Исследование противоопухолевой активности никлозамида и комбинированных воздействий с его использованием

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ И.М. СЕЧЕНОВА

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

(СЕЧЕНОВСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ)

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ НИКЛОЗАМИДА И КОМБИНИРОВАННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

03.01.04 - Биохимия

Автореферат

Жирник Александр Сергеевич

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Москалёва Елизавета Юрьевна

Москва 2018

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рост заболеваемости и смертности от онкологических заболеваний обуславливает необходимость поиска способов повышения эффективности химиотерапии и лучевой терапии злокачественных новообразований. Полагают, что использование препаратов, действующих не просто на опухолевые клетки, а на клетки с фенотипом множественной лекарственной устойчивости, позволит предотвратить прогрессирование заболевания (Islam et al., 2015). Для пролонгирования действия и снижения неспецифической токсичности гидрофобных противоопухолевых препаратов разрабатываются технологии включения их в полимерные частицы субмикронных размеров (Nie et al., 2007). Актуальной проблемой при этом остаётся изучение механизма действия препаратов в полимерной форме, включая изучение возможности интернализации полученных частиц в опухолевые клетки. Перспективным способом повышения эффективности лучевой терапии представляется использование новых малотоксичных радиосенсибилизаторов, повышающих чувствительность опухолевых клеток к действию излучения (Ding et al., 2013; Kumar et al., 2016). Результаты исследований последних лет указывают на то, что лекарственный препарат никлозамид, использующийся в медицине как антигельминтное средство более 50 лет, обладает высокой противоопухолевой активностью в отношении различных видов злокачественных новообразований (Li et al., 2014). Установлено, что в основе цитотоксического действия никлозамида на опухолевые клетки может лежать нарушение функциональной активности митохондрий и ингибирование ряда сигнальных путей, однако, механизмы действия препарата на опухолевые клетки изучены недостаточно. Более того, имеются лишь ограниченные данные о радиосенсибилизирующей активности никлозамида в отношении опухолевых клеток (You et al., 2014; Yin et al., 2016) и возможности его использования для усиления действия применяемых в клинике противоопухолевых препаратов (Chen et al., 2017).

В связи с этим, целью настоящей работы явилось изучение противоопухолевой активности никлозамида в свободной и полимерной форме и изучение радиосенсибилизирующего действия никлозамида на культурах клеток человека и мыши.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи: никлозамид клетка колоректальный рак

1. изучение цитотоксической активности никлозамида в отношении опухолевых и нормальных клеток человека

2. характеристика фенотипа клеток колоректального рака (КРР) человека и изучение действия никлозамида на опухолевые клетки человека с фенотипом множественной лекарственной устойчивости

3. изучение цитотоксической активности полимерной формы никлозамида (ПФН) в отношении опухолевых и нормальных клеток человека

4. изучение цитотоксической активности цисплатина в комбинации с никлозамидом и ПФН в отношении клеток меланомы мыши

5. изучение закономерностей накопления биосовместимых биодеградируемых полимерных частиц клетками КРР человека

6. изучение молекулярных механизмов действия никлозамида в свободной и полимерной форме в отношении клеток КРР человека

7. изучение механизмов радиосенсибилизирующего действия никлозамида в отношении клеток КРР человека

Научная новизна работы. Впервые показано, что клетки меланомы и КРР человека с фенотипом множественной лекарственной устойчивости, обусловленным высоким уровнем экспрессии белка MDR1, чувствительны к действию никлозамида. Впервые показана более высокая по сравнению с никлозамидом цитотоксическая активность ПФН в отношении клеток КРР человека. Впервые показано аддитивное действие цисплатина и никлозамида в свободной и полимерной форме в отношении клеток меланомы мыши. Показана интернализация полимерных частиц опухолевыми клетками. Впервые установлено, что молекулярный механизм противоопухолевого действия никлозамида в свободной и полимерной форме в отношении клеток КРР человека одинаков и связан с развитием окислительного стресса, вызванного повреждением митохондрий. Впервые обнаружено, что никлозамид проявляет радиосенсибилизирующее действие в отношении клеток КРР человека, в основе которого лежит ингибирование репарации двунитевых разрывов ДНК.

Практическая значимость исследования. Важное практическое значение имеют новые данные о противоопухолевой активности никлозамида в отношении широкого спектра опухолевых линий клеток. Показана высокая цитотоксическая активность никлозамида в свободной и полимерной форме в отношении опухолевых клеток и низкая токсичность в отношении нормальных клеток. Показана активность никлозамида в качестве радиосенсибилизатора. Полученные результаты являются основой для проведения доклинических и клинических исследований противоопухолевой и радиосенсибилизирующей активности никлозамида в свободной и полимерной форме.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на XIII, XIV и XV Курчатовской междисциплинарной молодёжной научной школе (Москва, 2015, 2016, 2017), VI Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2015), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов - 2016» (Москва, 2016), Международном научно-практическом форуме «Ядерные технологии на страже здоровья» (Москва, 2016).

Публикации. Основное содержание диссертации представлено в 10 публикациях, в том числе в 3 статьях в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Личный вклад автора. Автором самостоятельно проведен анализ отечественной и зарубежной литературы по изучаемой теме и выполнена основная часть экспериментов, осуществлены статистическая обработка полученных данных и обсуждение результатов исследования, сформулированы выводы и оформлена диссертационная работа. Автор благодарит коллег за предоставление полимерной формы никлозамида и флуоресцентно меченых полимерных наночастиц.

Основные положения работы:

1. никлозамид обладает цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток человека, значительно меньшей в отношении нормальных клеток

2. никлозамид эффективно действует на опухолевые клетки человека, экспрессирующие белки MDR-1 и Bcl-2, определяющие множественную лекарственную устойчивость

3. использование никлозамида в полимерной форме позволяет повысить его активность в отношении опухолевых клеток без изменения токсичности в отношении нормальных клеток

4. комбинированное использование никлозамида в свободной и полимерной форме и цисплатина повышает эффективность действия препаратов в отношении клеток меланомы мыши

5. уровень накопления биосовместимых биодеградируемых полимерных частиц в клетках КРР человека зависит от концентрации частиц и продолжительности инкубации и достигает максимальных значений через 1-4 часа в зависимости от типа клеток

6. механизм цитотоксического действия ПФН и никлозамида в отношении клеток КРР человека одинаков и связан с развитием окислительного стресса, вызванного повреждением митохондрий

7. никлозамид обладает радиосенсибилизирующей активностью в отношении клеток КРР человека, в основе которой лежит ингибирование репарации двунитевых разрывов ДНК

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Культивирование клеток различных перевиваемых линий. Клетки меланомы человека линий Mel-8, Mel-10, MS, аденокарциномы ободочной кишки линии Caco-2, карциномы сигмовидной кишки линии COLO 320 HSR, аденокарциномы прямой кишки линии SW837, мелкоклеточного рака лёгкого линии H69, клетки меланомы мыши линии B16, а также нормальные клетки - клетки почки эмбриона человека линии HEK293 и лёгочные эмбриональные фибробласты человека линии ЛЭЧ - культивировали в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки плодов крупного рогатого скота (СПК) и 50 мкг/мл гентамицина в пластиковых культуральных флаконах в CO₂-инкубаторе при 37°C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂.

Анализ выживаемости клеток методом МТТ-теста. Выживаемость опухолевых и нормальных клеток после инкубации с никлозамидом и ПФН в течение 72 ч оценивали с помощью МТТ-теста по методу Mosmann с использованием раствора МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид) в концентрации 1 мг/мл в среде для культивирования клеток. После развития окраски (через 2-4 часа инкубации) среду удаляли, кристаллы формазана растворяли в 100 мкл ДМСО и измеряли интенсивность окраски по поглощению при 540 нм с помощью многоканального спектрофотометра iMark (Bio-Rad). Выживаемость клеток оценивали в процентах от их количества в контрольных пробах. Оптическая плотность полученного раствора при оценке колориметрическим методом пропорциональна количеству живых клеток. По полученным данным строили графики зависимости выживаемости клеток от концентрации препаратов и по ним рассчитывали значения IC₅₀ для характеристики чувствительности клеток к свободному препарату и к ПФН.

Анализ содержания белка MDR1 на мембране клеток. Клетки линий SW837 и COLO 320 HSR трижды промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), суспендировали в ФСБ, содержащем 3% СПК, в концентрации 1Ч10⁶/мл и инкубировали с антителами мыши, конъюгированными с фикоэритрином, в течение 60 мин при 4°С в темноте. Затем клетки отмывали ФСБ, содержащем 3% СПК. Долю окрашенных клеток и интенсивность флуоресценции фикоэритрина анализировали при длине волны возбуждения 488 нм и полосе пропускания 620 нм на проточном цитофлуориметре BD FACSCalibur (BD Biosciences). Для измерения использовали не менее 20 тыс. клеток на пробу. Изотипические антитела мыши, конъюгированные с фикоэритрином, использовали для получения отрицательного контроля.

Анализ содержания белка Bcl-2. Клетки линий SW837 и COLO 320 HSR промывали ФСБ, фиксировали в 2% растворе параформальдегида в течение 20 мин при комнатной температуре. Образцы хранили в ФСБ, содержащем 0,02% NaN₃, при 4°C до проведения измерений. Перед исследованием клетки пермеабилизировали с помощью ФСБ, содержащего 0,25% тритон X-100 и 2% БСА, в течение 30 мин при комнатной температуре, отмывали в ФСБ, содержащем 0,1% тритон X-100 и 10% СПК, инкубировали с первичными антителами мыши в течение 60 мин при комнатной температуре, отмывали и инкубировали со вторичными антителами козы к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с Alexa Fluor 488, в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем отмывали в ФСБ, содержащем 0,1% тритон X-100 и 10% СПК, и анализировали с использованием проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur (BD Biosciences) не менее 20 тыс. клеток на пробу. Вторичные антитела козы использовали для получения отрицательного контроля.

Получение и характеристика ПФН. Получение и характеристику препарата ПФН проводил коллектив химиков лаборатории клеточной биологии и молекулярной медицины НИЦ «Курчатовский институт» под руководством Е.А. Воронцова. Получение ПФН на основе сополимера молочной и гликолевой кислот с добавлением вспомогательных компонентов осуществляли методом эмульгирования в системе «масло/вода». Содержание никлозамида в ПФН, определённое методом ВЭЖХ, составило 5,2±0,4%. Средний размер полимерных частиц, определённый методом динамического светорассеяния с использованием анализатора частиц Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 (Malvern Instruments), составил 240,9±3,1 нм.

Анализ выживаемости опухолевых клеток при действии цисплатина в комбинации с никлозамидом и ПФН. Выживаемость клеток меланомы мыши линии B16 после инкубации с цисплатином (0,5 мг/мл раствор для инфузий «Цисплатин-ЛЭНС^®»), никлозамидом, ПФН и комбинациями препаратов в течение 72 ч оценивали с помощью МТТ-теста как описано ранее. Предварительно готовили общие растворы препаратов в концентрациях, кратных соответствующим значениям IC₅₀ и взятых в соотношении 2:1 для цисплатина и никлозамида или цисплатина и ПФН соответственно. Показатель аддитивности (combination index) рассчитывали по методу Chou and Talalay с помощью программы «CompuSyn» («ComboSyn») и по его величине судили о характере взаимодействия препаратов при их комбинированном применении (CI < 1, синергизм; CI = 1, аддитивное действие; CI > 1, антагонизм).

Получение и характеристика флуоресцентно меченых полимерных наночастиц. Получение и характеристику флуоресцентно меченных полимерных наночастиц (ФПН) проводил коллектив химиков лаборатории клеточной биологии и молекулярной медицины НИЦ «Курчатовский институт» под руководством Е.А. Воронцова. Получение ФПН на основе блок-сополимера поли(лактид-ко-гликолида) и полиэтиленгликоля с добавлением вспомогательных компонентов осуществляли стандартным методом нанопреципитации; в качестве флуоресцентной метки использовали флуоресцеин-5-изотиоцианат (ФИТЦ). Характеристика полученных ФПН приведена в таблице 1.

Таблица 1

Основные физико-химические характеристики ФПН.

Анализ накопления флуоресцентно меченых частиц опухолевыми клетками. По окончании инкубации с ФПН клетки снимали с подложки, центрифугировали, клеточный осадок отмывали дважды холодным ФСБ, ресуспендировали в изотоническом 0.013 М цитратном буфере (pH 4.0), инкубировали в течение 30 с на льду и измеряли интенсивность флуоресценции на проточном цитофлуориметре BD FACSCalibur (BD Biosciences) при длине волны возбуждения 488 нм и эмиссии 520 нм; анализировали по 10 тысяч клеток на пробу. Для количественного анализа внутриклеточной фракции ФПН к суспензии клеток в цитратном буфере добавляли трипановый синий в конечной концентрации 0.2 мг/мл, инкубировали в течение 30 с на льду и анализировали интенсивность флуоресценции на проточном цитофлуориметре в тех же условиях.

Исследование уровня повреждений митохондрий по снижению накопления родамина-123. После инкубации с никлозамидом и ПФН клетки центрифугировали и осадок ресуспендировали в тёплой бессывороточной среде в концентрации 1 млн/мл. К суспензии клеток добавляли родамин-123 (0,1 мкг/мл) и инкубировали в течение 30 мин при 37°C на водяной бане, периодически помешивая. Для контроля аутофлуоресценции 1 мл суспензии клеток оставляли в среде без родамина-123. Для исключения популяции мёртвых и погибающих клеток при цитофлуориметрии в пробу добавляли раствор йодистого пропидия (2 мкг/мл) непосредственно перед измерением. Флуоресценцию клеток измеряли с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur (BD Biosciences) при двух длинах волн в красной и зелёной области спектра, при длине волны возбуждения 488 нм и полосе пропускания для зелёной области спектра - 525 нм (FL1), а для красной - 620 нм (FL3), анализировали по 50 тыс. клеток на пробу.

Определение уровня активных форм кислорода. В культуре клеток культуральную среду заменяли на ФСБ, содержащий реагент для определения уровня внутриклеточных активных форм кислорода carboxy-H2DCFDA (10 мкМ), и инкубировали 30 мин в стандартных условиях. Маточный раствор carboxy-H2DCFDA в концентрации 10 мкг/мл в стерильном ДМСО готовили непосредственно перед использованием. По окончании инкубации клетки дважды промывали ФСБ с 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и измеряли их флуоресценцию с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur (BD Biosciences) при длине волны возбуждения 488 нм и полосе пропускания 525 нм (FL1), анализировали по 50 тыс. клеток на пробу.

Определение уровня митохондриального супероксидного аниона. Клетки дважды промывали ФСБ и инкубировали в свежеприготовленном рабочем растворе реагента для определения уровня митохондриального супероксидного аниона MitoSOX Red в ФСБ (5 мкМ) в течение 10 мин в стандартных условиях. Маточный раствор MitoSOX Red в концентрации 5 мМ готовили путём растворения содержимого одной ампулы (50 мкг) в 13 мкл стерильного ДМСО и хранили не более 1 месяца при -20°С. По окончании инкубации клетки дважды промывали ФСБ с 2% БСА и измеряли их флуоресценцию с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur (BD Biosciences) при длине волны возбуждения 488 нм и полосе пропускания 585 нм (FL2), анализировали по 50 тыс. клеток на пробу.

Анализ клеточного цикла с использованием йодистого пропидия. Клетки собирали, промывали ФСБ, фиксировали 70% этанолом (1 млн клеток/мл этанола) при 4°С в течение 1-2 ч и хранили до исследования при -20°С. Фиксированные клетки осаждали центрифугированием при 400 g, промывали ФСБ перед использованием. Осадок ресуспендировали в растворе для окрашивания ДНК (ФСБ, рН 7,4, содержащий 0,1% Тритон Х-100, 0,1 мМ ЭДТА, 0,05 мг/мл рибонуклеазы А, 50 мкг/мл йодистого пропидия) в концентрации 1 млн клеток/мл раствора и инкубировали 1-1,5 ч при комнатной температуре. Исходный раствор рибонуклеазы А предварительно кипятили на водяной бане в течение 10 мин, чтобы избавиться от возможной примеси дезоксирибонуклеаз. Анализ проводили с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur (BD Biosciences) при длине волны возбуждения 488 нм и эмиссии 620-700 нм. Долю клеток в состоянии апоптоза оценивали как фракцию гиподиплоидных клеток.

Облучение клеток. Клетки КРР человека линий SW837 и COLO 320 HSR облучали на установке «ГУТ-200М» (⁶⁰Co, 0,75 Гр/мин) при комнатной температуре в культуральной среде в дозе 2 Гр. Клетки облучали либо прикрепленными в культуральных планшетах (линия SW837), либо в суспензии в плотно закрытых пробирках (линия COLO 320 HSR). После облучения клетки помещали в СО₂-инкубатор и инкубировали необходимое время.

Анализ чувствительности опухолевых клеток к действию ионизирующего излучения в комбинации с никлозамидом. Клетки высевали в 12-луночные культуральные планшеты по 40 тыс. кл/лунку за сутки до исследования, инкубировали с никлозамидом в концентрации 2 мкМ в течение 24 ч и подвергали действию г-излучения в дозе 2 Гр при комнатной температуре. Через 1 час после облучения заменяли среду и продолжали культивирование клеток в течение 7 суток. Выживаемость определяли по количеству живых клеток в контрольных и опытных пробах с помощью камеры Горяева после окрашивания трипановым синим.

Анализ содержания в-катенина. Клетки высевали в 6 см чашки Петри в количестве 2Ч10⁶/чашку за сутки до исследования, инкубировали с никлозамидом в концентрации 2 мкМ в течение 4 часов и подвергали действию г-излучения в дозе 2 Гр. Через 24 часа после облучения эти клетки, а также контрольные клетки и клетки, обработанные никлозамидом в концентрации 2 мкМ, снимали с подложки, промывали ФСБ, фиксировали в 2% растворе параформальдегида в течение 20 мин при комнатной температуре. Образцы хранили в ФСБ, содержащем 0,02% NaN₃, при 4°C до проведения измерений. Перед исследованием клетки пермеабилизировали с помощью ФСБ, содержащего 0,25% тритон X-100 и 3% СПК, в течение 30 мин при комнатной температуре, отмывали и инкубировали с антителами мыши, конъюгированными с Alexa Fluor 488, в ФСБ, содержащем 3% СПК, в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем отмывали в ФСБ, содержащем 3% СПК, и анализировали с использованием проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur (BD Biosciences). Для измерения использовали не менее 20 тыс. клеток на пробу. Изотипические антитела мыши, конъюгированные с Alexa Fluor 488, использовали для получения отрицательного контроля.

Анализ содержания гистона гН2АХ. Клетки за сутки до исследования высевали в 3,5 см чашки Петри в количестве 500 тыс. кл/чашку, инкубировали с никлозамидом в концентрации 2 мкМ в течение 4 часов и подвергали действию г-излучения в дозе 2 Гр. Через 1 и 24 часа после облучения эти клетки, а также контрольные клетки и клетки, обработанные никлозамидом в концентрации 2 мкМ, снимали с подложки, промывали ФСБ и фиксировали в абсолютном метаноле при +4°С в течение 20 мин. Образцы хранили в абсолютном метаноле при -20°C до проведения измерений. Перед исследованием клетки отмывали от метанола, инкубировали с антителами мыши, конъюгированными с Alexa Fluor 488, в ФСБ, содержащем 3% СПК, в течение 60 мин при комнатной температуре, отмывали в ФСБ, содержащем 3% СПК, и анализировали с использованием проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur (BD Biosciences) не менее 20 тыс. клеток на пробу. Изотипические антитела мыши, конъюгированные с Alexa Fluor 488, использовали для получения отрицательного контроля.

Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «OriginPro» («OriginLab») с использованием однофакторного дисперсионного анализа и t-критерия Стьюдента. Данные представляли в виде средних значений и стандартной ошибки среднего. Достоверными считали различия при p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

1. Исследование цитотоксической активности никлозамида в отношении опухолевых и нормальных клеток человека

Анализ чувствительности опухолевых и нормальных клеток к действию никлозамида проводили с помощью МТТ-теста. Согласно полученным результатам, никлозамид эффективен в отношении различных линий опухолевых клеток, но менее токсичен в отношении нормальных клеток (табл. 2).

Таблица 2

Характеристика цитотоксической активности никлозамида в отношении опухолевых и нормальных клеток человека. Приведены средние значения IC₅₀ и стандартная ошибка среднего

* - отличия от линии ЛЭЧ достоверны, p<0,05; # - отличия от линии HEK293 достоверны, p<0,05

2. Характеристика фенотипа клеток КРР человека

Клетки КРР линий SW837 и COLO 320 HSR были охарактеризованы по уровню экспрессии ABC-транспортёра ABCB1 (MDR1) и Bcl-2. Обнаружен более высокий уровень экспрессии белка MDR1 в клетках карциномы сигмовидной кишки человека линии COLO 320 HSR, чем в клетках рака прямой кишки человека линии SW837 (рис. 1А,Б). В то же время, содержание белка Bcl-2 в клетках обеих линий было близким (рис. 1В,Г). Экспрессия белков MDR-1 и Bcl-2 в клетках исследованных линий может определять их устойчивость к повреждающим воздействиям.

Рис. 1 Экспрессия белков MDR1 (А,Б) и Bcl-2 (В,Г) в клетках КРР человека линий SW837 (A,В) и COLO 320 HSR (Б,Г). 1 - аутофлуоресценция, 2 - флуоресценция клеток, окрашенных соответствующими антителами. MFI - средняя интенсивность флуоресценции, усл. Ед

3. Исследование цитотоксической активности ПФН в отношении опухолевых и нормальных клеток человека

Анализ чувствительности опухолевых и нормальных клеток к действию ПФН проводили с помощью МТТ-теста. Показано, что ПФН обладает более высокой по сравнению с никлозамидом цитотоксической активностью в отношении клеток КРР человека и менее высокой в отношении лёгочных эмбриональных фибробластов человека (рис. 2). Необходимо отметить, что полимерные частицы, не содержащие никлозамид («пустые частицы»), практически не влияли на выживаемость клеток в диапазоне концентраций, соответствующих диапазону используемых концентраций ПФН: выживаемость клеток при концентрации «пустых частиц», равной даже 10 мкМ по никлозамиду, составляла не менее 85,2±8,4% от контроля.

Рис. 2 Влияние никлозамида (1) и ПФН (2) на выживаемость клеток аденокарциномы прямой кишки линии SW837 (А), аденокарциномы ободочной кишки линии Caco-2 (Б), карциномы сигмовидной кишки линии COLO 320 HSR (В) и лёгочных эмбриональных фибробластов человека (Г)

4. Исследование цитотоксической активности цисплатина в комбинации с никлозамидом в отношении клеток меланомы мыши

Обнаружено, что клетки меланомы мыши линии B16 чувствительны к действию цисплатина, никлозамида и ПФН: значение IC₅₀ составило 9,35±1,15 мкМ, 1,39±0,29 мкМ и 0,48±0,14 мкМ соответственно. Как показано на рис. 3А, при применении цисплатина в комбинации с никлозамидом наблюдается более глубокое снижение выживаемости опухолевых клеток в сравнении с цисплатином и никлозамидом по отдельности. Комбинированное применение цисплатина и ПФН также приводило к более интенсивной гибели клеток линии B16, чем при использовании каждого препарата по отдельности (рис. 3Б). Показатель аддитивности для комбинации цисплатина и никлозамида и комбинации цисплатина и ПФН составил 0,90 и 0,93 соответственно, что указывает на аддитивное действие препаратов при их комбинированном применении.

Рис. 3 Влияние никлозамида (А) и ПФН (Б) на эффективность действия цисплатина в отношении клеток меланомы мыши линии B16. 1 - цисплатин, 2 - никлозамид, 3 - комбинация цисплатина и никлозамида, 4 - ПФН, 5 - комбинация цисплатина и ПФН

5. Исследование закономерностей накопления флуоресцентно меченых полимерных частиц клетками КРР человека

Более высокая активность ПФН в сравнении с никлозамидом может быть связана с эффективным проникновением частиц через клеточную мембрану и созданием более высокой внутриклеточной концентрации никлозамида, благодаря его высвобождению в цитоплазме клеток. Поэтому далее были изучены закономерности накопления наночастиц на основе блок-сополимера поли(лактид-ко-гликолида) и полиэтиленгликоля в клетках КРР человека линий COLO 320 HSR и SW837. С помощью проточной цитофлуориметрии показано, что в течение 24 часов общее накопление ФПН пропорционально концентрации ФПН в среде и времени инкубации с опухолевыми клетками человека обеих исследованных линий (рис. 4). В то же время, доля частиц внутри клеток, в отличие от их общего накопления, достигает максимума уже через 1 час (линия COLO 320 HSR) и через 4 часа (линия SW837) и остаётся постоянной при дальнейшей инкубации (рис. 5), что приводит к снижению эффективности транслокации ФПН во внутриклеточные компартменты (рис. 6) и указывает на насыщаемость процесса интернализации данных частиц опухолевыми клетками.

Рис. 4 Общее накопление ФПН опухолевыми клетками человека линий COLO 320 HSR (А) и SW837 (Б) в зависимости от их концентрации через 1 ч (1), 4 ч (2) и 24 ч (3)

Рис. 5 Сравнение динамики общего накопления (1) флуоресцентно меченых полимерных наночастиц PLGA-PEG-FITC и их содержания внутри (2) опухолевых клеток человека линий COLO 320 HSR (А) и SW837 (Б) при концентрации частиц 2.5 мкМ по ФИТЦ

Рис. 6 Эффективность внутриклеточного накопления ФНП в опухолевых клетках линий COLO 320 HSR (А) и SW837 (Б) в зависимости от времени инкубации; концентрация ФПН составила 2,5 мкМ (1) и 5 мкМ (2) по ФИТЦ

6. Исследование молекулярного механизма действия никлозамида и ПФН в отношении клеток КРР человека различных линий

Показано, что действие никлозамида на клетки КРР человека линий Caco-2, SW837 и COLO 320 HSR приводит к повреждению митохондрий, регистрируемому по снижению накопления родамина-123 (рис. 7). Это сопровождается повышением уровня образования и общего количества активных форм кислорода, в особенности митохондриального супероксид-аниона (рис. 8). При инкубации клеток всех исследованных линий КРР с никлозамидом в относительно невысокой концентрации, равной 1 мкМ, было обнаружено увеличение доли клеток, находящихся в G₀/G₁-фазе (рис. 9). Важно отметить, что все обнаруженные изменения были более интенсивными при использовании ПФН.

Рис. 7 Динамика изменения уровня накопления флуоресцентного красителя родамина-123 в клетках аденокарциномы прямой кишки линии SW837 (1), аденокарциномы ободочной кишки линии Caco-2 (2) и карциномы сигмовидной кишки линии COLO 320 HSR (3) после инкубации клеток с никлозамидом (А) и с ПФН (Б) в концентрации 1 мкМ. * - отличия от контроля достоверны, p<0,05

Рис. 8 Изменение общего уровня активных форм кислорода, оцениваемого по накоплению флуоресцентного красителя carboxy-H2DCFDA (А-Г), и уровня митохондриального супероксид-аниона, оцениваемого по накоплению флуоресцентного красителя MitoSOX Red (Д-З), в клетках линии COLO 320 HSR после инкубации в течение 1 ч с никлозамидом, ПФН и «пустыми частицами». А, Д - контрольные клетки; Б, Е - клетки после инкубации с никлозамидом (1 мкМ); В, Ж - после инкубации с ПФН (1 мкМ); Г, З - после инкубации с «пустыми частицами». М1 - вся популяция клеток, М2 - фракция клеток, интенсивно накапливающих красители, указана доля этих клеток в процентах и их средняя интенсивность флуоресценции - MFI, усл. ед. Данные одного из трёх типичных экспериментов

Рис. 9 Гистограммы распределения клеток аденокарциномы прямой кишки линии SW837, аденокарциномы ободочной кишки линии Caco-2 и карциномы сигмовидной кишки человека линии COLO 320 HSR по фазам клеточного цикла через 24 ч культивирования в присутствии никлозамида и ПФН в концентрации 1 мкМ

7. Исследование радиосенсибилизирующего действия никлозамида в отношении клеток КРР

Обнаружено, что никлозамид вызывает гибель клеток КРР человека линий SW837 и COLO 320 HSR и усиливает действие г-излучения, о чём свидетельствует более глубокое снижение выживаемости опухолевых клеток при совместном действии г-излучения и никлозамида в сравнении с действием каждого из этих воздействий в отдельности (рис. 10).

Рис. 10 Влияние никлозамида (2 мкМ), г-излучения (2 Гр) и их комбинации на выживаемость клеток линий SW837 (А) и COLO 320 HSR (Б) через 7 суток после облучения. Данные представлены в процентах от контроля. * - отличия от контроля достоверны, р<0,05; & - отличия от действия никлозамида достоверны, р<0,05; # - отличия от действия г-излучения достоверны, р<0,05

По данным литературы, ингибирование сигнального пути Wnt/в-катенин является возможным механизмом радиосенсибилизирующего действия никлозамида в отношении клеток трижды негативного рака молочной железы. При комбинированном применении г-излучения и никлозамида в клетках линии COLO 320 HSR наблюдали более глубокое снижение уровня в-катенина в сравнении с действием г-излучения и никлозамида по отдельности; напротив, содержание в-катенина в клетках линии SW837 оставалось неизменным при действии никлозамида, облучения и их комбинации (рис. 11).

Рис. 11 Уровень в-катенина в клетках линий SW837 (А,В) и COLO 320 HSR (Б,Г). 1 - аутофлуоресценция; 2 - флуоресценция контрольных клеток; 3 - флуоресценция клеток при совместном действии г-излучения (2 Гр) и никлозамида (2 мкМ). MFI - средняя интенсивность флуоресценции, усл. ед. * - отличия от контроля достоверны, р<0,05; & - отличия от действия никлозамида достоверны, р<0,05; # - отличия от действия г-излучения достоверны, р<0,05

Известно, что никлозамид разобщает клеточное дыхание и окислительное фосфорилирование и приводит к снижению уровня АТФ в различных типах опухолевых клеток. Нами показано, что снижение уровня АТФ в свою очередь может приводить к ингибированию репарации двунитевых разрывов ДНК (ДР ДНК), образующихся при действии г-излучения. При действии г-излучения в дозе 2 Гр происходило увеличение уровня гистона гH2AX в 2,0 и 1,8 раз относительно фонового уровня в клетках линий SW837 и COLO 320 HSR соответственно через 1 час после облучения. В тоже время, через 24 часа уровень гистона гH2AX в облучённых клетках снижался до исходного значения, а в клетках, предварительно обработанных никлозамидом в концентрации 2 мкМ, уровень гH2AX оставался в 1,6 раза выше, чем в контрольных клетках (рис. 12).

Рис. 12 Уровень гистона гН2АХ в клетках линий SW837 (А) и COLO 320 HSR (Б) после действия никлозамида (2 мкМ), г-излучения (2 Гр) и их комбинации через 1 и 24 часа после облучения. Значение MFI в контроле составило 8,2 и 5,0 усл. ед. для клеток линий SW837 и COLO 320 HSR соответственно. Данные представлены в процентах от контроля. * - отличия от контроля достоверны, р<0,05; & - отличия от действия никлозамида достоверны, р<0,05; # - отличия от действия г-излучения через 1 час достоверны, р<0,05

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что никлозамид проявляет радиосенсибилизирующую активность в отношении клеток КРР человека, в основе которой может лежать не только ингибирование сигнального пути Wnt/в-катенин, но и иные механизмы, и в первую очередь обнаруженное ингибирование репарации ДР ДНК.

Выводы

1. Показана высокая цитотоксическая активность никлозамида в отношении опухолевых клеток и менее высокая в отношении нормальных клеток

2. Показано эффективное действие никлозамида на опухолевые клетки, экспрессирующие белки MDR1 и Bcl-2

3. Обнаружено повышение активности никлозамида в отношении опухолевых клеток и снижение токсичности в отношении нормальных клеток при включении его в полимерные частицы субмикронного размера

4. Обнаружено усиление цитотоксического действия цисплатина в отношении клеток меланомы мыши при его комбинированном применении с никлозамидом в свободной и полимерной форме

5. Показана эффективная интернализация биосовместимых биодеградируемых полимерных частиц клетками КРР человека

6. Выявлен одинаковый молекулярный механизм противоопухолевого действия никлозамида в свободной и полимерной форме в отношении клеток КРР, который связан с повреждением митохондрий и развитием окислительного стресса

7. Обнаружено радиосенсибилизирующее действие никлозамида на клетки КРР, в основе которого лежит ингибирование репарации ДР ДНК

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Жирник А.С., Никольская Е.Д., Посыпанова Г.А., Сёмочкина Ю.П. Исследование эффективности проникновения полимерных наночастиц на основе PLGA в опухолевые клетки человека // Юбилейная XV Курчатовская междисциплинарная молодёжная научная школа. Москва, Россия, 2017. С. 80.

2. Жирник А.С., Сёмочкина Ю.П., Москалёва Е.Ю., Крылов Н.И., Тубашева И.А., Кузнецов С.Л., Воронцов Е.А. Молекулярные механизмы противоопухолевой активности полимерной формы никлозамида в отношении клеток колоректального рака // Биомедицинская химия. 2017. Т. 63. № 2. С. 132-138.

3. Противоопухолевое лекарственное средство на основе никлозамида [Текст]: пат. 2617049 Рос. Федерация: МПК A61P35/00, A61K31/167 / Воронцов Е.А., Гукасова Н.В., Жирник А.С., Кузнецов С.Л., Москалёва Е.Ю., Тубашева И.А., Посыпанова Г.А., Родина А.В.; заявитель и патентообладатель НИЦ «Курчатовский институт». № RU2016118486A; заявл. 12.05.2016; опубл. 19.04.2017, Бюл. № 1. 19 с.

4. Жирник А.С., Крылов Н.И., Сёмочкина Ю.П. Исследование молекулярных механизмов действия никлозамида в полимерной форме на клетки колоректального рака человека // XIV Курчатовская междисциплинарная молодёжная научная школа -Москва, Россия, 2016. С. 78.

5. Жирник А.С., Сёмочкина Ю.П., Крылов Н.И. Повышение чувствительности клеток колоректального рака к действию ионизирующего излучения под действием никлозамида и его полимерной формы // Международный научно-практический форум «Ядерные технологии на страже здоровья» - Москва, Россия, 2016. С. 63-65.

6. Жирник А.С., Крылов Н.И. Цитотоксическая активность полимерной формы никлозамида в отношении опухолевых клеток различных линий // Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов - 2016». Москва, Россия, 2016. С. 58.

7. Жирник А.С., Сёмочкина Ю.П., Москалёва Е.Ю., Перевозчикова В.Г., Родина А.В., Северин С.Е. Антипролиферативная активность никлозамида в отношении клеток меланомы и колоректального рака // Химико-фармацевтический журнал. 2016. Т. 50. № 7. С. 40-43.

8. Жирник А.С., Сёмочкина Ю.П. Исследование активности никлозамида в отношении опухолевых стволовых клеток меланомы и колоректального рака // XIII Курчатовская молодёжная научная школа - Москва, Россия, 2015. С. 63.

9. Жирник А.С., Москалёва Е.Ю., Северин С.Е. Изучение противоопухолевой активности никлозамида в отношении клеток линий меланомы и колоректального рака // VI Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» - Ростов-на-Дону, Россия, 2015. С. 148-149.

10. Москалёва Е.Ю., Перевозчикова В.Г., Жирник А.С., Северин С.Е. Молекулярные механизмы противоопухолевой активности никлозамида // Биомедицинская химия. 2015. Т. 61. № 6. С. 680-693.

Размещено на Allbest.ru