Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Изменение патогенности Klebsiella Pneumoniae при дисбиозе кишечника, вызванного бластоцистной инвазией

03.02.03 - Микробиология

кандидата медицинских наук

Бурганова Рамиля Фаритовна

Челябинск, 2011

Работа выполнена на кафедре общей и клинической фармакологии с курсом микробиологии Института медицины, экологии и физической культуры Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Бурмистрова Александра Леонидовна

доктор медицинских наук, профессор Жестков Александр Викторович

Ведущая организация: ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова»

Защита диссертации состоится «____» июня 2011 года в___часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Автореферат разослан «____»_______________ 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Л.С. Латюшина

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В последние годы наблюдается значительный рост инфекционных заболеваний, этиологически ассоциированных с условно-патогенными микроорганизмами, среди которых одно из ведущих мест занимают бактерии рода Klebsiella (Леванова Л.А., 2001; Фиалкина С.В., 2004; Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.А., 2005; Егорова С.А., 2007). Многие исследователи признают значительную роль этих бактерий в инфекционной патологии человека и особенно в развитии госпитальных инфекций вызывают 4,5-44,0% всех внутрибольничных острых кишечных инфекций, 8,7-56,9% - госпитальных пневмоний, 6,0-86,0% - бактериемий, 7,0-42,0% - инфекций мочевыводящей системы, 4,8-12,0% - инфицирование послеоперационных ран и ожоговых поверхностей. Спектр заболеваний, вызываемых клебсиеллами, чрезвычайно широк, они являются причиной заболеваний различной локализации. Их выявляют как при острых кишечных, так и при ряде парентеральных инфекций - урологических, менингиальных, токсикосептических и др. К частым проявлениям клебсиеллезной инфекции относятся внутригоспитальные заболевания, наблюдаемые среди детей раннего периода жизни в родовспомогательных учреждениях, больных в палатах интенсивной терапии, онкологических, геронтологических стационарах, ожоговых центрах (Тришин А.В. и соавт., 2005).

Клебсиеллезы характеризуются тяжелым течением и высокой летальностью, многообразием клинических проявлений. Однако концентрация клебсиелл в различном биологическом материале, полученном у больных и контактных, колеблется в значительных пределах, нередко клебсиеллы обнаруживаются в верхних дыхательных путях, в кишечнике и у здоровых людей.

Вероятно, этим обусловлено неоднозначное суждение об этиологической роли клебсиелл в развитии инфекционного заболевания. По данным некоторых авторов, у детей раннего возраста без клинических проявлений острого кишечного заболевания в значительном количестве выделяют различные энтеробактерии. Несмотря на проведение этиотропного лечения и применение пробиотиков, длительность их выделения может продолжаться несколько лет (Коршунов В.М., 2001; Леванова Л.А., 2002).

Поскольку эти микроорганизмы являются представителями факультативной микрофлоры толстого кишечника, обоснование их этиологической значимости при патологических состояниях даже при массивности выделения является сложной задачей и требует дальнейшего изучения факторов патогенности бактерий рода Klebsiella.

Показано, что условно-патогенные энтеробактерии, относящиеся к факультативной микрофлоре кишечника, обладают различными факторами патогенности (Бондаренко В.М., 1996; Мавзютов А.Р. и соавт., 2007; Жеребцов Н.Ю. и соавт., 2007). Однако информация о них до сих пор неполная, мало изученными являются генетические детерминанты факторов патогенности клебсиелл. Особую актуальность данная проблема приобретает в связи с высокой мобильностью этих нуклеотидных последовательностей, что позволяет им распространяться среди близкородственных бактерий. Именно интеграция, стабилизация и экспрессия генов вирулентности лежат в основе формирования новых свойств, в том числе патогенных.

В течение последних лет получены данные о значительном влиянии на микробиоценоз кишечника паразитарных инвазий (Торопова Н.П., Сафронова Н.А., Гордеева Л.М., 1998). Обнаружена роль паразитозов в развитии дисбиоза, сопровождающегося нарушением биоценотических взаимоотношений между патогенными бактериями и нормальной кишечной микрофлорой. В связи с этим, особую актуальность приобретает широко распространенная протозойная инвазия, обусловленная паразитированием в толстом кишечнике простейших Blastocystis hominis. Показано, что Blastocystis hominis способствуют реализации патогенного потенциала бактерий рода Proteus (Курзин А.В., 2008; Moe K.T. et al., 1998). Однако влияние бластоцист на свойства других энтеробактерий, в частности клебсиелл, до сих пор остается не изученным.

Цель исследования. Выявить факторы патогенности и их генетические детерминанты, а также чувствительность к антибактериальным препаратам у Klebsiella pneumoniae, выделенных при инвазии простейших Blastocystis hominis у гастроэнтерологических больных.

Задачи исследования:

1. Определить частоту встречаемости бластоцистной инвазии у гастроэнтерологических больных в зависимости от нозологической формы, стадии и продолжительности заболевания.

2. Оценить состояние микрофлоры толстого кишечника гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии.

3. Провести сравнительное изучение факторов патогенности и чувствительности к антибактериальным препаратам клебсиелл, выделенных у гастроэнтерологических больных при наличии и отсутствии у них бластоцистной инвазии.

4. Дать сравнительную характеристику частоты встречаемости некоторых генетических детерминант патогенности клебсиелл, изолированных у гастроэнтерологических больных в условиях бластоцистной инвазии и без нее.

Научная новизна работы. Впервые обнаружено, что у гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии среди условно-патогенных энтеробактерий доминируют бактерии рода Klebsiella.

Показано достоверное увеличение экспрессии в пуле штаммов клебсиелл, выделенных при бластоцистозе, генетических детерминант патогенности, обеспечивающих адгезию и токсинообразование (рар С, hly A, elt LT-1 и LT-2).

Впервые установлено, что уровень распространенности изученных ампликонов у штаммов Klebsiella pneumoniae после их сокультивирования с вирулентными бластоцистами достоверно увеличивался.

Дана характеристика особенностей микропейзажа кишечника гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии. Показаны глубокие перестройки микробиоценоза кишечника, сопровождающиеся сменой ценотипа и иерархии групп микроорганизмов, которые зависели от периода (обострение, ремиссия) и продолжительности заболевания. Степень реализации патогенного потенциала клебсиелл усиливалась при их взаимодействии с бластоцистами.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Частота встречаемости простейших Blastocystis hominis у гастроэнтерологических больных значительно превышала этот показатель у здоровых людей (62,9% и 5,8% соответственно, р<0,05). Данное различие было наиболее выражено при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, хроническом гастрите и холецистите. Инвазированность больных бластоцистами нарастала в зависимости от продолжительности заболевания с 63,7% пациентов при стаже 1-5 лет до 87,4% обследованных при длительности заболевания свыше 10 лет. В период обострения заболевания, по сравнению с ремиссией, повышалась не только частота встречаемости B. hominis, но и их вирулентность, а также резистентность к антипротозойным препаратам.

2. Бластоцистная инвазия сопровождалась более выраженными дисбиотическими сдвигами микробиоценоза кишечника, чем при ее отсутствии. Эти изменения проявлялись сменой абсолютных доминант и увеличением видового разнообразия, характеризующиеся снижением уровня содержания облигатной микробиоты и увеличением представителей условно-патогенной группы. Выявленные нарушения микробиоты были характерны для всех больных в период обострения заболеваний и носили менее выраженный характер во время ремиссии.

3. Среди условно-патогенных энтеробактерий, выделенных у гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии, Klebsiella spp. являлся доминирующим микроорганизмом. Достоверных различий фенотипических признаков патогенности клебсиелл, выделенных у пациентов с бластоцистной инвазией и без нее, выявлено не было, однако, обнаружено статистически подтвержденное увеличение в пуле исследуемых штаммов экспрессии некоторых генетических детерминант патогенности, усиливающейся при совместном культивировании вирулентных Blastocystis hominis. Кроме того, у клебсиелл, выделенных у больных без бластоцистной инвазии, после сокультивирования с простейшими происходило достоверное увеличение искомых ампликонов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Данные, полученные при оценке факторов патогенности бактерий рода Klebsiella, наряду с количественной характеристикой позволяют судить об их этиологической роли в возникновении дисбиотических состояний кишечника, сопровождающих заболевания пищеварительного тракта при бластоцистной инвазии. Выраженные дисбиотические сдвиги микрофлоры кишечника диктуют необходимость проведения регулярных исследований кишечного микропейзажа при данной патологии.

Высокая выявляемость бластоцист при заболеваниях желудочно-кишечного тракта диктует необходимость паразитологического обследования больных, особенно при тяжелом течении. Для выявления бластоцист рекомендуется применять, помимо микроскопического, культуральный метод, значительно повышающий эффективность диагностики.

Полученные результаты свидетельствуют о необходимости включения в программу обследования гастроэнтерологических больных проведения микробиологических и паразитологических исследований с целью прогнозирования течения заболевания для выявления дополнительных факторов, отягощающих течение основного заболевания.

Определение степени выраженности патогенных свойств и чувствительности к антимикробным препаратам отдельных представителей микробиоценоза кишечника в различные периоды гастроэнтерологических заболеваний позволяет использовать данные исследования для прогнозирования их течения, а также будет способствовать разработке наиболее оптимальной терапии данных заболеваний с учетом микроэкологических особенностей кишечника.

Получен патент на изобретение РФ № 2224465 от 27.02.2004. «Способ заражения экспериментальных животных бластоцистами».

Опубликованы практические рекомендации «Проблема клебсиеллезов в неинфекционной клинике» (г. Ульяновск, 1998) и «Микрофлора кишечника при бластоцистозной инвазии» (г. Ульяновск, 2003).

Результаты исследований используются в процессе преподавания на кафедрах биологии и биоэкологи, инфекционных и кожно-венерических болезней, курса микробиологии ГОУ ВПО «Ульяновский государственный университет». бластоцистный инвазия гастроэнтерологический кишечник

Апробация работы и публикации. Диссертация выполнена в соответствии с учебным планом научной работы ГОУ ВПО «Ульяновский государственный университет».

Результаты работы доложены на Региональной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы современного здравоохранения и экологии» (г. Ульяновск, 2003); XIII ежегодной научно-практической конференции студентов и аспирантов (г. Ульяновск, 2003, 2004, 2005); 11-й межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и соискателей (г. Пенза, 2004); 45-й научно-практической межрегиональной конференции врачей (г. Ульяновск, 2010).

По теме диссертации опубликовано 23 научные работы, из них 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, патент РФ на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка использованных литературных источников. Список литературы включает 217 источников, в том числе 133 - отечественных автора и 84 - зарубежных. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 32 рисунками.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. При выполнении работы клинические изоляты микроорганизмов получали в период 2007-2009 гг. у 243 больных, находящихся на лечении в ГУЗ Ульяновская областная клиническая больница (г. Ульяновск), с заболеваниями желудочно-кишечного тракта. Из всех обследованных больные язвенной болезнью желудка составили 54 (22,2%), язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки - 56 (23,0%), хроническим гастритом - 32 (13,2%), хроническим холециститом - 38 (15,6%), синдромом раздраженного кишечника - 32 (13,2%), неспецифическим язвенным колитом - 31 (12,8%) пациент. Группа сравнения включала 52 клинически здоровых человека, репрезентативных по полу и возрасту.

Программа исследования состояла из нескольких этапов:

- отбор пациентов и включение их в исследование;

- выявление бластоцистной инвазии у гастроэнтерологических больных;

- оценка бактериального пейзажа кишечника пациентов в зависимости от наличия бластоцистной инвазии;

- характеристика вирулентности клебсиелл, выделенных у пациентов с заболеваниями желудочно-кишечного тракта при бластоцистозе;

- молекулярно-генетические исследования клинических изолятов к

Klebsiella pneumoniaе;

- статистическая обработка полученных данных.

В работе были использованы штаммы Klebsiella pneumoniaе (n=190), выделенные у 78,2% пациентов из 243 обследованных больных.

С целью культивирования кишечной микробиоты использовали специальные дифференциально-диагностические и элективные среды. Изучение микрофлоры кишечника у больных и лиц контрольной группы проводили согласно приказу Минздрава России от 09.06.2003 № 231 «Об утверждении отраслевого стандарта «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника.» (ОСТ 91500.11.0004-2003) на базе бактериологической лаборатории ГУЗ Ульяновская областная клиническая больница. При изучении микробного пейзажа толстого кишечника определяли частоту высеваемости отдельных видов и их количественные показатели в пересчете на 1г фекалий (Багрянцева О.В., 2002).

Культуры, выросшие на питательных средах, подвергали групповой (анаэробные, неспорообразующие бактерии), родовой (лактобациллы, бифидобактерии, энтерококки) и видовой идентификации (стафилококки, эшерихии). Таксономическую принадлежность изолированных бактерий оценивали на основании изучения роста бактерий в аэробных и анаэробных условиях, отношения к окраске по Граму, характера роста на селективных средах, биохимической и серологической идентификации. Адгезивную колонизирующую и цитотоксическую активность исследуемых штаммов изучали на перевиваемых клеточных линиях НЕр-2 (Gibb А.Р., 1993).

Для детекции генов, кодирующих факторы патогенности Klebsiella pneumoniae, применяли ПЦР со специфическими праймерами (Muhldorfer I., 1994; Tamaki Y., 2005). Тотальную ДНК для идентификации генов выделяли с использованием набора реагентов ООО «ИзоГен» (Москва), НПФ «Литех» (Москва).

Проводили выявление генетических детерминант синтеза Р-фимбрий (pap С), б-гемолизина (hly A) и термолабильных энтеротоксинов (elt LT-1, LT-2). Для этого использовали праймеры, указанные в таблице 1.

Таблица 1. Используемые праймеры и соответствующие температуры отжига

PCR мишень	Название праймера	Нуклеотидная последовательностьпраймера	Тm (°C)
papС	PAP1 (f)	5,-GACGGCTGTACTGCAGGGTGTGGCG-3,	65
	PAP2®	5,-ATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATA-3,	65
hly	hly A1(f)	5,-GGTGCAGCAGAAAAAGTTGTAG-3,	57
	hly A2®	5,-TCTCGCCTGATAGTGTTTGGTA-3,	64
elt	LT1(f)	5,-ATTTACGGCGTTACTATCCTC-3,	50
	LT2®	5,-TTTTGGTCTCGGTCAGATATG-3,	50

Наличие бластоцист выявляли путем микроскопии нативных или окрашенных препаратов, приготовленных из фекалий больных. Размеры бластоцист определяли при помощи окуляр-микрометра. Исследования по выделению и первичной идентификации бластоцист из биологического материала проводили на базе бактериологической лаборатории ГУЗ Ульяновский областной клинический кожно-венерологический диспансер. Культивирование простейших B. hominis проводили с использованием среды Suresh CEM.

Микрофотографии сделаны на базе лаборатории научных исследований экспериментальной и клинической морфологии медицинского факультета ГОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» с использованием микроскопа «Биолам I» (х1000).

Все полученные данные подвергали математической обработке с определением коэффициента достоверности Стьюдента и проведением корреляционного анализа Спирмена. Статистическую обработку материала осуществляли с помощью пакета программ Statistica 8,0.

Результаты исследований. Из 243 обследованных у 153 больных (62,9%) были обнаружены B. hominis, в группе сравнения инвазированность составила 5,8%.

Среди выделенных из фекалий Blastocystis hominis встречались две формы - вакуолярная и гранулярная, имеющие значительные структурные отличия. Вакуолярные формы бластоцист были обнаружены у 136 (88,9%), гранулярные - у 11 (7,2%) инвазированных больных, у 6 пациентов (3,9%) встречались обе формы бластоцист.

Выявляемость бластоцист у больных язвенной болезнью желудка (ЯБЖ) составила 88,9%, язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ЯБДК) - 81,2%, хроническим гастритом (ХГ) - 66,1%, хроническим холециститом (ХХ) - 50%, синдромом раздраженного кишечника (СРК) - 37,5%, неспецифическим язвенным колитом (НЯК) - 35,5%. Частота встречаемости бластоцист была наиболее высокой при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки (рис.1).

Рис. 1. Инвазированность обследованных с различными заболеваниями органов пищеварительного тракта

Анализ инвазированности бластоцистами показал, что в стадии обострения заболевания бластоцисты выявлялись у 71,5±19,6% пациентов, в то время как в период ремиссии показатель снижался до 57,7±9,8% (p<0,05).

С целью аргументации этиологической значимости бластоцист в развитии патологического процесса изучена их вирулентность. Установлено, что 71,3±4,7% штаммов бластоцист, выделенных у больных во время обострения заболевания, обладали вирулентностью, в то время как в период ремиссии доля вирулентных штаммов уменьшалась до 42,5±3,4% (ч²=23,6; p<0,001). Уровень вирулентности в период обострения заболеваний варьировал от LD₅₀ /lg 3,1±0,4 до LD₅₀ /lg 5,6±0,6. В зависимости от величины этого показателя все вирулентные штаммы были разделены на 3 группы.

Наиболее часто у пациентов с заболеваниями ЖКТ обнаруживались бластоцисты 2-й группы (43,1%), их вирулентность составила LD₅₀/lg 4,6±0,5. У бластоцист 1-й группы (27,3%) показатель вирулентности был ниже - LD₅₀/lg 3,0±0,2, у простейших 3-й группы (29,6%) - LD₅₀/lg 5,4±0,1 (рис. 2).

Рис. 2. Соотношение клинических изолятов Blastocystis hominis с различной вирулентностью (LD₅₀/lg)

Проведенное изучение микробиоценоза кишечника у гастроэнтерологических больных выявило значительное уменьшение показателей плотности колонизации индигенной микробиоты на фоне увеличения условно-патогенной (табл. 2).

Таблица 2. Микрофлора толстого отдела кишечника в зависимости от наличия бластоцистной инвазии у гастроэнтерологических больных

Микроорганизмы	Больные (n=243)
	с бластоцистной инвазией (n=153)	без бластоцистной инвазии (n=90)
	абс.	%	абс.	%
Bifidobacterium	121	79,1±6,7*	89	98,9±6,2
Lactobacillus	112	73,2±3,2*	83	92,2±5,7
E. coli типичные	141	92,2±4,9	88	97,8±7,2
E. coli лактозонегативные	21	13,7±2,6*	8	7,9±0,5
E. coli гемолитические	78	50,1±6,2*	19	21,1±8,4
Enterococcus	76	49,7±3,8	49	53,4±3,2
Klebsiella	119	77,8±5,2	71	78,9±3,6
S. viridans	31	20,3±3.7	17	18,9±2.6
S .aureus	14	9,1±1.3	6	7,7±1,7
S. epidermidis	38	24,8±4,8	26	28,9±4,7
Proteus	63	41,2±5,2	35	38,9±4,9
Candida	79	51,6±4,1	39	43,3±5,9

Примечание: * - достоверность различий показателей с группой сравнения (p<0,05).

Указанные нарушения, характерные для дисбиоза, в наибольшей мере были выражены при заболеваниях, протекающих на фоне бластоцистной инвазии.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии значительных изменений в составе микрофлоры кишечника у обследованных лиц при бластоцистной инвазии.

Установлены значительные изменения обсемененности кишечника такими условно-патогенными представителями семейства энтеробактерий, как клебсиеллы и протеи. У пациентов с язвенной болезнью желудка уровень контаминации клебсиеллами превышал аналогичный показатель в группе сравнения в 12,3 раза, у пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки - в 12,7 раза, что значительно превышало значения микробного числа для других бактерий (рис. 3).

Рис. 3. Изменения патогенной и условно-патогенной микрофлоры кишечника при ЯБЖ и ЯБДК на фоне бластоцистной инвазии

Из выделенных 190 штаммов Klebsiella pneumoniaе 119 (77,8%) получены у гастроэнтерологических больных с бластоцистной инвазией (1 группа) и 71 (78,9%) - у пациентов с таким же спектром заболеваний, но без бластоцитоза (2 группа). У всех клинических изолятов K. pneumoniae изучали морфологические и физиологические свойства.

Из всех выделенных K. pneumoniae 72 штамма (43,7%) 1-й группы и 13 штаммов (46,4%) 2-й группы обладали слабо выраженной адгезией. Они поражали 19,22,7% и 18,72,6% клеток НЕр-2 соответственно, при этом на плазмолемме одной клетки обнаруживалось по 1-2 адгезированной бактерии, адгезивное число составило 3,30,7% и 3,10,4% соответственно.

Умеренную адгезивную активность проявили 39 штаммов (32,8%) 1-й группы и 25 штаммов (35,2%) 2-й группы. Они поражали 27,84,7% и 26,32,6% монослоя соответственно, адгезивное число в этих группах составило 3,90,6% и 3,60,4%.

Высокой адгезивностью обладали 27 штаммов (22,6%) первой группы и 15 штаммов (21,1%) второй группы. Они поражали 44,31,3% и 40,11,3% клеток НЕр-2, на каждой клетке пласта культуры фиксировались по 3-5 бактерий (адгезивное число - 4,80,7% и 4,50,9% соответственно).

Гемолитической активностью обладали 52,8% изолята Klebsiella pneumoniae 1-й группы и 51,7% штаммов 2-й группы.

В ходе работы выявлено, что частота встречаемости вирулентных клебсиелл, выделенных у гастроэнтерологических больных без бластоцистной инвазии, была достоверно меньше, чем при бластоцистной инвазии. Из 119 штаммов клебсиелл первой группы только 96 (80,7%) вызывали положительную кератоконъюнктивальную пробу. Среди клинических изолятов 2-й группы кератоконъюнктивит у животных вызывали 37 штаммов (52,1%; р<0,05). Из 96 штаммов клебсиелл 1-й группы, вызывавших положительную кератоконъюнктивальную пробу, 37 изолятов (38,5%) были выделены в ассоциации с высоковирулентными штаммами Blastocystis hominis.

Одним из основных свойств Klebsiella pneumoniae, способствующих реализации их патогенных свойств, является устойчивость к действию антибактериальных препаратов.

Таблица 3. Чувствительность к антибиотикам штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных у гастроэнтерологических больных

Антибиотики	Количество штаммов (%)
	без бластоцистоза	при бластоцистозе
гентамицин	61,4±4,7	59,3±6,1
канамицин	51,3±5,1	52,6±4,7
рифампицин	75,8±3,1*	57,2±4,4
эритромицин	58,2±7,1	55,3±4,7
оксациллин	51,4±3,2	50,1±2,9
линкомицин	87,4±5,3*	58,8±4,7
ампициллин	77,1±3,4*	57,2±4,1
пенициллин	69,7±2,8*	59,3±3,6

Примечание: * - показатель достоверности между чувствительностью к антибиотикам клебсиелл, выделенных при бластоцистозе и без него.

Проведено определение чувствительности 190 штаммов Klebsiella pneumoniae к 10 антибиотикам. Результаты проведенных исследований показали, что частота встречаемости чувствительных изолятов к различным антибиотикам была неодинакова (табл. 3).

Известно, что изменение патогенности у бактерий реализуется на генетическом уровне через мутации и генетические рекомбинации. Используя набор праймеров, амплифицирующих фрагменты генов pap С, hly A, elt LT-1, LT-2, были протестированы фенотипически различные Klebsiella pneumoniaе: 119 штаммов, выделенных у гастроэнтерологических больных с бластоцистной инвазией, и 71 изолят, выделенный из консорциумов, где бластоцисты не являлись участниками микробного сообщества.

Выявление ампликонов проводили у клебсиелл, выделенных из ассоциаций с B. hominis различной степени вирулентности, а также после их совместного культивирования. В качестве контрольного использовали эталонный штамм K. pneumoniae, содержащий гены, детерминирующие синтез факторов патогенности. Культуры бактерий при сокультивировании с простейшими отбирали в период увеличения их численности и проявления цитопатогенного действия на клетки бластоцист.

Таблица 4. Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей pap С гена у культур K. pneumoniae

Штаммы K. pneumoniae в ассоциации c бластоцистами:	Период изучения	Частота встречаемости (%) фрагмента pap С гена
Авирулентными	до сокультивирования	4,5±0,4
	после 3-х суток сокультивирования	5,3±0,9
Умеренно вирулентными	до сокультивирования	6,4 ±1,1
	после 3-х суток сокультивирования	10,8±0,21*
Высоко вирулентными	до сокультивирования	9±0,9
	после 3-х суток сокультивирования	21,8±1,5*
Клебсиеллы, выделенные у больных без бластоцистной инвазии	до сокультивирования	3,4±0,21
	после 3-х суток сокультивирования	10,4±1,2*

Примечание: * - показатель достоверности между частотой встречаемости нуклеотидных последовательностей papС гена у культур Klebsiellа pneumoniaе до и после их сокультивирования с бластоцистами (р<0,05).

Для детекции генов, кодирующих определенные факторы патогенности, были протестированы штаммы с праймерами к pap С гену. Положительный сигнал был получен в 1-й группе клебсиелл с 31 культурой (26,1%). В общем пуле штаммов, изолированных от больных 2-й группы, положительные сигналы были получены у 2 культур (2,8%) (табл. 4).

Анализ уровня распространенности ампликонов pap С генов после проведенного сокультивирования (табл.4) штаммов K. pneumoniae с бластоцистами различной степени вирулентности показал, что частота встречаемости фрагмента pap С гена клебсиелл была наиболее высокой после 3-х суток сокультивирования в ассоциации с высоковирулентными бластоцистами (21,8±2,5%).

Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей hly A гена была практически одинаковой в первой и второй группах клебсиелл (табл. 5).

Таблица 5. Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей hly A гена у культур K. pneumoniae

Штаммы K. pneumoniae в ассоциации с бластоцистами:	Период изучения	Частота встречаемости фрагмента hly A гена (%)
Авирулентными	до сокультивирования	0,9±0,3
	после 3-х суток сокультивирования	1,2±0,4
Умеренно вирулентными	до сокультивирования	1,0 ±0,3
	после 3-х суток сокультивирования	3,8±0,6
Высоко вирулентными	до сокультивирования	1,2±0,2
	после 3-х суток сокультивирования	5,3±0,4 *
Клебсиеллы, выделенные у больных без бластоцистной инвазии	до сокультивирования	0,8±0,1
	после 3-х суток сокультивирования	1,9±0,4

Примечание: * - показатель достоверности между частотой встречаемости нуклеотидных последовательностей hly A гена у культур K. pneumoniaе до и после их сокультивирования с бластоцистами (р<0,05).

Наиболее значимые различия в частоте обнаружения hly A генов имелись у клебсиелл, выделенных совместно с вирулентными бластоцистами, после их совместного культивирования

В результате изучения распространения генетических детерминант термалабильных энтеротоксинов (elt LT-1, LT-2), являющихся основными факторами патогенности клебсиелл, установлено, что при инкубации с авирулентными бластоцистами искомые ампликоны имели 2,8±0,4% и 2,5±0,3% штаммов Klebsiellа pneumoniae (табл. 6).

Таблица 6. Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей elt LT-1, LT-2 генов культур Klebsiellа pneumoniae

Штаммы K. pneumoniae в ассоциации с бластоцистами:	Период изучения	Частота встречаемости гена (%)
		elt LT-1	LT-2
Авирулентными	до сокультивирования	2,8±0,4	2,5±0,3
	после 3-х суток сокультивирования	7,2±0,7*	2,6±0,5
Умеренно вирулентными	до сокультивирования	4,1±0,4	3,6±0,4
	после 3-х суток сокультивирования	8,6±0,7*	7,2±0,9*
Высоко вирулентными	до сокультивирования	23,4±2,7	5,3±1,2
	после 3-х суток сокультивирования	34,1±2,1*	14,1±1,3*
Клебсиеллы, выделенные у больных без бластоцистной инвазии	до сокультивирования	2,1±0,9	2,3±0,8
	после 3-х суток сокультивирования	12,3±2,1*	13,7±2,3*

Примечание: * - показатель достоверности между частотой встречаемости нуклеотидных последовательностей elt LT-1 и LT-2 генов K. pneumoniaе до и после их сокультивирования с бластоцистами (р<0,05).

Частота обнаружения ампликонов, специфичных изучаемым генам, после проведения совместного культивирования клебсиелл с умеренновирулентными бластоцистами увеличилась в 2,1 и 2,0 раза, с высоковирулентными бластоцистами - 1,5 и 2,7 раза соответственно (табл.6).

В работе установлено статистически достоверное увеличение встречаемости изучаемых генов, индуцированное усилением вирулентности симбионтов Blastocystis hominis. Полученные данные свидетельствуют об изменении патогенного потенциала бактерий под воздействием бластоцист, приводящим к селекции и накоплению вирулентных вариантов в гетерогенной бактериальной популяции.

Выводы

1. Простейшие Blastocystis hominis выявлены у 62,9% гастроэнтерологических больных, у здоровых людей этот показатель не превышает 5,8%. Наиболее высокие показатели инвазированности установлены при язвенной болезни желудка (88,9%), язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (81,2%), хроническом гастрите (66,1%) и хроническом холецистите (50,0%). Частота встречаемости B. hominis, а также их вирулентность и резистентность к антипротозойным препаратам зависит от продолжительности и периода заболевания.

2. Гастроэнтерологические заболевания при бластоцистной инвазии сопровождаются более выраженным дисбиозом кишечника, чем без бластоцистоза. Это проявляется снижением доминирования основных симбионтов, таких как бифидобактерии и лактобациллы, на фоне повышения показателей частоты встречаемости и плотности колонизации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, максимально выраженных у бактерий рода Klebsiella. Выявленные изменения микробиоты кишечника усиливаются в период обострения заболевания и носят менее выраженный характер во время ремиссии.

3. Частота встречаемости вирулентных и антибиотикорезистентных клебсиелл, выделенных у гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии достоверно выше, чем у пациентов без бластоцистоза.

4. Установлено увеличение частоты выявления генетических детерминант факторов патогенности клебсиелл, обеспечивающих адгезию и токсинообразование (рар С, hly A, elt LT-1 и LT-2), изолированных у гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии. Уровень распространенности изученных ампликонов у штаммов Klebsiella pneumoniae после их сокультивирования с вирулентными бластоцистами увеличивается.

Практические рекомендации

1. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения микробиологических исследований, направленных на выявление дисбиоза кишечника, развивающегося у пациентов с ЯБЖ, ЯБДК, ХГ на фоне бластоцистной инвазии, для последующей коррекции дисбиотических нарушений с учетом продолжительности и степени тяжести заболевания.

2. В протокол исследования на дисбиоз кишечника у больных гастроэнтерологического профиля дополнительно включать исследования на выявление Blastocystis hominis с целью дальнейшей санации пациентов.

3. Для выявления бластоцист рекомендуется применять, помимо микроскопического, культуральный метод, значительно повышающий эффективность диагностики.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бурганова, Р.Ф. Значение простейших Blastocystis hominis в патологии человека / Р.Ф. Бурганова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Л.К. Богомолова, Н.А. Квасова, Ю.Ю. Красноперова, А.С. Нестеров, И.Н. Исаева, О.Н. Кометова, В.М. Евдокимова // Материалы Всероссийской научной конференции «Проблема инфекции в клинической медицине» VIII съезда Итало-Российского общества по инфекционным болезням. - Санкт-Петербург, 2002. - С.23-31.

2. Бурганова, Р.Ф. Выделение клинических изолятов B. hominis у больных с различной патологией / Р.Ф. Бурганова, Н.А. Ильина, И.Н. Исаева, Ю.Ю. Краснопёрова, В.М. Евдокимова // Сб. тезисов докладов Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых учёных и студентов по медицине. - Тула, 2002. - С.43.

3. Бурганова, Р.Ф. Выявление простейших Blastocystis hominis у больных с заболеванием желудочно-кишечного тракта / Р.Ф. Бурганова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Т.И. Волгина, М.М. Хамитова, Н.А. Ильина, И.Н. Исаева, В.М. Евдокимова, Ю.Ю. Красноперова, О.А. Кометова // Материалы XXXVII научно-практической межрегиональной конференции врачей «Здравоохранение Ульяновской области в XX веке» 23-24 мая 2002 г. - Ульяновск, 2002. - С.105.

4. Бурганова, Р.Ф. Влияние простейших Blastocystis hominis на микробиоту толстой кишки мышей / Р.Ф.Бурганова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, Н.А. Квасова, И.Н. Исаева // Материалы 18-й Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и патология пищеварения» 4-6 сентября 2002 г. - Краснодар,2002. - С.203-204.

5. Бурганова Р.Ф. Протозойно-бактериальные ассоциации кишечника в условиях бластоцистной инвазии / Р.Ф.Бурганова, Н.А. Квасова, Ю.Ю. Красноперова, Н.В. Бугеро, О.Е. Фалова, И.С. Немова, А.С. Нестеров // Материалы 4-й Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в ХХI веке» 23-25 мая 2003 г. - Москва,2003. - С.508-509.

6. Бурганова, Р.Ф. Влияние простейших B. hominis на функциональную активность печени / Р.Ф. Бурганова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.А. Квасова, И.Н. Исаева // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2003. - №2. - С.16-18.

7. Бурганова, Р.Ф. Бластоцистная инвазия у гастроэнтерологических больных / Р.Ф. Бурганова, Н.А. Квасова, Ю.Ю. Красноперова, Н.В. Бугеро, О.Е. Фалова, В.Е. Струнаева, А.С. Нестеров // Медлайн-Экспресс. - 2003. - №12 (169). - С.3-5.

8. Бурганова, Р.Ф. Реализация потенциала патогенности простейших Blastocystis hominis в условиях пониженной резистентности макроорганизма / Р.Ф. Бурганова, Н.А. Квасова, Ю.Ю. Красноперова, А.С. Нестеров, Н.В. Бугеро, И.С. Немова, О.Е. Фалова, В.М. Кудрова, В.Е. Струнаева // Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы современного здравоохранения и экологии» 27 ноября 2003 г. - Ульяновск, 2003. - С.64-65.

9. Бурганова, Р.Ф. Экологическое ранжирование эндофлоры кишечника населения Ульяновской области / Р.Ф. Бурганова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.В. Бугеро, О.Е. Фалова, Ю.Ю. Красноперова, Н.А. Квасова, И.С. Немова // Успехи современного естествознания. - №3. -2004. - С.28-29.

10. Бурганова, Р.Ф. Бластоцистоз - протозооз человека / Р.Ф. Бурганова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.А. Квасова, И.Н. Исаева, Ю.Ю. Красноперова, Н.М. Чебан, Л.К. Богомолова // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2004. - №4. - С. 58-61.

11. Бурганова, Р.Ф. Влияние микробиоценоза кишечника на формирование и тяжесть течения экспериментальной язвы желудка ассоциированной с бластоцистозом / Р.Ф. Бурганова, Ю.Ю. Красноперова, Н.А. Квасова, Н.В. Бугеро, В.М. Кудрова, О.Е. Фалова, И.С. Немова // Материалы 5-го конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» 20-21 мая 2004 г. - Томск, 2004. - С.147-148.

12. Бурганова, Р.Ф. Некоторые показатели клеточного иммунитета при экспериментальной язве желудка на фоне инвазии простейших Blastocystis hominis / Р.Ф.Бурганова, Ю.Ю. Красноперова, Н.А. Квасова, Н.В. Бугеро, В.М. Евдокимова, О.Е. Фалова, И.С. Немова, А.С. Нестеров // Материалы 11-й межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и соискателей «Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации» 18 октября 2004 г. - Пенза, 2004. - С.112-113.

13. Бурганова, Р.Ф. Распространенность простейших Blastocystis hominis у гастроэнтерологических больных / Р.Ф. Бурганова, Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.А. Квасова, Н.В. Бугеро, О.Е. Фалова, И.С. Немова, А.С. Нестеров // Материалы выездного пленума НОГР «Новые горизонты гастроэнтерологии» 23-24 ноября 2004 г. - Новосибирск, 2004. - С.318-319.

14. Бурганова, Р.Ф. Активность нейтрофильных гранулоцитов при экспериментальной язве желудка на фоне Blastocystis hominis / Р.Ф. Бурганова, Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, Н.А. Квасова, О.Е. Фалова, Н.В. Бугеро, В.М. Евдокимова, А.С. Нестеров // Материалы выездного пленума НОГР «Новые горизонты гастроэнтерологии» 23-24 ноября 2004 г. - Новосибирск, 2004. - С. 63-64.

15. Бурганова, Р.Ф. Влияние микробиоценоза кишечника на формирование и тяжесть течения экспериментальной язвы желудка, ассоциированной с бластоцистозом / Р.Ф. Бурганова, Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, Н.А. Квасова, О.Е. Фалова, Н.В. Бугеро, В.М.Евдокимова, А.С.Нестеров // Материалы выездного пленума НОГР «Новые горизонты гастроэнтерологии» 23-24 ноября 2004 г. - Новосибирск, 2004. - С.65-66.

16. Бурганова, Р.Ф. Изучение энтеротоксигенной активности бластоцист / Р.Ф. Бурганова, Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, Н.А. Квасова, О.Е. Фалова, Н.В. Бугеро, В.М. Евдокимова // Материалы выездного пленума НОГР «Новые горизонты гастроэнтерологии» 23-24 ноября 2004 г. - Новосибирск, 2004. - С.148-149.

17. Бурганова, Р.Ф. Некоторые показатели микробиоценоза кишечника при бластоцистозной инвазии / Р.Ф. Бурганова, Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, Н.А. Квасова, О.Е. Фалова, Н.В. Бугеро, В.М. Евдокимова // Материалы выездного пленума НОГР «Новые горизонты гастроэнтерологии» 23-24 ноября 2004 г. - Новосибирск, 2004. - С.142-143.

18. Бурганова, Р.Ф. Патогенные свойства штаммов Blastocystis hominis / Р.Ф. Бурганова, Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, Н.А. Квасова, О.Е. Фалова, Н.В. Бугеро // Материалы выездного пленума НОГР «Новые горизонты гастроэнтерологии» 23-24 ноября 2004 г. - Новосибирск, 2004. - С.303-304.

19. Способ заражения экспериментальных животных бластоцистами: патент № 2224465 Рос. Федерация; заявка № 2002114890; опубл. 27.02.2004 , бюл. Т. 6.Ч.3. т - С. 598-599.

20. Бурганова, Р.Ф. Частота бластоцистозной инвазии у рабочих вредного производства / Р.Ф. Бурганова, Н.В. Бугеро, Ю.Ю. Красноперова, И.С. Немова, О.Е. Фалова, Т.И. Волгина, Н.С. Глебова // Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии - 2005» 27-28 января 2005 г. - Санкт-Петербург, 2005. - С.66.

21. Бурганова, Р.Ф. Бластоцистозная инвазия и дисбиоз кишечника / Р.Ф. Бурганова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, И.С. Немова, Н.А. Ильина, А.В. Курзин // Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии - 2006» 14-15 декабря 2006 г. - Санкт-Петербург, 2006. - С.36.

22. Бурганова, Р.Ф. Этиологическая роль бактерий рода Klebsiella / Р.Ф. Бурганова // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Высшее сестринское образование в системе Российского здравоохранения» 15-16 декабря 2010 г. - Ульяновск, 2010. - С. 92-93.

23. Бурганова, Р.Ф. Дисбактериоз кишечника в условиях колонизации бактериями рода Klebsiella / Р.Ф. Бурганова, Е.Г. Сабанова // Материалы 45-й межрегиональной научно-практической медицинской конференции «Повышение качества и доступности медицинской помощи - стратегическое направление развития здравоохранения» 20-21 мая 2010 г. - Ульяновск, 2010. - С.200.

Размещено на Allbest.ru