Показатели антиоксидантной защиты организма при экспериментальном дисбактериозе кишечника, обусловленном применением антибиотика широкого спектра действия

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Показатели антиоксидантной защиты организма при экспериментальном дисбактериозе кишечника, обусловленном применением антибиотика широкого спектра действия

03.00.04 - биохимия

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Гапон Марина Николаевна

Ростов-на-Дону 2007

Работа выполнена в лаборатории микробиологии и разработки иммунобиологических препаратов Федерального государственного учреждения науки «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и на кафедре общей и клинической биохимии №1 Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Росздрава «Ростовский государственный медицинский университет».

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук, профессор Микашинович З.И.

доктор медицинских наук, доцент Терновская Л.Н.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Погорелова Т.Н.

кандидат медицинских наук Валиева С.З.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Федеральное государственное учреждение здравоохранения «Ростовский-на-Дону Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумной институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Защита состоится « 7 » ноября 2007 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 по биологическим наукам в Южном федеральном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б. Садовая, 105, аудитория ____).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан «___» _________________ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Бабенко В.В.

кишечный микрофлора гентамицин антиоксидантный

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Организм человека и населяющая его микрофлора представляют собой единую высокоорганизованную, саморегулирующуюся, эволюционно сложившуюся систему, где взаимодействие микрофлоры и макроорганизма обеспечивает поддержание гомеостаза и равновесия на метаболическом, клеточном и молекулярно-генетическом уровнях (Бухарин О.В. с соавт., 1996; Гриневич В.Б., Захарченко М.М., 2003). Участие микроорганизмов в обмене веществ, иммунной защите и других процессах, поддерживающих гомеостаз макроорганизма, позволило высказать предположение, что нормальная микрофлора представляет собой «метаболически и регуляторно весьма активный «дополнительный орган» человеческого организма» (Шендеров Б.А., 1998; Барановский А.Ю., Кондрашина Э.А., 2002). Взаимоотношения «хозяин-микрофлора» носят сложный характер и еще далеко не ясно, в каких формах они реализуются внутри эндоэкологической системы (Дубинин А.В. и др., 1991). Сбалансированность системы «хозяин-микрофлора» может нарушаться и «при превышении интенсивности негативных внешних воздействий над пороговыми значениями адаптационной системы организма» (Парфенов А.И., Осипов Г.А., Ручкина И.Н., 2003), и при сдвигах в метаболической активности самой микрофлоры (Уголев А.М., 1985). Известно и то, что состав и функционирование нормальной микрофлоры того или иного биотопа во многом определяется состоянием среды их обитания (Бабин В.Н., Минушкин О.Н., Дубинин А.В. и др., 1998; Маянский А.Н., 2002). Существенно влияют на качественный и количественный состав микрофлоры такие факторы как: состав и количество слизи, разнообразие жидких и плотных структур, температура, поступление пищевых ресурсов, состояние барьерных тканей макроорганизма, локальная концентрация протонов (рН), факторы неспецифической резистентности, окислительно-восстановительный потенциал, концентрация кислорода и активность свободно-радикальных процессов (Дубинина Е.Е., 2001; Захарченко М.П. с соавт., 2004; Голошва Е.В., 2005). Изменение этих параметров, независимо от причин, их вызывающих, отражаются на составе и функционировании нормальной микрофлоры. Одной из самых распространенных причин, вызывающих изменения этих параметров, является воздействие ксенобиотиков (в частности, антибиотиков). Существует мнение, что под действием ксенобиотиков в первую очередь наступает повреждение микрофлоры кишечника, так как именно она в виде биопленки препятствует их проникновению в макроорганизм (Воробьев А.А. с соавт.,1997). Однако, по мнению Бабина В.Н. с соавторами (1998), «дисбактериоз есть не только нарушение видового состава и абсолютной численности популяций, но и более или менее значительные нарушения в системе хозяин-микрофлора». Установление факта развития гипоксического состояния эпителиальных клеток кишечника, высказанное положение о способности колоноцитов продуцировать токсические формы кислорода, изменение физико-химических параметров контактной приэпителиальной зоны (Бабин В.Н., Минушкин О.Н., Дубинин А.В., и др., 1998) создают предпосылки для более углубленного исследования взаимоотношений «хозяин-микрофлора».

Общепринятое представление о том, что нарушения в антиоксидантной защите макроорганизма лежат в основе развития многих патологических состояний, послужило основанием для выявления связи изменения микрофлоры толстого кишечника животных и состояния антиоксидантной защиты макроорганизма в динамике экспериментального дисбактериоза, обусловленного применением антибиотика широкого спектра действия - гентамицина.

Цели и задачи. Целью настоящего исследования явилось определение состояния антиоксидантной защиты макроорганизма в динамике экспериментального дисбактериоза, обусловленного применением антибиотика широкого спектра действия (гентамицина).

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать качественный и количественный состав микрофлоры кишечника в динамике экспериментального дисбактериоза, обусловленного введением гентамицина.

2. Исследовать состояние антиоксидантной защиты крови и колоноцитов в динамике экспериментального дисбактериоза.

3. Установить связь между состоянием микрофлоры кишечника и состоянием антиоксидантной защиты эритроцитов и колоноцитов при экспериментальном дисбактериозе.

4. Изучить влияние продукта функционального питания «Наринэ» на состояние микрофлоры и на некоторые показатели антиоксидантной защиты эритроцитов, колоноцитов в динамике экспериментального дисбактериоза.

Научная новизна. Впервые установлена взаимосвязь между нарушениями антиоксидантной защиты и нарушением микроэкологического равновесия в кишечном биоценозе.

Впервые установлено, что при дисбактериозе кишечника более выражены нарушения в состоянии антиоксидантной защиты эпителиоидных клеток кишечника.

Впервые показано, что увеличение содержания условно-патогенной микрофлоры сочетается с повышенным содержанием ТБК-продуктов в копрофильтратах, что может свидетельствовать о повышенной агрессивности местной среды и являться дополнительным диагностическим тестом.

Экспериментально обоснованы пути коррекции дисбактериоза кишечника и нарушений антиоксидантной защиты организма кисломолочным продуктом «Наринэ».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При экспериментальном дисбактериозе, обусловленном применением антибиотика широкого спектра действия - гентамицина, происходят изменения в составе микрофлоры кишечника, выражающиеся в изменении состава эшерихий и увеличении содержания условно-патогенных микроорганизмов, при умеренном снижении численности нормальных эубионтов.

2. При экспериментальном дисбактериозе, обусловленном применением гентамицина, развивается дисбаланс всех звеньев АОЗ. Выявляется связь между состоянием антиоксидантной защиты макроорганизма, содержанием ТБК-активных продуктов в копрофильтратах и характером микрофлоры в динамике дисбактериоза.

3. Кисломолочный продукт функционального питания «Наринэ» можно расценивать как препарат профилактического действия. Использование «Наринэ» одновременно с применением антибиотика предотвращает изменения состава микрофлоры, способствует стабилизации окислительно-восстановительного гомеостаза макроорганизма.

Теоретическая и практическая значимость. В теоретическом плане работа расширяет представления о механизмах развития дисбактериоза, обусловленного применением антибиотика широкого спектра действия. Работа выполнена в рамках договора № 034/201/003 (2001-2005г.г.) в соответствии с планом научно-исследовательских работ Рост НИИМП по теме «Отношение паразит-хозяин в биотопах кишечника при лекарственном дисбактериозе». Материалы диссертационной работы представлены в медицинской технологии «Технология диагностики местных метаболических и иммунологических нарушений при дисбактериозе», утвержденной Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (2006). Полученные результаты позволили обосновать новые подходы к диагностике и профилактике дисбактериоза кишечника и использованы в аналитическом обзоре «Новые подходы к коррекции и профилактике дисбактериозов» (2004), получившем положительную оценку Департамента организации медицинской помощи населению и профилактики неинфекционных заболеваний Минздрава России и рекомендованном для использования практическими врачами. Результаты экспериментальной работы используются в лекционном курсе по дисбактериозу кишечника на факультете усовершенствования врачей в Рост ГМУ.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, симбиотики и функциональные продукты питания: Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004), 69-ой итоговой научной сессии КГМУ (Курск, 2004), 4-ой межвузовской международной биохимической научно-практической конференции «Обмен веществ при адаптации и повреждении» Рост ГМУ (Ростов-на-Дону, 2005), Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня основания филиала «Иммунопрепарат» ФГУП НПО «Микроген» МЗ и СР РФ (Уфа, 2005), 71-ой итоговой научной конференции сотрудников КГМУ и Центрально-Черноземного научного Центра РАМН (Курск, 2006), 1-ой научно-практической конференции по рациональному и лечебному питанию Южного Федерального Округа «Теоретические основы рационального и лечебного питания» РостГМУ и МЗРО (Ростов-на-Дону, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных публикаций, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК - 2, личный вклад 80%, 0,6 п.л. Получен патент на изобретение «Питательная среда для выделения лактобактерий» № 2202609 от 20.04.2003 г.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 171 отечественных и 37 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 10 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы, объем и методы исследования. Модель экспериментального лекарственного дисбактериоза (Кашкин К.П., Караев З.О., 1984) воспроизводили на белых беспородных мышах, полученных из питомника ФГУН «РостовНИИМП» Роспотребнадзора. В работе были задействованы половозрелые особи (самцы) весом 16-18 г в количестве 400 штук.

Проведено 4 серии экспериментов в осенний и весенний периоды, что обусловлено высокой чувствительностью организма мышей к сезонным колебаниям. В работе исследовали полостную и мукозную микрофлору кишечника, эритроциты, плазму, колоноциты и копрофильтраты мышей.

Все исследования проводили в динамике лекарственного дисбактериоза на 3, 10, 17, 24, 30 сутки после окончания введения антибиотика.

Биологические методы. Для воспроизведения экспериментального дисбактериоза мышам вводили в терапевтической дозе (в объеме 0,2 мл) внутрибрюшинно антибиотик широкого спектра действия (гентамицин) в течение 5 дней.

Эритроциты получали из крови, стабилизированной гепарином (10 ед./мл), отделяя от лейкоцитов и тромбоцитов в 3% желатиновом растворе с последующим центрифугированием (при 320 g в течение 15 мин). После отделения плазмы и верхнего слоя клеток, эритроциты отмывали физиологическим раствором. Для определения активности ферментов использовали 20% гемолизат, приготовленный на бидистиллированной воде.

Колоноциты выделяли из участка толстого кишечника (длиной 5 см), который трижды промывали стерильным физиологическим раствором. Выделенные с внутренней поверхности кишечника колоноциты вносили в фосфатно-буферный раствор (рН=7,2), подсчитывали в камере Горяева и доводили их концентрацию до 1Ч10⁶ /мл. Все дальнейшие расчеты производили в пересчете на мг белка.

Копрофильтраты готовили в соответствии с методическими рекомендациями «Применение сигнального способа диагностики острой дизентерии по определению количества лизоцима в копрофильтратах» (Оренбург, 1979).

Микробиологические методы. Состав полостной микрофлоры кишечника изучали в соответствии с методическими рекомендациями «Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника» (Москва, 1991). Подсчет колоний микроорганизмов производили в натуральных числах, умноженных на 10 в степени, равной разведению бактериологического материала, с последующим традиционно принятым выражением их через десятичный логарифм.

Для исследования состава мукозной микрофлоры лоскут кишечника длиной 5-6 см трижды промывали фосфатно-буферным раствором (рН=7,2). Гомогенизированный в ступке с кварцевым песком отрезок кишечника переносили в стерильный физиологический раствор (рН=7,2). Характер микрофлоры определяли по той же методике (Москва, 1991).

Выделенные чистые культуры идентифицировали по морфологическим, тинкториальным, биохимическим, культуральным свойствам в соответствии с рекомендациями «Краткий определитель бактерий Берги» (1980).

Биохимические методы. Состояние системы АОЗ эритроцитов, колоноцитов и копрофильтратов экспериментальных животных оценивали по активности ферментов различных линий защиты.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по методу Misra H.P. и Fridovich I. (1972) в модификации кафедры общей и клинической биохимии №1 Ростовского государственного медицинского университета (Саркисян О.Г., 2000). Метод основан на определении степени ингибирования восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) в присутствии супероксидного анион-радикала, генерируемого в реакции окисления адреналина в адренохром в щелочной среде. Активность фермента эритроцитов выражали в усл. ед./г Hb/час, колоноцитов - в усл. ед./мг белка/час.

Активность каталазы определяли по методу Королюк М.А. с соавт. (1988), основанному на способности пероксида водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс, интенсивность которого определяли на ФЭК при длине волны 410 нм. Активность фермента эритроцитов выражали в мКатал/г Hb/час, колоноцитов - в мКатал/мг белка/час.

Содержание восстановленного глутатиона (GSH) определяли по методу, предложенному Ellman G.L. (1959), основанном на реакции 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты с восстановленным глутатионом, в результате которой образуется окрашенное соединение с максимумом поглощения при длине волны 412 нм. Концентрацию восстановленного глутатиона в эритроцитах выражали в мкмоль/г Hb, в колоноцитах - в мкмоль/мг белка.

Активность глутатионпероксидазы (ГПО) определяли по скорости окисления восстановленного глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила по методу Моина В.М. (1986). Определение проводили при 37⁰ С. Инкубационная среда включала 0,1 М трис-HCl буфер (рН=8,5), 5,2 ммоль этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) (для связывания ионов переменной валентности, ускоряющих разложение трет-бутила), 10,4 ммоль азида натрия (ингибитор каталазы), 4,2 ммоль восстановленного глутатиона и 1,4 ммоль гидроперекиси трет-бутила. Использование гидроперекиси трет-бутила в качестве субстрата позволяет определять глутатионпероксидазную активность, включающую липопероксидазную активность глутатион-S-трансфераз (Ланкин В.В., 1981). Реакцию останавливали добавлением 10 % раствора ТХУ. Концентрацию восстановленного глутатиона определяли спектрофотометрически при длине волны 412 нм до и после инкубации. В основе развития цветной реакции лежит взаимодействие SH-группы глутатиона с 5,5-дитиобис (2-нитробензойной) кислотой с образованием окрашенного продукта - тионитрофенильного аниона (Торчинский Ю.М., 1976; Торчинский Ю.М., 1977). Активность фермента эритроцитов выражали в мкмоль/г Hb/час, колоноцитов - в мкмоль/мг белка/час.

Активность глутатионредуктазы (ГР) определяли по скорости окисления НАДФН+Н методом Юсуповой Л.Б. (1989). Инкубационная среда состояла из 0,04 М Na,K - фосфатного буфера, 0,05 М KCl, 4 мМ ЭДТА, 0,3 мМ окисленного глутатиона и 0,08 мМ НАДФН+Н. Реакцию проводили при 37^є в течение 10 минут и регистрировали уменьшение поглощения НАДФН+Н при 340 нм. Активность фермента эритроцитов выражали в мкмоль/г Hb/мин, колоноцитов - в мкмоль/мг белка/мин.

В плазме крови, колоноцитах и копрофильтратах мышей определяли ТБК-активные продукты по концентрации вторичного перекисного метаболита - малонового диальдегида (МДА), как показателя свидетельствующего о возможном повреждении клеточных мембран.

Метод определения содержания МДА основан на том, что при нагревании в кислой среде, часть продуктов ПОЛ, относящихся к классу эндоперекисей, разлагаются с образованием МДА, молекула которого взаимодействует с 2 молекулами тиобарбитуровой кислоты (ТБК) с образованием окрашенного триметинового комплекса (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977). Пробы фотометрировали при длине волны 535 нм. Содержание МДА выражали в нмоль/мг белка.

Содержание общего белка определяли по методу Lowry C. с соавторами (1953). Метод основан на образовании комплекса, который дает характерную синюю окраску, пропорциональную количеству белка. Интенсивность окраски измеряли на ФЭК при длине волны 750 нм. Результаты выражали в мг/мл гомогената.

Содержание гемоглобина (Hb) определяли по методу, описанному Лугановой И.С., Блиновым М.Н. (1975), при длине волны 540 нм на ФЭК в аммиачном растворе, концентрацию Hb выражали в г/л.

Статистические методы. Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы STATISTICA (Statsoft). Достоверность различий между исследуемыми группами определяли с помощью t-критерия Стьюдента после проверки распределения на нормальность. Статистически достоверными считали отличия, соответствующие величине ошибки Р<0,05.

В разделе автореферата «Результаты исследования и их обсуждение» приводятся только статистически достоверные отличия.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение характера полостной микрофлоры кишечника экспериментальных животных, получавших гентамицин, позволило установить, что его применение приводит к существенным изменениям в составе кишечного микробиоценоза. При этом изменяется количество и частота обнаружения представителей как облигатной, так и транзиторной микрофлоры. Несмотря на то, что бифидо- и лактобактерии обнаруживаются в составе микрофлоры кишечника у всех экспериментальных животных (частота распространения - 100%), их количество умеренно снижается - бифидобактерий до lg 7,5+0,3 против lg 8,5+0,5 в контроле, лактобактерий - lg 6,8+0,1 против lg 7,2+0,6 в контроле. Более существенные изменения отмечены в популяции эшерихий. Одновременно с уменьшением общего количества эшерихий отмечается уменьшение частоты обнаружения эшерихий с нормальной ферментативной активностью (до 50,0+6,1 %), увеличение содержания эшерихий со сниженной ферментативной активностью (lg 7,2+0,2 против lg 3,0+0,5 у интактных животных).

Среди транзиторной микрофлоры так же происходят выраженные изменения: увеличивается частота обнаружения (с 80,0+2,6 % до 100 %) и количество лактозонегативных энтеробактерий (lg 4,9+0,1 против lg 3,3+0,1), бактерий рода Proteus (частота находок с 40,0+7,7 % до 90,0+1,3 %; количество lg 4,1+0,5 против 0,8+0,2 в контроле), грибов рода Candida (частота обнаружения до 50,0+6,1 %; количество - lg 3,3+0,2 против lg 1,4+0,1 в контроле). Значительно изменяется состав кокковой флоры: возрастает численность коагулазоотрицательных стафилококков (до lg 4,7+0,3 против lg 3,5+0,5), увеличивается частота обнаружения и количество золотистых стафилококков (80,0+2,6 % против 0; lg 4,3+0,1 против 0).

Исследование изменений состава кишечной микрофлоры животных в динамике экспериментального дисбактериоза показало, что нарушения в микробиоценозе регистрируются уже на третьи сутки после окончания введения антибиотического препарата, нарастают к десятым-семнадцатым суткам наблюдения и по ряду показателей не достигают значений контрольной группы к тридцатым суткам исследования. Так, уже на третьи сутки наблюдения отмечается умеренное снижение количества бифидо-и лактобактерий, эшерихий с нормальной ферментативной активностью, увеличение содержания эшерихий со сниженной ферментативной активностью, лактозонегативных энтеробактерий, коагулазоотрицательных и золотистых стафилококков, бактерий рода Proteus. К десятому дню после отмены антибиотического препарата эти изменения приобретают более выраженный характер: количество бифидо- и лактобактерий становится на порядок ниже, по сравнению с группой интактных животных, значительно уменьшается содержание эшерихий с нормальной ферментативной активностью, максимально высоких значений достигает количество лактозонегативных энтеробактерий, увеличивается содержание в составе микрофлоры кишечника популяции дрожжеподобных грибов рода Candida. Эти изменения сохраняются и на семнадцатые сутки наблюдения, обнаруживая некоторую тенденцию к повышению содержания нормальных эубионтов. Несколько иная зависимость выявляется среди представителей транзиторной условно-патогенной микрофлоры: если количество лактозонегативных энтеробактерий в составе кишечного биоценоза уменьшается (с lg 5,8+0,4 - на десятый день наблюдения до lg 4,0+0,7 - на семнадцатый день), то количество золотистых стафилококков продолжает возрастать (до lg 5,3+0,4 против нулевых значений в контроле). В дальнейшие сроки наблюдения (двадцать четвертый и тридцатый дни после отмены антибиотика) тенденция увеличения содержания в составе микрофлоры кишечника количества нормальных эубионтов стойко сохраняется. Однако если содержание лактобактерий к концу срока наблюдения достигает показателей контрольных животных, то количество бифидобактерий в кишечной микрофлоре животных, получавших антибиотик, остается еще несколько сниженным (lg 7,7+0,3 против lg 8,5+0,5 в контроле). В составе кишечной микрофлоры экспериментальных животных регистрируется высокая численность золотистых стафилококков (lg 4,1+0,2), протеев (lg 3,1+0,1), грибов рода Candida (lg 4,0+0,2).

Так как состояние мукозной микрофлоры кишечника в большей степени отражает особенности местных условий среды кишечного биотопа (Несвижский Ю.В., 2003), было проведено исследование состава мукозной микрофлоры в динамике экспериментального дисбактериоза. Сопоставление количественного состава мукозной и полостной микрофлоры не выявило различий в спектре выделяемых микроорганизмов. В составе как полостной, так и мукозной микрофлоры интактных животных присутствовали бифидо- и лактобактерии, эшерихии с нормальной и сниженной ферментативной активностью, энтерококки, коагулазоотрицательные стафилококки. Однако бифидобактерии в составе мукозной флоры определялись в большем, чем в полостной флоре, количестве (lg 9,2+0,6 против lg 8,5+0,5). В несколько меньшем количестве, чем в полостной микрофлоре, в составе мукозной содержались лактобактерии (lg 6,0+0,3 против lg 7,2+0,6), эшерихии с нормальной ферментативной активностью (lg 4,2+0,3 против lg 6,4+0,3), эшерихии со сниженной ферментативной активностью (lg 2,0+0,1 против lg 3,0+0,5) и лактозонегативные энтеробактерии (lg 2,3+0,1 против lg 3,3+0,1). Гемолитические эшерихии, протеи, золотистые стафилококки и грибы рода Candida в составе мукозной микрофлоры интактных животных отсутствовали.

При развитии экспериментального дисбактериоза изменения состава мукозной микрофлоры в целом соответствовали изменениям, отмечаемым в полостной микрофлоре кишечника. Однако снижение содержания бифидобактерий было отмечено в более выраженной степени (lg 5,6+0,3 против lg 9,2+0,6 у интактных животных). В составе мукозной микрофлоры так же, как в составе полостной, уменьшилась численность эшерихий с нормальной ферментативной активностью, статистически достоверно выросло количество и частота обнаружения эшерихий со сниженной ферментативной активностью, лактозонегативных энтеробактерий, протеев, грибов рода Candida, золотистых стафилококков.

До настоящего времени конкретные механизмы дисбаланса кишечной микрофлоры под влиянием различных по своей природе факторов риска остаются до конца не выясненными. Типичной реакцией целостного организма на различные воздействия является стрессовый адаптационный синдром, при котором формируются изменения кишечного микробиоценоза. Дополнительным фактором, способствующим изменению количества облигатной микрофлоры, является продукция токсических метаболитов кислорода как следствие активации гексозомонофосфатного шунта (Дубинин А.В., Бабин В.Н., Раевский П.М., 1991; Ардатская М.Д., Минушкин О.Н., Прихно Н.И., Дубинин А.В., 2000; Захарченко М.П., Гриневич В.Б., Добрынин В.М., 2003; Захарченко М.П., Добрынин В.М., Захарченко М.М. с соавт., 2004; Ahmad M.S., Krishnan S., Ramakrishna B.S. et al., 2000).

Рис. 1. Активность СОД, каталазы, ГПО, ГР и количество GSH в эритроцитах животных с экспериментальным дисбактериозом.

В связи с этим целесообразным является изучение ключевой стресслимитирующей, гомеостатической системы макроорганизма - антиоксидантной системы в динамике дисбактериоза, обусловленного применением антибиотика широкого спектра действия. Поэтому следующим этапом исследования явилось изучение состояния антиоксидантной защиты эритроцитов и колоноцитов в динамике экспериментального дисбактериоза.

Анализ результатов исследования показал, что в процессе развития экспериментального дисбактериоза происходят существенные изменения активности ферментов антиоксидантной защиты макроорганизма (Рис.1). Уже к третьему дню наблюдения отмечается снижение активности СОД в эритроцитах крови на 22,1 %, по сравнению с животными контрольной группы. Начиная с десятого дня исследования активность СОД, постепенно увеличивается, достигая своих максимальных значений к двадцать четвертому дню. Несколько по иному изменяется активность каталазы. Достоверное снижение ее активности прослеживается на третьи и семнадцатые сутки наблюдения, достигая своих минимальных значений к двадцать четвертому дню исследования. Значительное снижение активности каталазы при высокой активности СОД свидетельствует о резком дисбалансе в функционировании сопряженных ферментов, который может указывать на накопление перекиси водорода в эритроцитах, что, в свою очередь, может способствовать активации процессов перекисного окисления липидов.

В динамике дисбактериоза происходят изменения и в состоянии глутатионового блока антиоксидантной системы эритроцитов. Если на третьи сутки наблюдается достоверное снижение активности ГПО (на 11,7 %) и выраженное повышение активности ГР (на 25,9 %), то к десятым суткам метаболическая картина изменяется: резко увеличивается активность ГР (на 69,6 %) и снижается содержание восстановленного глутатиона (на 19,5 %) относительно контрольных величин, что может указывать на интенсивное использование его восстановленных эквивалентов. Максимальное повышение активности ГПО и ГР к семнадцатым суткам при количестве восстановленного глутатиона, соответствующем контрольным значениям, свидетельствует о напряженности глутатионзависимого блока и активации защитных механизмов, направленных на устранение токсических продуктов. Эти данные также могут указывать на ведущую роль глутатионового звена в антиоксидантной защите эритроцитов при развитии экспериментального дисбактериоза.

Многие исследователи полагают, что симбионтная микрофлора кишечника оказывает трофическое обеспечение слизистой оболочки кишечника и, в частности, ее эпителиального слоя (Шендеров Б.А., 1998; Осипов Г.А. с соавт., 2001). Однако последствия разрушения этой экологической системы для организма в целом изучены недостаточно.

Функциональная целостность макроорганизма (как симбиотической системы) определяется наличием интегративных регуляторных и трофических связей между организмом хозяина и его микрофлорой. Именно колоноциты во многом, по-видимому, определяют «полноценность» этих связей и являются отражением развития дисбиоза кишечника, поэтому представилось необходимым исследовать состояние антиоксидантной защиты колоноцитов.

Результаты исследования показали, что нарушения АОЗ эпителиоидных клеток толстого кишечника при развитии дисбактериоза выражены сильнее, чем в эритроцитах, а изменения активности антиоксидантных ферментов колоноцитов носят несколько иной характер (Рис.2). Во все сроки исследования в колоноцитах отмечается достоверное снижение активности СОД относительно контрольных величин на фоне практически нормальных значений активности каталазы. Лишь на 17-24 сутки происходит выраженное снижение активности обоих ферментов, что может свидетельствовать об интенсификации свободнорадикальных процессов.

Рис. 2. Активность СОД, каталазы, ГПО, ГР и количество GSH в колоноцитах животных с экспериментальным дисбактериозом.

Со стороны глутатионзависимого блока антиоксидантной защиты колоноцитов в динамике дисбактериоза также наблюдаются изменения. В начальные сроки развития дисбактериоза отмечается увеличение активности ГПО (на 51,9 %), по сравнению с контролем, при этом активность ГР соответствует, а содержание восстановленного глутатиона ниже (на 26,0 %), чем у интактных животных, что также может указывать на увеличение поступления перекисей липидов и интенсификацию ПОЛ вследствие снижения барьерной функции кишечного эпителия на фоне уже развивающихся изменений в микрофлоре. Поэтому изменения, определяемые в состоянии антиоксидантной защиты колоноцитов в первые дни развития дисбактериоза, возможно, являются следствием действия антибиотика.

Характерной особенностью состояния глутатионового блока АОЗ колоноцитов к десятым суткам наблюдения является сохранение его напряженности, проявляющееся в увеличении (на 97,9 %) активности ГПО и содержания восстановленного глутатиона (на 25,1 %) относительно контрольного уровня. При этом активность ГР соответствует контрольным значениям, что сопряжено с максимальными изменениями в составе кишечной микрофлоры. Напряженность глутатионзависимого блока сменяется истощением его адаптивно-компенсаторных возможностей, отмечаемым на семнадцатый день исследования. Максимально снижается активность глутатионзависимых ферментов. Однако ведущим патогенетическим фактором в колоноцитах в этот срок наблюдения является пул восстановленного глутатиона, содержание которого более чем в 2 раза превышает соответствующие показатели у интактных животных.

Таким образом, нарушение координированной работы ферментов антиоксидантной защиты колоноцитов может способствовать интенсификации свободнорадикального окисления и являться ответной реакцией организма на развитие дисбактериоза. Следует отметить, что, хотя в этот период (с 17 по 24 сутки) наблюдается тенденция восстановления численности отдельных видов эубионтов (эшерихий с нормальной ферментативной активностью), в биоценозе кишечника сохраняются явления дисбактериоза, сопровождающиеся ростом числа золотистых стафилококков и грибов рода Candida, что сопряжено с нарушением работы ферментов первой линии антиоксидантной защиты колоноцитов. Обращает на себя внимание синхронное снижение (по отношению к контролю) активности СОД и каталазы. Особенно следует подчеркнуть сниженное (в 2,3 раза) относительно контроля содержание восстановленного глутатиона, что может быть связано с его интенсивным использованием глутатионпероксидазой, активность которой превышает в 2,39 раза контрольные показатели, при активности ГР практически соответствующей норме. Таким образом, к тридцатым суткам эксперимента, в колоноцитах наблюдается усиленное функционирование глутатионзависимого блока АОЗ при депрессии линии СОД - каталаза. На этом фоне в микрофлоре кишечника общая численность условно-патогенных микроорганизмов по-прежнему остается значительной.

Высокое содержание условно-патогенных микроорганизмов, определяемое в кишечном биотопе на протяжении всего срока исследования, позволило сделать предположение о высоком содержании в местной среде их существования (в колоноцитах и копрофильтратах) ТБК-активного продукта - малонового диальдегида (МДА), что может являться косвенным свидетельством повреждения клеточных мембран. По мнению некоторых исследователей (Гончарова Г.И., Дорофейчук В.Г., Смолянская А.З. и др., 1989; Самойлова Л.М., Князькова Л.Г., Яснова Л.Н. и др., 2001), увеличение содержания условно-патогенных микроорганизмов в ассоциациях может приводить к накоплению токсических продуктов их метаболизма. Повышенный уровень этих продуктов, в свою очередь, способен интенсифицировать продукцию активных форм кислорода, являющихся также токсичными для окружающих клеток, и активизируя свободнорадикальное окисление, нарушать целостность биологических мембран, что отражается на антиоксидантном статусе макроорганизма и нарушает гомеостаз. Существующее мнение, а также установленные нами в динамике экспериментального дисбактериоза изменения в активности антиоксидантных ферментов, косвенно свидетельствующие о возможной активации процессов ПОЛ, послужили основанием для определения содержания ТБК-активных продуктов (МДА) в плазме крови, колоноцитах и копрофильтратах экспериментальных животных.

Анализ полученных результатов показал, что во все сроки наблюдения в течение экспериментального дисбактериоза отмечается повышенное содержание МДА во всех изучаемых объектах. Более высокое, относительно контроля, содержание МДА регистрируется в копрофильтратах, превосходя его значения на третьи сутки в 2 раза; на десятые сутки - в 4 раза; на семнадцатые сутки - более чем в 7 раз; на двадцать четвертые сутки - в 4,6 раза; на тридцатые сутки - в 4,3 раза. Однако, если увеличение количества МДА в копрофильтратах и плазме отмечается уже в первые дни наблюдения (на 100 % и 66,6 %, соответственно), то в колоноцитах достоверное повышение уровня МДА выявляется лишь к десятому дню исследования и составляет 63,2 %, а с семнадцатого дня наблюдения рост количества МДА в колоноцитах превосходит его увеличение в плазме (271 % в колоноцитах против 122,2 % в плазме). Такое соотношение величин наблюдается и в последующие сроки исследования. С двадцать четвертого дня наблюдения происходит уменьшение количества МДА во всех исследуемых объектах, однако даже к концу наблюдения (30 сутки) содержание МДА в копрофильтратах, колоноцитах и плазме достоверно превосходит данные контрольной группы животных (на 335 %, 242 %, 78 %, соответственно).

Обращает на себя внимание тот факт, что наиболее высокий уровень МДА в колоноцитах и копрофильтратах экспериментальных животных приходится на 10-17 сутки - срок наиболее высокого содержания условно-патогенных микроорганизмов в микрофлоре толстого кишечника. Зафиксированные высокие значения МДА в копрофильтратах и колоноцитах экспериментальных животных могут свидетельствовать о возможном риске повреждения клеточных мембран, а так же подтверждают значительные изменения в АОЗ в зоне формирования дисбактериоза.

Выявленные нами в динамике экспериментального дисбактериоза изменения в состоянии прооксидантной и антиоксидантной системы макроорганизма позволяют думать о том, что использование для коррекции дисбактериоза только пробиотических препаратов недостаточно. Рациональным дополнением могут явиться продукты функционального питания, содержащие витамины и органические кислоты, необходимые для нормального состава и функционирования микрофлоры. Наш выбор был остановлен на кисломолочном продукте функционального питания «Наринэ», содержащем живой штамм ацидофильных лактобактерий - Lactobacterium acidophilus EP 317/402. Данный штамм обладает выраженной антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам, а высокая устойчивость к антибиотикам и химиотерапевтическим средствам позволяет его использовать одновременно с этими препаратами (Костюк О.П., Чернышова Л.И., Волоха А.П., 1998; Гукасян Г.Б. и др., 2002). По данным нашего исследования (Гапон М.Н., Терновская Л.Н., Микашинович З.И., Белоусова Е.С., 2005), кисломолочный продукт «Наринэ» содержит ключевые антиоксидантные ферменты - СОД и каталазу (псевдокаталазу), что позволяет предполагать, что его использование одновременно с антибиотиком сможет оказывать воздействие, как на состояние кишечной микрофлоры, так и на состояние антиоксидантной защиты макроорганизма.

В связи с этим следующим этапом исследования стало изучение влияния одновременного использования с гентамицином кисломолочного продукта «Наринэ» на состояние микрофлоры кишечника и на некоторые показатели антиоксидантной защиты эритроцитов и колоноцитов в динамике экспериментального дисбактериоза.

Проведенное исследование показало, что совместное использование кисломолочного продукта «Наринэ» с антибиотиком способствует сохранению нормального состава микрофлоры кишечника. У животных, получавших наряду с антибиотиком кисломолочный продукт «Наринэ», количество бифидо- и лактобактерий не отличалось от их числа у интактных животных (lg 8,5+0,5 и lg 7,2+0,6 соответственно), сохранялась численность эшерихий с нормальной ферментативной активностью (lg 6,4+0,3), а количество эшерихий со сниженной ферментативной активностью было значительно меньше (lg 1,88+0,08), чем у животных с экспериментальным дисбактериозом (lg 7,2+0,2) и животных контрольной группы (lg 3,0+0,5). В меньшей степени, чем у животных с экспериментальным дисбактериозом, увеличивалось содержание лактозонегативных энтеробактерий (lg 4,14+0,38 против lg 4,9+0,1), коагулазоотрицательных стафилококков (lg 1,96+0,2 против lg 4,7+0,3), грибов рода Candida (lg 1,18+0,24 против lg 3,3+0,2). В составе кишечной микрофлоры животных, получавших кисломолочный продукт «Наринэ», в течение всего срока наблюдения совсем отсутствовали золотистые стафилококки и бактерии рода Proteus.

Оценка состояния антиоксидантной защиты эритроцитов животных, получавших одновременно с антибиотиком кисломолочный продукт «Наринэ» и животных с экспериментальным дисбактериозом, показала, что при использовании данного продукта, во все сроки исследования повышается активность изучаемых ферментов и содержание восстановленного глутатиона. Уже с первых дней наблюдения определяется повышенная активность каталазы, относительно соответствующего показателя животных с экспериментальным дисбактериозом, которая сохраняется до конца наблюдения. Однако использование кисломолочного продукта не приводит антиоксидантную систему эритроцитов к физиологической норме. Активация каталазы, отмечаемая во все сроки наблюдения у животных, получавших «Наринэ», приводит к выраженному дисбалансу в функционировании сопряженных ферментов (СОД и каталазы), который наиболее выражен на 17-24 сутки и сохраняется до последнего дня наблюдения. На протяжении всего срока исследования у животных, получавших «Наринэ», прослеживается активация глутатионзависимых ферментов (ГР, ГПО) и высокое содержание восстановленного глутатиона, относительно этих же показателей у животных с дисбактериозом.

Несколько по-иному отразилось использование кисломолочного продукта «Наринэ» на состояние АОЗ колоноцитов. На протяжении всего срока исследования (исключая 3 сутки) активность СОД определяется выше, а активность каталазы (исключая 17, 24 сутки) - ниже активности изучаемых показателей у животных с экспериментальным дисбактериозом. Несмотря на низкую, относительно контрольного уровня, активность СОД и каталазы, в колоноцитах животных, получавших «Наринэ», функционирование этих ферментов (на 10, 24, 30 сутки) более сбалансировано, чем у экспериментальных животных. В работе глутатионзависимого блока антиоксидантной системы колоноцитов значительной коррекции не отмечается. Однако состояние глутатионзависимых показателей на 10 и 30 сутки наблюдения в группе животных, получавших «Наринэ» более уравновешено и близко к физиологическому состоянию.

Проведенные исследования показали, что использование кисломолочного продукта «Наринэ» способствует нормализации содержания ТБК-активных продуктов (МДА) как во внутренней среде кишечника (копрофильтратах), так и в плазме крови экспериментальных животных (Табл.1)

Таблица 1 Содержание МДА в плазме и в копрофильтратах экспериментальных и интактных животных в динамике экспериментального дисбактериоза

Примечание: Контроль - группа интактных животных; ЭД - группа животных с экспериментальным дисбактериозом; ЭД+Н - группа животных, получавших одновременно с антибиотиком кисломолочный продукт «Наринэ»; * - достоверность отличий изучаемого показателя от аналогичного у интактных животных, Р1<0,05; ** - достоверность отличий изучаемого показателя от аналогичного у животных с экспериментальным дисбактериозом, Р2<0,05.

Таким образом, можно думать, что использование кисломолочного продукта «Наринэ» приводит к повышению адаптивно-компенсаторных возможностей макроорганизма при экспериментальном дисбактериозе, обусловленном применением гентамицина. При этом корригирующий эффект «Наринэ» связан, по-видимому, не только с его антиоксидантными свойствами. Не исключено, что его эффективность обусловлена и наличием в нем, по данным литературных источников, органических кислот, присутствие которых необходимо для поддержания метаболизма колоноцитов (Дубинин А.В., Бабин В.Н., Раевский П.М., 1991).

В целом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о значительных изменениях в состоянии антиоксидантной защиты эритроцитов и колоноцитов экспериментальных животных, что, возможно, является одной из причин возникновения микроэкологических нарушений при использовании антибиотика широкого спектра действия.

ВЫВОДЫ

1. При экспериментальном дисбактериозе, обусловленном применением гентамицина, изменение состава кишечной микрофлоры характеризуется снижением содержания постоянных (резидентных) представителей микрофлоры (бифидо- и лактобактерий, в большей степени - эшерихий с нормальной ферментативной активностью), увеличением частоты обнаружения и численности эшерихий со сниженной ферментативной активностью, лактозонегативных энтеробактерий, протеев, золотистых стафилококков, грибов рода Candida.

2. При экспериментальном дисбактериозе существенно изменяется ферментативная активность всех звеньев антиоксидантной защиты, как эритроцитов, так и эпителиоидных клеток толстого кишечника (колоноцитов). Наиболее значительные изменения активности антиоксидантных ферментов отмечаются в колоноцитах, что указывает на нарушение адаптационно-компенсаторных механизмов антиоксидантной защиты на местном уровне.

3. Выявлена выраженная зависимость изменения показателей антиоксидантной защиты от характера изменений микрофлоры кишечника: максимальные изменения в активности ферментов АОЗ макроорганизма (на 17 сутки) соответствуют максимальному содержанию в составе кишечной микрофлоры золотистых стафилококков.

4. На протяжении всего срока развития дисбактериоза, обусловленного применением гентамицина, в плазме крови, колоноцитах и копрофильтратах экспериментальных животных обнаружено высокое содержание ТБК-активных продуктов (МДА) с более высоким их уровнем в копрофильтратах. Максимальные концентрации МДА в плазме, колоноцитах и копрофильтратах (на 17 сутки) соответствуют более высокому содержанию в кишечном биоценозе условно-патогенных микроорганизмов (золотистых стафилококков, грибов рода Candida) и низким значениям активности антиоксидантных ферментов колоноцитов: супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы.

5. Использование кисломолочного продукта «Наринэ» одновременно с антибиотиком предотвращает развитие выраженных дисбиотических изменений, способствует повышению активности антиоксидантных ферментов и содержания восстановленного глутатиона в эритроцитах, нормализует содержание ТБК-активных продуктов в плазме и копрофильтратах. Однако для полного восстановления функциональной активности АОС колоноцитов использования данного продукта недостаточно.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гапон М.Н., Терновская Л.Н., Микашинович З.И., Белоусова Е.С. // Экспериментальное обоснование использования штамма Lactobacterium acidophilus EP 317/402 для профилактики дисбактериоза при антибиотикотерапии. // Журн. Известия ВУЗов, Северокавказский регион. - 2005. - № 11 (приложение) - С. 104-107. - 0,16 п.л. - личный вклад 50%.

2. Терновская Л.Н., Алешукина А.В., Голошва Е.В., Черкашина Н.Е., Калинина Т.Э., Гапон М.Н. Патент на изобретение «Питательная среда для выделения лактобактерий» № 2202609 от 20.04.2003 г. - личный вклад 7,7%.

3. Гапон М.Н., Терновская Л.Н., Алешукина А.В. Влияние кисломолочного продукта «Наринэ» на состав микрофлоры кишечника в динамике экспериментального лекарственного дисбактериоза. // Материалы Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, симбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы». - Москва, 2004. - С. 45-46. - 0,08 п.л. - личный вклад 60%.

4. Гапон М.Н., Микашинович З.И., Саркисян О.Г. Показатели антиоксидантной защиты при экспериментальном лекарственном дисбактериозе. // Сборник работ 69-ой итоговой научной сессии КГМУ. - Курск, 2004. - С. 81. - 0,04 п.л. - личный вклад 80%.

5. Гапон М.Н. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная активность организма при экспериментальном лекарственном дисбактериозе и его коррекции. // Материалы 4-ой межвузовской Международной биохимической научно-практической конференции «Обмен веществ при адаптации и повреждении». - Ростов-на-Дону, 2005. - С. 49-50. - 0,08 п.л. - личный вклад 100%.

6. Гапон М.Н. Влияние молочнокислого продукта «Наринэ» на показатели антиоксидантной защиты организма при экспериментальном лекарственном дисбактериозе. // Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием.- Уфа, 2005. - 4.2. - С. 314-315. - 0,08 п.л. - личный вклад 100%.

7. Гапон М.Н., Белоусова Е.С., Олемпиева Е.В. // Состояние глутатионзависимой системы организма при экспериментальном лекарственном дисбактериозе. - Материалы итоговой научной конференции сотрудников КГМУ. - Курск, 2006. - С. 27. - 0,04 п.л. - личный вклад 80%.

8. Гапон М.Н., Белоусова Е.С., Олемпиева Е.В. // О возможности профилактики лекарственного дисбактериоза кишечника пищевым продуктом. - Материалы 1-ой научно-практической конференции ЮФО «Рациональное и лечебное питание». - Ростов-на-Дону, 2006. - С. 116-118. - 0,12 п.л. - личный вклад

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОЗ - антиоксидантная защита

АОС - антиоксидантная система

ГПО - глутатионпероксидаза

ГР - глутатионредуктаза

МДА - малоновый диальдегид

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

ТБК - тиобарбитуровая кислота

GSH - восстановленный глутатион

Размещено на Allbest.ru