Молекулярно-генетический анализ тапеторетинальной абиотрофии в Республике Башкортостан

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Молекулярно-генетический анализ тапеторетинальной абиотрофии в Республике Башкортостан

03.00.15 - генетика

Гринберг Э.Р.

Москва 2007

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Хуснутдинова Эльза Камилевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Поляков Александр Владимирович

кандидат медицинских наук, доцент

Прытков Александр Николаевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский Государственный

Медицинский Университет Росздрава

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Тапеторетинальная абиотрофия (ТРА) - наследственное заболевание с первичным диффузным поражением фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки, при котором отмечаются характерные функциональные изменения и типичная картина глазного дна с пигментными костными тельцами. ТРА - наиболее распространенное заболевание из всех дистрофий сетчатки, выявляемое с частотой 1:4000 населения (Hamel C. et al., 2006). Типы наследования ТРА разнообразны и их частота существенно различается в разных популяциях: рецессивная форма, в среднем, встречается с частотой 20-35%, доминантная - с частотой 9-43% и сцепленная с полом - с частотой 8-45%. Высока частота спорадических форм ТРА - 23-48% (Rivolta C. et al., 2002). В настоящее время установлено, что разнообразие клинически форм ТРА обусловлено различными мутациями в генах, кодирующих белки каскада фототрансдукции, зрительного цикла, цитоскелета фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки. Наиболее частой причиной возникновения ТРА являются мутации в генах родопсина (RHO), трансретинальацетилазы (RPE65) и периферина (RDS/PRPH2) (Phelan J.K. et al., 2000; Maubaret C., Hamel C., 2005). Мутации в гене родопсина обуславливают развитие 25-30% всех случаев аутосомно-доминантных форм ТРА. Мутации в гене RPE65, ответственны за 2% всех случаев ТРА, 6-12% всех аутосомно-рецессивных ТРА (Gu S. et al., 1997; Rivolta C. et al., 2002) и 16% случаев возникновения амавроза Лебера (Morimura H. et al., 1998). Мутации в гене RDS/PRPH2 являются причиной 5-10% случаев аутосомно-доминантной формы ТРА (Sohocki M. et al., 2001; McNally N. et al., 2002). Высокий удельный вес тапеторетинальной абиотрофии среди наследственных дегенераций сетчатки, инвалидизирующее течение и отсутствие эффективных терапевтических методов ставят проблему изучения этого заболевания и проведения профилактических мероприятий, направленных на предотвращение возникновения повторных случаев заболевания в отягощенных семьях, в число первостепенных и социально-значимых. Для проведения эффективной целенаправленной профилактики необходимо выяснение популяционно-географических закономерностей распространения заболевания. В последние годы идет интенсивное накопление знаний о дегенерациях сетчатки, расширяются возможности проведения дополнительных методов исследования, разрабатываются методы ДНК-диагностики, поэтому в настоящее время особый интерес представляет молекулярно-генетическое исследование ТРА, направленное на выявление первичного генетического дефекта заболевания, что позволит в будущем проводить дифференциальную, пресимптоматическую и пренатальную диагностику ТРА.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является изучение распространенности тапеторетинальной абиотрофии и анализ генов родопсина (RHO), трансретинальацетилазы (RPE65) и периферина (RDS/PRPH2) у больных с тапеторетинальной абиотрофией и в контрольной группе из Республики Башкортостан.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. оценить распространенность тапеторетинальной абиотрофии в Республике Башкортостан;

2. провести поиск мутаций и полиморфных вариантов гена родопсина (RHO) у больных с ТРА из Республики Башкортостан;

3. провести поиск мутаций и полиморфных вариантов гена трансретинальацетилазы (RPE65) у больных с ТРА из Республики Башкортостан;

4. провести поиск мутаций и полиморфных вариантов гена периферина (RDS/PRPH2) у больных с ТРА из Республики Башкортостан;

5. создать национальный компьютерный регистр «Тапеторетинальная абиотрофия» в Республике Башкортостан.

Научная новизна. Впервые получены данные по распространенности ТРА в Республике Башкортостан, которая составила 21 на 10⁵ населения, что сопоставимо с уровнем распространенности в европейских популяциях. Проведенный впервые анализ мутаций генов родопсина (RHO), трансретинальацетилазы (RPE65) и периферина (RDS) у больных ТРА из РБ позволил установить, что к диагностически значимым мутациям, приводящим к развитию ТРА у больных из РБ, относятся P347L, R252P в гене RHO и R91W, 927delС в гене RPE65. Впервые обнаружены две новые мутации R252P в гене RHO и 927delС в гене RPE65 у 3 членов одной семьи с ТРА. Впервые у больных ТРА и в контрольной группе здоровых индивидов из РБ установлены различия в характере распределения частот генотипов по полиморфным локусам 910C>G(Q304E), 929G>A(R310K), 1013A>G(D338G) и 1054C>T гена периферина (RDS/PRPH2).

Научно-практическая значимость. Полученные данные представляют практический интерес для понимания молекулярно-генетических механизмов возникновения ТРА и позволяют предложить новые направления в разработке подходов для ДНК-диагностики ТРА. Результаты исследования могут быть использованы при чтении спецкурсов в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников. Национальный автоматизированный регистр «Тапеторетинальная абиотрофия» в РБ обеспечивает эпидемиологический мониторинг заболевания и оптимизацию лечебно-диагностической и диспансерной работы офтальмологов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Распространенность ТРА в Республике Башкортостан сопоставима с показателями распространенности ТРА в странах Европы.

2. В гене RHO идентифицировано две мутации: P347L, новая мутация R252P и два изменения нуклеотидной последовательности у больных ТРА из Республики Башкортостан.

3. Существуют статистически значимые различия в характере распределения частот аллелей и генотипов IVS3+4c>t гена родопсина (RHO) у больных с ТРА и в контрольной группе здоровых индивидов из Республики Башкортостан.

4. В гене RPE65 идентифицировано две мутации: R91W, новая мутация 927delС и один полиморфизм у больных ТРА из Республики Башкортостан.

5. Существуют статистически значимые различия в характере распределения частот генотипов по полиморфным локусам 910C>G(Q304E), 929G>A(R310K), 1013A>G(D338G) и 1054C>T гена периферина (RDS/PRPH2) у больных с ТРА и в контрольной группе здоровых индивидов из Республики Башкортостан.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на Ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека (ESHG) в 2005 (г. Прага, Чехия), 2006 (г. Амстердам, Нидерланды); Пятом (V) съезде Российского общества медицинских генетиков в 2005 (г. Уфа); Всероссийской научно-практической конференции «Вопросы офтальмогенетики» в 2005 (г. Москва); 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых в 2006 (г. Пущино); 9-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей в 2006 (г. Санкт-Петербург); Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН в 2006 (г. Москва); 7-ом Балканском съезде по генетике человека (BMHG) в 2006 (г. Скопье, Македония); Ежегодной конференции Европейского общества по исследованию зрения и глаз (EVER) в 2006 (г. Виламура, Португалия).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 190 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 75 рисунков. Список литературы включает 224 источника.

Материалы и методы

Общая характеристика выборки больных и контрольной группы.

Для проведения эпидемиологических исследований использована база данных по больным, состоящим на учете в ГУ Уфимском научно-исследовательском институте глазных болезней АНРБ с клиническим диагнозом тапеторетинальная абиотрофия и материалы ежегодных отчетов офтальмологической службы РБ за 2001 - 2005 гг., предоставляемых ЦРБ и ЛПУ г. Уфы в распоряжение Медико-информационного аналитического центра МЗ РБ.

Молекулярно-генетический анализ проведен для 123 неродственных больных (62 женщины и 61 мужчина), а также членов их семей (всего 180 человек). Забор крови больных осуществляли на базе ГУ Уфимского научно-исследовательского института глазных болезней АНРБ, ГОУ Уфимской коррекционной специализированной школы-интерната для детей с нарушениями зрения №28 г. Уфы и в ходе экспедиционных выездов в районы РБ. Клиническая картина обследованных больных: 120 неродственных больных с диагнозом ТРА на разных стадиях заболевания (периферическая и смешанная формы) и 3 неродственных больных с диагнозом амавроз Лебера. По возрасту манифестации заболевания больные разделились на три группы: первая группа - пациенты, первые признаки заболевания у которых появились в I декаде жизни (43,6%), вторая группа - пациенты с манифестацией заболевания во II декаде (36,3%), третья группа - пациенты, первые признаки заболевания у которых появились в III декаде и позже (20,1%). По этническому составу больные распределились следующим образом: 37 русских, 32 татар, 26 башкир, по 1 представителю удмуртской, украинской, таджикской, узбекской, табасаранской, еврейской национальностей, 2 представителя чувашской, 4 представителя марийской национальностей и 16 метисов от межнациональных браков вышеперечисленных этносов. Контрольная группа состояла из образцов ДНК 133 неродственных клинически здоровых индивидов, сопоставимых по полу, возрасту и этнической принадлежности с обследуемой группой (все индивиды из группы контроля были обследованы в ГУ УфНИИГБ АНРБ). Для сравнения по этнической принадлежности были выбраны представители трех основных этнических групп - русских (50 человек), татар (50 человек) и башкир (50 человек), - проживающих на территории РБ.

Методы исследования.

Выделение геномной ДНК проводили методом последовательной фенольно-хлороформной экстракции из цельной венозной крови (Mathew C.C., 1984). абиотрофия тапеторетинальный мутация

Для поиска мутаций в генах RHO, RDS/PRPH2 и RPE65 были использованы оригинальные пары олигопраймеров, фланкирующих кодирующие области этих генов, сайты сплайсинга и прилегающие интронные области (Dryja T. P. et al., 1991; Morimura H. et al., 1998; Van Lith-Verhoeven J.C. et al., 2003). Праймеры для 5 экзона гена RHO и 4 экзона гена RPE65 были подобраны с помощью приложения PrimerSelect 5.05 из пакета программ DNAStar Inc (1993-2002).

Поиск мутаций и полиморфных вариантов генов RHO, RDS/PRPH2 и RPE65 осуществляли методом SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) (Orita et al., 1989). Денатурацию амплифицируемых фрагментов ДНК проводили стандартным щелочным методом. Фрагменты с измененной электрофоретической подвижностью, обнаруженные при помощи SSCP-анализа подвергались секвенированию на автоматическом секвенаторе ABI Prism модель 310 (Applied Biosystems, USA) согласно протоколу фирмы производителя. Анализ результатов секвенирования проводили при помощи приложения BioEdit v.5.0.9 (1997-2001), MegAlign из пакета программ DNAStar Inc. (1993-2002). Оценку влияния выявленных замен на вероятность возникновения/потери сайтов сплайсинга проводили при помощи программы Splice Prediction using Consensus Sequences (WebGene): http://www.itba.mi.cnr.it/webgene.

ПДРФ-анализ был использован для подтверждения наличия нуклеотидных замен у пробандов, их кровных родственников и в группе контроля, а также для поиска мутаций в «горячих точках» гена RHO. Использованные рестрицирующие эндонуклеазы и соответствующие буферные растворы произведены фирмой НПО «Fermentas» (Латвия). Рестрикционный анализ проводился согласно протоколам фирмы-производителя. Подбор рестрицирующих эндонуклеаз, узнающих определенную нуклеотидную последовательность, проводили с помощью приложения MapDraw из пакета программ DNAStar Inc (1993-2002) и WebCutter 2.0 (http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html).

Математическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакета программ статистического анализа Primer of Biostatistics v.4.03 (Glantz A., 1998). Для выявления случаев накопления ТРА в различных районах Республики Башкортостан использовано F-распределение (Животовский Л.А., 1991). Карта территориальной распространенности ТРА в РБ построена с помощью пакета программ ArcView GIS v. 3.0 [http://www.esri.com].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Распространенность тапеторетинальной абиотрофии в Республике Башкортостан

На 1 января 2007 года в республике было зарегистрировано 858 пациентов с ТРА (449 женщин и 409 мужчин), что определило уровень распространенности заболевания 21 на 10⁵ населения. Проведенное исследование выявило неравномерный характер распространения ТРА на территории РБ - от 0 до 30 на 10⁵ населения (рис.1). Заболевание зарегистрировано в 48 из 54 административных районов и в 18 из 21 города РБ. Выявлены районы с высокими показателями распространенности ТРА (более 25 на 10⁵ населения): Бурзянский, Балтачевский, Аургазинский, Благовещенский, Чекмагушевский и Бирский. При статистическом анализе показателей распространенности тапеторетинальной абиотрофии, достоверных случаев накопления ТРА в отдельных районах Республики Башкортостан установлено не было.

Рисунок 1. Распространенность тапеторетинальной абиотрофии на территории Республики Башкортостан.

2. Поиск мутаций в гене родопсина RHO у больных с тапеторетинальной абиотрофией из Республики Башкортостан

Проведен скрининг мутаций в кодирующих областях, сайтах сплайсинга и прилегающих интронных областях гена RHO (5 экзонов) методом SSCP-анализа у 123 неродственных пациентов с диагнозом ТРА, а также членов их семей из РБ. В гене родопсина выявлено две мутации. Одна из них - P347L является наиболее частой мутацией гена RHO, которая существует в 6 вариантах: P347L, P347T, P347A, P347S, P347Q, P347R. Данная мутация вызывает одну из тяжелых форм ТРА с быстро прогрессирующим течением (Dryja T. P. et al., 1990). Мутация P347L была обнаружена в гетерозиготном состоянии у одной больной русской этнической принадлежности и ее матери (диагноз - ТРА, смешанная форма). Клиническая картина заболевания у больных с данной мутацией из РБ не отличается от случаев, описанных в литературе. Мутация P347L достаточно часто выявляется среди больных c аутосомно-доминантной формой ТРА в различных популяциях, так, в США она встречается с частотой 3,6% (Galy A. et al., 2005). Частота всех мутаций в положении 347 белка у больных аутосомно-доминантной формой ТРА в США - 3-8% (Zhang X.L. et al., 2005, 2006). В связи с высокой частотой мутаций в кодоне 347, а также наличием сайта для рестриктазы MspI, который теряется при этих мутациях, был дополнительно проведен рестрикционный анализ 5 экзона гена RHO, который подтвердил наличие мутации P347L у двух членов из выше описанной семьи и не выявил изменений у других больных (рис. 2).

Установлено, что последние 5 аминокислот в молекуле родопсина (позиции 354-358) необходимы для правильной сортировки и транспорта RHO от комплекса Гольджи к дискам наружных сегментов фоторецепторов (Green E.S. et al., 2000). Нарушение этих процессов ведет к быстрой дегенерации фоторецепторов, поэтому пациенты с мутациями в С-концевой части родопсина (мутация P347L) имеют более быстрые темпы прогрессирования заболевания, чем пациенты с мутациями, поражающими другие участки молекулы RHO (Berson E.L. et al. 2002).

Рисунок 2. Электорофореграмма рестрикционного анализа и фрагмент сиквенса 5 экзона гена RHO: дорожки 1,2 - образцы с мутацией P347L в гетерозиготном состоянии, дорожка 3 - образец без изменения нуклеотидной последовательности.

Другая мутация - R252P гена RHO в литературе не описана. Она выявлена у трех членов одной семьи татарской этнической принадлежности с диагнозом ТРА, смешанная форма (рис. 3).

Рисунок 3. Фрагмент сиквенса 4 экзона гена RHO. Нуклеотидная последовательность образца с мутацией R252P в гетерозиготном состоянии: а) секвенирование с прямым праймером, б) секвенирование с обратным праймером.

Так как кодон 252 входит в участок связывания G-белка - трансдуцина (кодоны 231-252), изменение аминокислотного состава в этом участке: замена основной кислоты аргинина на нейтральную гидрофобную кислоту пролин, может изменять свойства белковой молекулы, влиять на присоединение трансдуцина и дальнейшую активацию ферментного каскада.

Кроме двух мутаций, в гене RHO обнаружено два изменения нуклеотидной последовательности в интронных областях: IVS1+10g>a в 1 интроне и IVS3+4c>t в 3 интроне. Изменение IVS1+10g>a ранее в литературе не описано. Оно выявлено в гетерозиготном состоянии у одной больной русской этнической принадлежности с диагнозом ТРА, периферическая форма. В группе контроля данное изменение не обнаружено. Другое изменение нуклеотидной последовательности IVS3+4c>t гена RHO, выявленное при SSCP-анализе ведет к потере одного из сайтов рестрикции для эндонуклеазы RsaI. Для дальнейшего анализа данного изменения был использован ПДРФ-анализ (рис. 4). С помощью программы Splice Prediction using Consensus Sequences (WebGene) было установлено, что шесть первых нуклеотидов 3-го интрона образуют один из сайтов сплайсинга гена RHO. Учитывая вышеизложенное, можно предположить участие IVS3+4c>t в патогенезе ТРА, одним из механизмов которого может быть нарушение процессов сплайсинга.

Рисунок 4. Электорофореграмма ПДРФ-анализа 3 экзона гена RHO: дорожки 1-3 образцы без изменений нуклеотидной последовательности, дорожка 4 - образец с изменением нуклеотидной последовательности IVS3+4c>t в гетерозиготном состоянии.

Частота данного изменения нуклеотидной последовательности IVS3+4c>t у больных составила 0,34±0,03, что достоверно выше, чем у здоровых индивидов 0,06±0,01 (ч²=63,4; р=0,0005) (табл. 1).

Таблица 1

Распределение частот аллелей и генотипов изменения нуклеотидной последовательности IVS3+4c>t гена RHO у больных с ТРА и в контрольной выборке из РБ

Также было проанализировано распределение частот аллелей и генотипов изменения IVS3+4c>t гена RHO в трех основных этнических группах РБ (русских, татар и башкир). Частота IVS3+4c>t в этих этнических группах соответствует значению, полученному при анализе частоты этого изменения у здоровых индивидов из контрольной группы, и составляет, в среднем, 0,06. Изменение нуклеотидной последовательности IVS3+4c>t гена RHO в гомозиготном состоянии ни в группе больных ТРА, ни в группе контроля, выявлено не было.

3. Поиск мутаций в гене трансретинальацетилазы RPE65 у больных с тапеторетинальной абиотрофией из Республики Башкортостан

При скрининге мутаций в кодирующих областях, сайтах сплайсинга и прилегающих интронных областях гена RPE65 (14 экзонов) методом SSCP-анализа были обнаружены мутации R91W и 927delC, полиморфизм 1056G>A. Мутация R91W, в гомозиготном состоянии вызывающая развитие амавроза Лебера, была обнаружена также в гомозиготном состоянии у пациентки с диагнозом амавроз Лебера. Мать больной являлась гетерозиготным носителем этой мутации и не имела никаких признаков глазной патологии (рис. 5).

Рисунок 5. Фрагмент сиквенса 4 экзона гена RPE65: а) нуклеотидная последовательность образца с мутацией R91W в гомозиготном состоянии; б) нуклеотидная последовательность образца с мутацией R91W в гетерозиготном состоянии.

Мутация 927delС, не описанная ранее в литературе, была выявлена в гетерозиготном состоянии в сочетании с мутацией R252P гена RHO у 3 пациентов с ТРА татарской этнической принадлежности из одной семьи (рис. 6). У всех 3 пациентов из одной семьи, несущих эти мутации наблюдается клиническая картина ТРА, смешанная форма. Манифестация заболевания произошла во второй декаде жизни в виде прогрессирующего нарушения сумеречного зрения, с течением времени наблюдалось нарастающее сужение полей зрения по периферии, глазное дно характеризовалось отложением «костных телец» по периферии сетчатки и крапчатостью в области макулы, отмечалось снижение остроты зрения и показателей электроретинографии.

Сделать какое-либо предположение о функциональной роли сочетания этих мутаций в двух разных генах пока достаточно трудно. Обе мутации выявлены в гетерозиготном состоянии. Мутация 927delC в гене RPE65 ведет к преждевременной терминации синтеза белка в результате образования стоп-кодона в 9 экзоне (всего 14 экзонов). Мутация R252P в гене RHO может также участвовать в патогенезе ТРА путем влияния на активацию ферментного каскада вследствие нарушения связывания белка трансдуцина. Следовательно, развитие ТРА у данных больных может быть результатом как отдельного проявления одной из мутации, так и следствием их совместного влияния. В литературе уже описаны случаи дигенного варианта ТРА (Loewen, C. J. R. et al., 2001). Необходимо дальнейшее изучение механизмов, с помощью которых эти мутации могут приводить к развитию ТРА на животных моделях.

R252P в гене RHO 927delС в гене RPE65

Рисунок 6. Родословная семьи больных ТРА из РБ с указанием двух новых мутаций, выявленных у трех членов этой семьи: 5 - пробанд, несущий в гетерозиготном состоянии две новые мутации: R252P в гене RHO и 927delC в гене RPE65; 6 и 3 - сестра и отец пробанда, которые также являются носителями двух новых мутаций: R252P в гене RHO и 927delC в гене RPE6; 4 - мать пробанда, у которой отсутствуют данные мутации.

Нейтральный полиморфизм 1056G>A, выявленный при исследовании гена RPE65, встречается с частотой 0,04±0,01 на хромосомах здоровых индивидов из группы контроля и с частотой 0,03±0,01 на хромосомах больных с ТРА (ч²=0,58; р=0,45).

4. Поиск мутаций в гене периферина (RDS/PRPH2) у больных с тапеторетинальной абиотрофией из Республики Башкортостан

Анализ кодирующих областей, сайтов сплайсинга и прилегающих интронных областей гена периферина (3 экзона) выявил 6 полиморфных вариантов. Два из них, 318T>C и 1426G>A 3'-UTR, не являются патогенетически значимыми. Полиморфизм 318T>C не приводит к изменению аминокислотной последовательности белка (V106V), частота аллеля *C полиморфизма 318T>C в группе больных ТРА и в группе контроля из РБ составила 0,26±0,028 и 0,33±0,029, соответственно (ч²=2,39; р=0,12). Полиморфизм 1426G-A 3'-UTR находится в некодирующей части 3 экзона гена RDS, его частота в группе больных ТРА - 0,23±0,027, в группе контроля - 0,27±0,027 (ч²=1,02; р=0,31). Четыре полиморфных варианта в позициях 910C>G(Q304E), 929G>A(R310K), 1013A>G(D338G) и 1054C>T 3-го экзона гена RDS/PRPH2 (рис. 7), по данным литературы, могут образовывать различные группы сцепления или минигаплотипы, 4 из которых были установлены ранее: *G⁹¹⁰*A⁹²⁹*G¹⁰¹³*C¹⁰⁵⁴ (аллель I), *C⁹¹⁰*A⁹²⁹*A¹⁰¹³*C¹⁰⁵⁴ (аллель II), *C⁹¹⁰*G⁹²⁹*A¹⁰¹³*C¹⁰⁵⁴ (аллель III) и *G⁹¹⁰*A⁹²⁹*G¹⁰¹³*T¹⁰⁵⁴ (аллель IV) (Telmer C.A. et al., 2003).

При обследовании больных ТРА и группы контроля из РБ кроме четырех известных, был выявлен 5-й минигаплотип *C⁹¹⁰*A⁹²⁹*A¹⁰¹³*T¹⁰⁵⁴ (аллель V) в группе больных ТРА. Сочетания 5-ти минигаплотипов образуют 7 вариантов генотипов в группе больных ТРА и в группе здоровых индивидов из РБ (табл. 2).

Таблица 2

Генотипы 3 экзона гена RDS, выявленные у больных с ТРА и в группе контроля из Республики Башкортостан

Наиболее частыми генотипами, как в группе больных, так и в группе контроля из РБ являются генотипы 4 (*G/*G⁹¹⁰ *A/*A⁹²⁹ *G/G¹⁰¹³ *T/*T¹⁰⁵⁴) и 5 (*C/*G⁹¹⁰ *G/*A⁹²⁹ *A/*G¹⁰¹³ *C/*T¹⁰⁵⁴). Частота 4 генотипа составляет 0,62 в группе больных ТРА и 0,44 в группе контроля (ч2=7,1, p=0,008). Генотип 5 встречается достоверно чаще в группе контроля 0,37, по сравнению с группой больных ТРА 0,06 (ч2=32,25, p=0,0005). Три генотипа: *C/*C⁹¹⁰ *A/*A⁹²⁹ *A/*A¹⁰¹³ *C/*C¹⁰⁵⁴ (2), *C/*C⁹¹⁰ *A/*A⁹²⁹ *A/*A¹⁰¹³ *C/*T¹⁰⁵⁴ (6) и *C/*G⁹¹⁰ *A/*A⁹²⁹ *A/*G¹⁰¹³ *C/*T¹⁰⁵⁴ (7) не встречаются в группе контроля. Второй, шестой и, возможно, седьмой генотипы содержат минигаплотип II - *C⁹¹⁰*A⁹²⁹*A¹⁰¹³*C¹⁰⁵⁴, описанный в 2003 году (Telmer C.A. et al., 2003). Есть данные о сцеплении минигаплотипа II с мутацией сайта сплайсинга 2-го интрона гена RDS IVS2+3a>t (Telmer C.A. et al., 2003). При секвенировании 2-го интрона гена RDS всех образцов ДНК больных, предположительно содержащих минигаплотип II, никаких изменений нуклеотидной последовательности в этой области выявлено не было.

5. Разработка формализованной карты обследования больных с ТРА и создание автоматизированного регистра «Тапеторетинальная абиотрофия» в Республике Башкортостан

При проведении анализа состояния здоровья населения, планирования необходимой медико-социальной помощи и медико-генетического консультирования требуется учитывать множество разнообразных данных. Для систематизации и стандартизации этой информации необходима разработка типовой медицинской документации. Нами была составлена формализованная карта (ФК) обследования пациентов с ТРА, которая послужила основой для последующей разработки автоматизированного регистра «Тапеторетинальная абиотрофия». ФК состоит из пяти частей: паспортной, генеалогической, анамнестической, клинической и лабораторно-инструментальной, каждая из которых делится на разделы и подразделы. ФК заполняется врачом-офтальмологом и врачом-генетиком на основе информации, полученной непосредственно от пациента, его родственников и данных медицинской документации. ФК может быть использована и для первичной диагностики ТРА, и для дифференциального диагноза, так как разработана на основе общепринятых диагностических критериев ТРА. В процессе наблюдения за пациентами возможно изменение и пополнение данных в соответствии с новыми сведениями. ФК удобна для обследования пациентов на дому и во время выездов в районы по их месту жительства. Однако обследование больных с наследственными заболеваниями имеет свои специфические особенности. Врачу приходится иметь дело с большим объемом информации, так как необходимо обследовать не только больных, но по возможности и большинство их родственников. Так же требуется анализ заболевания по многочисленным разнообразным показателям, динамическое наблюдение за пациентами и проведение повторных обследований, составление отчетов для ЛПУ. Поэтому актуальным является разработка автоматизированного регистра, позволяющего хранить и анализировать большое количество информации. На основе ФК нами разработан и внедряется в действие на базе ГУ Уфимского научно-исследовательского института глазных болезней АНРБ автоматизированный регистр «Тапеторетинальная абиотрофия».

Основными функциями регистра являются:

1) формирование базы данных, электронное ведение документации о больных с ТРА;

2) оценка динамики состояния каждого больного и обследуемой группы в целом;

3) формирование выборки больных по ряду критериев;

4) оптимизация диспансерного наблюдения больных с ТРА;

5) формирование отчетной документации (консультативных заключений, эпикризов, результатов эпидемиологического анализа);

6) статистический анализ данных для клинических, эпидемиологических и научных целей;

7) эпидемиологический мониторинг ТРА в Республике Башкортостан.

Использование регистра упрощает работу врача-офтальмолога по выборке, сортировке и анализу данных, как для каждого пациента в отдельности, так и для определенной группы больных. Создание подобных регистров и объединение их в сеть сделают возможным:

- наблюдение за больными с ТРА, а также за их родственниками, являющимися потенциальными носителями патологических изменений в генах, с оценкой эффективности организации диспансерного наблюдения (на территориальном уровне обслуживания больных и консультирующихся по прогнозу потомства);

- оценку основных параметров, характеризующих состояние медико-генетической помощи;

- представление данных о распространенности ТРА в регионе и эффективности работы территориальной медико-генетической службы для внутреннего анализа и выработки собственных управленческих решений;

- получение достоверных данных для принятия решений по совершенствованию специализированной медико-генетической помощи больным ТРА и их семьям;

- обмен информацией между регионами;

- получать данные для масштабных клинико-эпидемиологических исследований.

Выводы

1. Распространенность тапеторетинальной абиотрофии в Республике Башкортостан составляет 21 на 10⁵ населения, что сопоставимо с уровнем распространенности ТРА в странах Европы.

2. Скрининг 5 экзонов гена родопсина (RHO) у больных с ТРА из Республики Башкортостан выявил 2 мутации: R252P и P347L в отдельных семьях. Мутация R252P описана впервые.

3. Выявлены статистически значимые различия в характере распределения частот аллелей и генотипов варианта IVS3+4c>t гена RHO у больных с ТРА и в контрольной группе здоровых индивидов из Республики Башкортостан.

4. Анализ 14 экзонов гена трансретинальацетилазы (RPE65) у больных с ТРА из Республики Башкортостан выявил 2 мутации: R91W и 927delC в отдельных семьях. Мутация del927C описана впервые.

5. Установлены статистически значимые различия в характере распределения частот генотипов по полиморфным локусам 910C>G(Q304E), 929G>A(R310K), 1013A>G(D338G) и 1054C>T гена RDS у больных ТРА и в контрольной группе здоровых индивидов из Республики Башкортостан.

6. Разработан автоматизированный регистр «Тапеторетинальная абиотрофия» в Республике Башкортостан, который позволяет хранить и анализировать данные о больных ТРА и их семьях, проводить мониторинг заболевания в республике.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Grinberg E.R., Dzhemileva L.U., Khusnutdinova E.K. Mutation analysisof the RPE65 gene in patients with nonsyndromic retinitis pigmentosa from Bashkortostan // European Journal of Human Genetics - European Human Genetics Conference (ESHG). - Prague, 2005. - P.237.

2. Гринберг Э.Р., Джемилева Л.У., Хуснутдинова Э.К. Молекулярно-генетический анализ гена RPE65 у больных с пигментным ретинитом из Башкортостана // Медицинская генетика 2005 (часть I). Тезисы докладов V съезда Российского общества медицинских генетиков - Уфа, 2005. - №4. с. 175-176.

3. Гринберг Э.Р., Джемилева Л.У., Хуснутдинова Э.К. Изучение гена RPE65 у больных с пигментным ретинитом // Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции «Вопросы офтальмогенетики» - Москва, 2005. - С.44-48.

4. Гринберг Э.Р., Джемилева Л.У., Хуснутдинова Э.К. Скрининг мутаций в гене RPE65 у больных с пигментным ретинитом из Башкортостана // Сборник трудов Международной научно-практической конференции «Биологические науки в XXI веке. Проблемы и тенденции развития» - Бирск, 2005. - С.7-11.

5. Гринберг Э.Р., Джемилева Л.У., Хуснутдинова Э.К. Молекулярно-генетический анализ тапеторетинальной абиотрофии сетчатки // Тезисы докладов 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых - Пущино, 2006. - С.10-11.

6. Grinberg E. R., Dzhemileva L. U., Khusnutdinova E. K. Mutation analysis of RHO gene in patients with nonsyndromic retinitis pigmentosa from Bashkortostan // European Journal of Human Genetics - European Human Genetics Conference (ESHG). - Amsterdam, 2006. - P.274.

7. Гринберг Э.Р., Джемилева Л.У. Изучение генов RPE65 и RHO у больных с тапеторетинальной абиотрофией сетчатки // Тезисы докладов Девятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей - Санкт-Петербург, 2006. - С.79-80.

8. Гринберг Э.Р., Джемилева Л.У., Хуснутдинова Э.К. Молекулярно-генетический анализ тапеторетинальной абиотрофии сетчатки в Башкортостане // Материалы Международной Конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН - Москва, 2006. - С.55.

9. Grinberg E. R., Dzhemileva L. U., Khusnutdinova E. K. Analysis of RHO gene mutations in Patients with RP // 7th Balkan Meeting of Human Genetics - Skopje, 2006. - P. 40.

10. Grinberg E. R., Dzhemileva L. U., Khusnutdinova E. K. Mutation analysis of RHO gene and novel mutation Arg252Pro (755G->C) in patients with nonsyndromic retinitis pigmentosa from Bashkortostan // European association for Vision and Eye Research (EVER) - Vilamoura, 2006. - P. 116.

11. Джемилева Л.У., Гринберг Э.Р., Хабибуллин Р.М., Хуснутдинова Э.К. Гены белков-коннексинов, принимающие участие в процессе звуковосприятия. \\ Вестник оториноларингологии. - 2006. - №4. - С.15-20.

12. Гринберг Э.Р., Джемилева Л.У., Хуснутдинова Э.К. Новая мутация R252P гена RHO у больных пигментным ретинитом из Башкортостана // Молекулярная биология. -2007. - №3. - С.33-35.

13. Джемилева Л.У., Гринберг Э.Р., Тазетдинов А.М., Зайдуллин И.С., Бикбов М.М., Мусина В.В., Хуснутдинова Э.К. Молекулярные основы дегенеративных процессов в сетчатке при тапеторетинальной абиотрофии сетчатки // Молекулярная биология. - 2007. - №6. - С.7-14.

Размещено на Allbest.ru