеточной концентрации ионов Ca²⁺ на электрические характеристики командных нейронов обученных и сенситизированных улиток

Гайнутдинова Т.Х., Андрианов В.В., Силантьева Д.И.

Кальций - один из наиболее распространенных ионов в живых организмах. Ионы кальция, поступающие внутрь клетки во время ее возбуждения, с одной стороны приводят к изменению свойств ионных каналов мембраны, а с другой стороны служат сигналами для активации различных биохимических реакций.

Таким образом, ионы Ca²⁺, осуществляя связь между электрическими явлениями, происходящими в поверхностной мембране клетки, и реакциями, протекающими внутри нейрона, принимают непосредственное участие в интегративной деятельности нервной клетки [Костюк П.Г. 1986: 3; Berridge M.J. 1998: 7; Blackwell K.T., Alkon D.L. 1999: 8; Зефиров А.Л., Ситдикова Г.Ф. 2002: 2; Verkhratsky A. 2005: 14].

Биохимический механизм такого запуска состоит из двух основных звеньев: во-первых, поступающие в клетку во время ее возбуждения ионы Ca² взаимодействуют со специфическими нейронными белками, кальмодулином и тропонином С; во-вторых, комплексы Ca²⁺-белок взаимодействуют со специфическими энзиматическими системами, обеспечивающими фосфорилирование других белков, непосредственно участвующих в выполнении соответствующей клеточной функции [Brini M., Carafoli E. 2000: 9; Rizzuto R. et al. 2002: 12; Rusakov D.A. 2006: 13].

Известно, что одним из эффектов воздействия высокой внеклеточной концентрации ионов Ca²⁺ является стабилизация мембраны [Николс и др., 2003: 5]. Было установлено, что повышение концентрации этих ионов не изменяет величину потенциала покоя и в то же время значительно увеличивает критический уровень деполяризации.

В результате такого сочетания пороговый потенциал и, соответственно пороговая сила тока, повышаются в прямой зависимости от концентрации ионов Ca²⁺ [Ходоров Б.И. 1975: 6].

Ранее нами было показано [Гайнутдинов и др., 1998], что в командных нейронах оборонительного рефлекса виноградной улитки при выработке условного оборонительного рефлекса и долговременной сенситизации происходит снижение мембранного и порогового потенциалов. Поэтому представлялось интересным проследить, как будут меняться эти параметры нейронов у интактных, обученных и сенситизированных животных при изменении концентрации кальция в омывающем растворе в сравнительном аспекте.

В экспериментах использовались половозрелые особи виноградной улитки Helix lucorum, однородные по весу и размеру. Моллюсков содержали небольшими группами (по 15 - 25 особей) в стеклянных террариумах, при комнатной температуре, высокой влажности и избытке пищи.

До начала эксперимента улитки не менее двух недель находились в активном состоянии. Вырабатывался классический условный оборонительный рефлекс на постукивание по раковине. В качестве условного стимула использовали постукивание по раковине, которое в норме практически не вызывало оборонительной реакции.

Безусловным стимулом служил дувок струи воздуха в отверстие легочной полости, что приводит к безусловной оборонительной реакции закрытия пневмостома. Интервал между сочетаниями стимулов был 2-4 мин., время между предъявлениями условного и безусловного стимулов - 1 сек. В эксперименте регистрировалось закрытие пневмостома в ответ на постукивание по раковине.

Долговременную сенситизацию (ДС) оборонительного рефлекса вырабатывали по следующей схеме: животным предъявляли электрические стимулы в область головы 4 раза в день в течение 4-х дней с интервалом в 1,5-2 часа. Длительность каждого стимула составляла 1/2 с. Ток имел следующие характеристики: прямоугольные импульсы тока амплитудой 6-8 мА, длительностью 10 мс, частотой 50 Гц.

Критерием выработки ДС служило значительное увеличение времени закрытого состояния пневмостома в ответ на предъявление тестирующего раздражения по сравнению с исходной реакцией.

Для электрофизиологических экспериментов использовался препарат изолированной центральной нервной системы улитки. Перед приготовлением препарата животные охлаждались в холодной воде со льдом в течение 20-30 минут. Измерения проводились при комнатной температуре (20-22 ^оС) с применением внутриклеточных стеклянных микроэлектродов, имеющих сопротивление 5 - 40 МОм и заполненных 2.5М KCl.

В ходе эксперимента регистрировали потенциал покоя, амплитуду потенциала действия, критический уровень деполяризации и порог генерации потенциала действия. Анализ электрических характеристик проводили на командных нейронах оборонительного поведения ЛПа3, ППа3, ЛПа2, ППа2. Регистрация биопотенциалов производилась при помощи АЦП- преобразователей непосредственно на компьютер.

Результаты статистически обрабатывались с применением t-критерия Стъюдента. В статье приведены средние значения измеряемых величин и стандартные ошибки среднего (M ± SEM).

Для изменения внеклеточной концентрации кальция использовались следующие растворы:

1. Обычный физиологический растрор для улиток:

NaCl-80mM, KCl-4mM, CaCl₂-10mM, MgCl₂-5mM, NaHCO₃-5mM.

2. Раствор с уменьшенным в 2 раза содержанием кальция:

NaCl-80mM, KCl-4mM, CaCl₂-5mM, MgCl₂5mM, NaHCO₃-5mM.

3. Раствор с уменьшенным в 4 раза содержанием кальция:

NaCl-80mM, KCl-4mM, CaCl₂-2,5mM, MgCl₂-5mM, NaHCO₃-5mM.

4. Раствор с увеличенным в 2 раза содержанием кальция:

NaCl-80mM, KCl-4mM, CaCl₂-20mM, MgCl₂5mM, NaHCO₃-5mM.

Исследование влияния изменения концентрации кальция в окружающем растворе на электрические характеристики командных нейронов в наших экспериментах показало, что значение мембранного потенциала при различных концентрациях ионов Ca²⁺ не меняется ни в группе интактных улиток, ни в группе обученных улиток, ни в группе сенситизированных улиток. Значения порового потенциала при вариации внеклеточного Ca²⁺ достоверно изменяются во всех трех группах (рис. 1).

Рис. 1. Влияние различных концентраций ионов Ca²⁺ во внеклеточной среде (C, мМ) на пороговый (Vt, мВ) потенциал у интактных улиток (контроль), обученных (УОР) и сенситизированных (ДС) улиток. Значение К - 10 мМ - физиологический раствор

У интактных и сенситизированных улиток порог генерации потенциалов действия увеличивается при повышении концентрации ионов Ca²⁺ от 2,5мМ до 20мМ, что свидетельствует об эффекте стабилизации мембраны. В то же время у улиток после выработки условного оборонительного рефлекса (УОР) пороговый потенциал изменяется иначе - при повышении концентрации Ca²⁺ наблюдается совершенно другая, колоколообразная зависимость (рис. 1).

В опытах на гигантских аксонах кальмара было установлено, что повышение внеклеточной концентрации Ca²⁺ не изменяет потенциал покоя и в то же время значительно смещает критический уровень деполяризации в положительную сторону [Frankenhaeuser B. et al. 1957: 10; Ходоров 1975: 6]. Такая зависимость критического уровня деполяризации характерна и для нейронов улитки [Kostyuk P.G. 1984: 11].

Для того, чтобы возник потенциал действия в данных условиях, требуется большая деполяризация мембраны. В этом проявляется эффект стабилизации мембраны, суть которого состоит в том, что ионы Ca²⁺ связываются отрицательными фиксированными зарядами на наружной стороне мембраны, поэтому повышение внеклеточной концентрации ионов Ca²⁺ приводит к снижению общего наружного отрицательного заряда и как следствие - к увеличению отрицательного потенциала, действующего на ионные каналы. Сами по себе эти фиксированные заряженные группировки не должны вносить прямой вклад в измеряемый мембранный потенциал, что определяется их малой плотностью на мембране [Костюк П.Г., Крышталь О.А. 1981: 4]. Однако в комбинации с диффузионными потенциалами они могут изменять внутримембранное электрическое поле, которое определяет потенциалзависимую активацию ионной проводимости мембраны [Николлс и др. 2003: 5]. мембрана белок клетка кальций нейрон

Предполагая, что при обучении может меняться конформация мембранных белков, а вследствие этого может изменяться и наружный отрицательный заряд, мы попытались применить воздействие, влияющие на величину этого фиксированного заряда мембраны.

В настоящей работе на интактных улитках мы также показали, что повышение внеклеточной концентрации ионов Ca²⁺ ведет к увеличению значения порогового потенциала и смещению величины критического уровня деполяризации в сторону положительных значений в применении к командным нейронам оборонительного поведения. Это свидетельствует о снижении возбудимости этих нейронов, которое происходит при «стабилизации» мембраны.

Однако нами было обнаружено, что возбудимость плазматической мембраны нейронов обученных улиток повышается при увеличении внеклеточной концентрации ионов Ca²⁺, хотя у интактных улиток повышение внеклеточной концентрации ионов Ca²⁺ ведет к стабилизации мембраны. Таким образом, нами обнаружено, что у обученных улиток пропадает эффект «стабилизации» мембраны. По-видимому, при обучении величина наружного отрицательного заряда уменьшается, возможно вследствие изменения конформации мембранных макромолекул, и в результате этого снимается стабилизирующий эффект ионов Ca²⁺.

Таким образом, полученные нами результаты при сопоставлении с данными, полученными на обученных улитках, показывают, что механизмы двух моделей пластичности (ассоциативное обучение и долговременная сенситизация) сильно отличаются друг от друга. Можно высказать предположение, что при обучении общее количество наружного отрицательного заряда уменьшается, и поэтому «стабилизирующий» эффект ионов Ca²⁺ не проявляется. В экспериментах же на сенситизированных улитках эффект ионов кальция как стабилизатора мембраны остается, несмотря на то, что ассоциативное обучение и сенситизация имеют одинаковую динамику изменения мембранного и порогового потенциалов.

Список литературы

1. Гайнутдинов Х. Л. Электрические характеристики командных и моторных нейронов при выработке условного оборонительного рефлекса и формирования долговременной сенситизации у улиток / Х. Л. Гайнутдинов,

2. В. В. Андрианов, Т. Х. Гайнутдинова, Е. А. Тарасова // Журн. высш. нервн. деят. - 1998. - Т. 48. - № 6. - С. 1004-1013. Зефиров А. Л. Ионные каналы нервного окончания / А. Л. Зефиров, Г. Ф. Ситдикова // Успехи физиол. наук. - 2002. - Т. 33. - № 4. - С. 3-33.

3. Костюк П. Г. Кальций и клеточная возбудимость / П. Г. Костюк. - М.: Наука, 1986. - 255 с.

4. Костюк П. Г. Механизмы электрической возбудимости нервной клетки / П. Г. Костюк, О. А. Крышталь. - М.: Наука, 1981. - 204 с.

5. Николлс Дж. Г. От нейрона к мозгу / Дж. Г. Николс, А. Р. Мартин, Б. Дж. Валлас, П. А. Фукс. - М.: УРСС, 2003. - 672 c.

6. Ходоров Б. И. Общая физиология возбудимых мембран. - М.: Наука, 1975. - 405 с.

7. Berridge M. J. Neuronal Calcium Signaling // Neuron. - 1998. - V. 21. - P. 13-26.

8. Blackwell K. T. Ryanodine Receptor Modulation of in Vitro Associative Learning in Hermissenda Crassicornis / K. T. Blackwell, D. L. Alkon // Brain Res. - 1999. - V. 822. - № 1. - P. 114-125.

9. Brini M. Calcium Signaling: A Historical Account, Recent Developments and Future Perspectives / M. Brini, E. Carafoli // Cell.

10. Mol. Life. Sci. - 2000. - № 57. - P. 354-370.

11. Frankenhaeuser B. The Action of Calcium on the Electrical Properties of Squid Axon / B. Frankenhaeuser, A. L. Hodgkin // J. Physiol. - 1957. - V. 137. - P. 218-244.

12. Kostyuk P. G. Intracellular Perfusion of Nerve Cells and Its Effects on Membrane Currents / P. G. Kostyuk // Physiol. Rev. 1984. - V. 64. - № 2. - P. 435-454.

13. Rizzuto R. Microdomains of Intracellular Ca²⁺: Molecular Determinants and Functional Consequences / R. Rizzuto, T. Pozzan // Physiol. Rev. - 2006. - V. 86. - P. 369-408.

14. Rusakov D. A. Ca²⁺-dependent Mechanisms of Presynaptic Control at Central Synapses // The Neuroscientist. - 2006. - V. 12. - № 4. - P. 317-326.

15. Verkhratsky A. Physiology and Pathophysiology of the Calcium Store in the Endoplasmic Reticulum of Neurons / A. Verkhratsky // Physiol. Rev. - 2005. - V. 85. - P. 201-279.

Размещено на Allbest.ru