Влияние дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на клетки крови животных in vivo и in vitro

Автореферат диссертации разослан 14 января 2010 г. и размещен на сайте: www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение метаболитов микроорганизмов является актуальным направлением в прикладной микробиологии. Особый интерес представляют исследования токсинов бактерий, особенностей их патогенетического действия на организм человека и животных и возможности практического использования в производстве медико-биологических препаратов (Монастырский, 2003; Новожилов, 2003). Энтомопатогенные препараты на основе спорово-кристаллических комплексов Bacillus thuringiensis широко используются для защиты сельскохозяйственных растений (Харвуд, 1992). В настоящее время до 90-95% мирового рынка биоинсектицидов занимают препараты на основе Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52. Дельта-эндотоксин B. thuringiensis subsp. kurstaki .Z-52 проявляет активность в отношении насекомых благодаря способности связываться с чувствительными рецепторами на цитоплазматических мембранах клеток кишечного эпителия, а затем проникать в них, формируя каналы-поры (Hodgman & Ellar, 1990; Smith & Ellar, 1994). Также этот дельта-эндотоксин проявляет активность в отношении ряда микроорганизмов, в том числе и фитопатогенных (Егоров, Юдина, Баранов, 1990; Юдина, Милько, Егоров, 1996). Уникальная избирательность взаимодействия дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 с мембранами клеток насекомых дает возможность использовать его для защиты агроценозов и лесных массивов от листогрызущих насекомых-вредителей (Иванова, 2005).

В России в настоящее время используются препараты на основе Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 лепидоцид-50, дипел, битоксибациллин (для защиты деревьев, кустарников, овощей и лекарственных трав против бабочек), новодор, поражающий колорадского жука на посадках картофеля, томатов, баклажанов (Иванова, 2004). Разработаны так же новые препараты на основе очищенного от спор и других балластных веществ и предварительно активированного дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 (Каменек 1998; 2005).

В этой связи особую актуальность приобретает вопрос токсичности этих препаратов для разных видов животных.

Существуют данные о безвредности дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 для млекопитающих, основанные на изучении его прямой токсичности (Хеймпел, 1976; Киль и др., 2002). Однако в литературных источниках отсутствуют какие-либо научные подтверждения этого факта (Кандыбин, 1989). Известно, что в организме насекомого дельта-эндотоксин B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 разобщает процессы окислительного фосфорилирования и дыхания (Heimpel, 1977; Faust, 1984; Aronson et al., 1986; Gill et al., 1992; Himeno et al., 1985; Каменек, 1998). Попадая в организм животного, дельта-эндотоксин может всасываться в кишечнике и взаимодействовать с элементами крови. При длительном воздействии токсических веществ в концентрациях, не вызывающих внешне обнаруживаемого эффекта, могут выявляться скрытые изменения ряда биохимических показателей системы крови, которая является чувствительным индикатором, отражающим состояние организма в целом.

Для оценки действия дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на организм теплокровных животных необходимо исследовать изменение биохимических процессов, в частности активности ферментов аспартатамино-трансферазы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), активности миелопероксидазы и лизосомально-катионных белков нейтрофилов, что может служить показателем развития и интенсивности воспалительных процессов (Голиков 1986; Релева, 2007).

Таким образом, актуальной на настоящий момент является оценка действия дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на состояние организма животного, что дает возможность охарактеризовать безопасность применения препаратов на его основе.

Цель настоящего исследования - изучить влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на клетки крови лабораторных мышей в условиях in vivo и in vitro.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vitro на активность кислородзависимых и кислороднезависимых бактерицидных систем нейтрофилов лабораторных животных.

2. Изучить влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vitro на содержание и жизнеспособность эритроцитов периферической крови мышей.

3. Установить влияние дельта-эндотоксина B thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на количественный состав форменных элементов крови (лейкоцитов, эозинофилов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов) и значение лейкоцитарного индекса интоксикации лабораторных мышей.

4. Оценить действие дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на активность ферментов в сыворотке крови лабораторных мышей в условиях in vivo.

5. Изучить влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на активность процессов перекисного окисления липидов и ферментативного звена антиоксидантной защиты (каталазы) в крови лабораторных мышей in vivo.

Научная новизна. Впервые проведена оценка воздействия различных доз дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на механизмы киллинга в нейтрофилах лабораторных мышей, процентное содержание форменных элементов крови, жизнеспособность эритроцитов, активность ферментов в сыворотке крови, соотношение антиоксидантной системы.

Впервые установлена способность дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в очень высоких дозах (1000; 500; 250 мг на кг массы животного) in vivo угнетать активность ферментов лизосом (миелопероксидазы, лизосомальных катионных белков), характеризующих кислородзависимые и кислороднезависимые бактерицидные процессы в нейтрофилах; в дозе 50 мг на кг массы животного - стимулировать активность миелопероксидазы, лизосомально-катионных белков, а также рост моноцитов и лимфоцитов. Дельта-эндотоксин B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в дозе 25 мг/кг вызывал активность механизма киллинга периферической крови животных, форменных элементов крови in vivo.

Впервые показано отсутствие влияния сравнительно низких доз дельта-эндотоксина на активность ферментов ЛДГ, АсАТ, АлАТ и антиоксидантную систему сыворотки крови экспериментальных животных.

Практическая значимость работы. Полученные данные вносят вклад в понимание механизма патогенетического действия дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на организм животного. Результаты работы позволяют дать рекомендации по обеспечению безопасности при производстве биоинсектицидов, содержащих дельта-эндотоксин B. thuringiensis subsp. Kurstaki Z-52. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии, биотехнологии, биохимии, проведении лабораторно-практических занятий и написании курсовых и дипломных работ в Ульяновском государственном университете.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Дельта-эндотоксин B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 не влияет в условиях in vitro на активность миелопероксидазы, катионных белков, фагоцитарной активности нейтрофилов и на содержание жизнеспособных эритроцитов.

2. Дельта-эндотоксин B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vivo в очень высоких дозах 1000; 500; 250 мг/кг массы животного вызывает угнетение активности миелопероксидазы и катионных белков лизосом до 81% и 75% соответственно.

3. Дельта-эндотоксин B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в дозах 25 - 100 мг/кг не влияет на содержание эозинофилов, моноцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, активность каталазы и уровень вторичного продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида в крови лабораторных мышей.

4. Пероральное введение дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 дозе 100 мг/кг вызывает снижение в крови лабораторных животных числа лимфоцитов на 31%. Действие дельта-эндотоксина в дозах 25 и 50 мг/кг увеличивает число этих форменных элементов и не вызывает изменений показателей лейкоцитарного индекса интоксикации.

5. Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 после шестикратного перорального введения испытуемых доз до 100 мг/кг не влияет на активность ферментов ЛДГ, АсАТ и АлАТ в сыворотке крови лабораторных животных.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: 11-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии и охраны природы. Пути их решения» (Ульяновск, 2007); научном семинаре «Геоэкологические проблемы Среднего Поволжья» (Ульяновск, 2008); научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008); межкафедральных семинарах экологического факультета Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета (2007-2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включающей объект и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 112 страницах, содержит 3 таблицы и 17 рисунков. Список использованных литературных источников включает 144 наименования, в том числе 44 зарубежных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

эндотоксин bacillus кровь животное

Материалы и методы исследований

В работе был использован штамм Z-52 B. thuringiensis subsp. kurstaki, продуцирующий кристаллы дельта-эндотоксина класса Cry IА, полученный из коллекции культур микроорганизмов Всероссийского института защиты растений (ВИЗР) г. Пушкин Ленинградской области.

B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 выращивали на питательной среде № 14 при температуре 27єС (Каменек, 1998). Проводили контроль морфологии колоний по общепринятым методикам и морфологии клеток в мазках, окрашенных по Граму и по Пешкову (Колычев, Госманов, 2006). При спорообразовании в пределах 80-90% (3-4 сутки культивирования) культуру использовали для выделения дельта-эндотоксина. Для отделения кристаллов от спор и других токсинов был применён модифицированный нами метод Л.К. Каменёк (1989). В работе использовали выделенные и очищенные от спор кристаллы дельта-эндотоксина, предварительно активированные по методике Кукси (с помощью щелочного гидролиза). Кристаллы дельта-эндотоксина разводили в 0,9% растворе NaСl и использовали в исследованиях in vitro в дозах 0.5, 1, 2 мг/мл. При оценке действия дельта-эндотоксина in vivo кристаллы в различных дозах вводили животным перорально с пищей.

В экспериментах использовали 360 белых беспородных мышей - самок со средним весом 30±2 граммов, разделенных на четыре группы (три опытные и одна контрольная). Опытные животные в течение 42 суток один раз в неделю получали небольшие дозы дельта-эндотоксина (25, 50 и 100 мг/кг) или же эти же дозы - шестикратно, а так же в течение 54 суток два раза в неделю животные получали дозы 250, 500 и 1000 мг/кг, Дельта-эндотоксин смешивали с пищей (сыр), в дозах: 1000, 500, 250, 100, 50, 25 мг на кг массы животного, что составило 0,03, 0,015, 0,0075 0,003, 0,0015, 0,00075 мг на особь, соответственно.

Забор крови для исследования проводили еженедельно, процедуру взятия крови проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных МЗ РФ. Сыворотку крови получали методом отстаивания цельной крови и ретракции кровяного сгустка с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин (Меньшиков, 1987). Количество различных форм лейкоцитов в крови устанавливали методом окрашивания мазков крови по Романовскому-Гимзе с последующей световой микроскопией и подсчетом.

В опытах in vivo и in vitro для выявления активности катионных белков лизосом (ЛБК) нейтрофильных гранулоцитов использовали цитохимический метод М. Г. Шубича (Брюховецкий, 1985). Рассчитывали средний цитохимический коэффициент (СЦК) с использованием полуколичественного метода оценки по принципу Астальди-Верга, основанному на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски (Astaldi, Verga, 1957). Подсчет количества жизнеспособных эритроцитов (КЖЭ) осуществляли на гемоанализаторе марки Coulter ACT diff фирмы COULTER BECKMAN.

Определение активности ферментов ЛДГ, АсАТ и АлАТ в сыворотке крови лабораторных животных проводили по стандартным методикам (Меньшиков, 1987; Славинский, 2000). Активность ферментов измеряли в нмоль/(с·л), выражали ее в %, принимая контроль за 100%, чтобы исключить изменения, связанные с внешними воздействиями на организм животного.

Экспериментальные данные обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики. Достоверность полученных результатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента (Ашмарин, Васильев, Амбросов, 1974; Лакин, 1980). Расчёт результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ MS Еxcel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52

Для выделения дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 необходимо было предварительно получить споровую культуру и провести разделение кристаллов и спор. Культивирование B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 осуществляли в чашках Петри на агаризованной питательной среде №14 следующего состава (в %): кукурузный экстракт - 0,7, глюкоза - 1, пептон - 0,5, NaСl - 0,2, MgSO4 - 0,01, Na2HPO4 - 0,3, K2HPO4 - 0,3, агар-агар - 15-20; рН среды 7,2-7,5. Культуру высевали на полупроницаемую целлофановую пленку, помещенную на поверхности питательной среды. Инкубировали при температуре 27є C в течение 3х суток. Контроль морфологии колоний проводили по общепринятым методикам, учитывая форму, размер, характер края колоний, консистенцию и прозрачность.

Морфология клеток B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 была типичной для вида - в мазках, окрашенных по способу Грама, наблюдали крупные палочки с прямыми концами, расположенные цепочками. Процесс спорообразования контролировали путем окрашивания сделанных в интервале времени наблюдения мазков с окраской по Пешкову.

Численность клеток подсчитывали в камере Горяева или на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 400 и 500 нм (Штерншис, 1976).

При изучении действия дельта-эндотоксина на клетки необходимо отделить кристаллы от спор и других токсинов. Для этого был применен модифицированный метод (Каменек, 1980), основанный на комбинации флотации спор (Gingrich, 1968) и дальнейшего разделения спор и кристаллов в двухфазной системе: водный раствор Na2SO4 - четыреххлористый углерод (Pendleton and Morrison, 1966). Суть его заключалась в следующем: 3-х суточную культуру B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 суспендировали в бидистиллированной воде из расчета (3,5-4).10 6 спор и кристаллов в 1 мл воды. Суспензию центрифугировали при 500g в течение 7 мин., при этом растворимые токсины переходили в надосадочную фазу, которая удалялась. Осадок ресуспендировали и центрифугировали в течение 7 мин при 500g для удаления кусочков питательной среды и других возможных примесей. Полученный супернатант очень сильно взбалтывали в отдельном сосуде с притертой пробкой в течение 10 секунд, затем через 1-2 мин отстаивания снимали лопаточкой образовавшуюся пену, содержащую споры. Эту процедуру повторяли до почти полного прекращения пенообразования, что позволяло удалить около 60 % спор. Далее к очищаемой суспензии прибавляли равный объем четыреххлористого углерода и 1%-ного сульфата натрия из расчета 7 мл на каждые 10 мл суспензии. Смесь интенсивно перемешивали на магнитной мешалке до образования устойчивой суспензии и оставляли расслаиваться. После расслаивания отбирали водную фазу, содержащую кристаллы. Процедуру повторяли дважды. Конечная суспензия содержала менее 1% спор. К этой полученной суспензии добавляли равный объем хлороформа, интенсивно перемешивали до образования устойчивой эмульсии и оставляли до полного расслаивания. Верхняя - мутная (водная) фаза содержала кристаллы и, как показало микроскопическое исследование, была свободна от спор. Концентрацию кристаллов в водной фазе определяли спектрофотометрически (Штерншис, 1976) в кварцевых кюветах толщиной в 1см при длине волны 500 нм. В кювету сравнения помещали дистиллированную воду. Выход кристаллов от исходного количества составлял около 20%. Выделенные в водной фазе кристаллы хранили в замороженном состоянии при температуре - 10є С.

Преимущество описанной методики состоит в том, что она не требует дорогостоящих экстрагентов и оборудования, легко воспроизводится, позволяет получать препараты с высокой степенью очистки.

В исследованиях необходимо было использовать растворенные кристаллы, так как известно, что кристалл-протоксин становится токсином только при растворении либо в щелочи, либо в кишечном содержимом насекомого. Поэтому предварительно осуществляли щелочной гидролиз полученных кристаллов по методике Кукси (Соосsey, 1968), которая заключалась в следующем: 6 мг кристаллов растворяли в 3 мл 0, 04 н NaOH в течение 60 мин при 30є С. После этого растворившийся материал осаждали центрифугированием при 5000g в течение 20 мин. К надосадочной фазе по каплям добавляли при перемешивании уксусную кислоту до рН 4,4. Смесь оставляли на 30 мин при 0єС для окончательного формирования осадка, который удаляли центрифугированием в течение 15 мин при 10000 g. Осадок несколько раз промывали водой и подвергали лиофильной сушке. Активированные кристаллы использовали в экспериментах в виде порошка.

Влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vitro на кислородзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы нейтрофилов

Для оценки кислородзависимой бактерицидной системы нейтрофилов крови лабораторных мышей в условиях in vitro определяли активность миелопероксидазы. Значения СЦК в контрольных нейтрофилах составили 2,1±0,26 у.е. Опытные нейтрофилы инкубировали с дельта-эндотоксином B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в дозах 0,5, 1 и 2 мг/мл.

Установлено, что через 5 минут инкубации значения СЦК были 2,090,05, 2,26±0,1 и 2,26±0,09 у.е. соответственно, что практически не отличалось от контроля (рис. 1).

Через 10 и 15 минут инкубации нейтрофилов с токсином в указанных дозах изменений также отмечено не было: СЦК через 10 минут составил 2,20,04, 2,240,08 и 2,250,03 у.е.; через 15 минут - 2,23±0,07, 2,05±0,09 и 2,26±0,1 у.е. соответственно. Полученные данные указывают на отсутствие влияния дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vitro на активность миелопероксидазы.

Рис. 1. Активность миелопероксидазы под действием дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52

Рис. 2. Активность ЛКБ нейтрофилов под действием дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52

Для оценки кислороднезависимой бактерицидной системы нейтрофилов крови лабораторных мышей в условиях in vitro определяли активность катионных белков лизосом. Изучение активности ЛКБ в контрольном варианте показало, что значения СЦК составили 1,21±0,03 у.е. Через 5, 10 и 15 минут инкубации нейтрофилов с дельта-эндотоксином в дозах 0,5, 1 и 2 мг/мл значения СЦК достоверно не отличались от контроля (рис. 2).

Рис. 3. Влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на фагоцитарную активность нейтрофилов крови мышей

Результаты изучения фагоцитарной активности нейтрофилов (спонтанный НСТ-тест) после 5, 10 и 15 минутной инкубации с дельта-эндотоксином в дозе 0,5 мг/мл показали, что показатели СЦК не превысили контрольных значений и составили 2,8±0,06, 2,92±0,02 и 3±0,15 у.е. соответственно. Через 5, 10 и 15 минут инкубирования нейтрофилов с токсином в дозе 1 мг/мл фагоцитарная активность также не изменилась относительно контроля и составила 3,1±0,25, 3,2±0,36 и 3,2±0,9 соответственно (рис. 3).

Не было отмечено изменений активности и при действии токсина в дозе 2 мг/мл. Полученные данные указывают на отсутствие действия на фагоцитарную активность нейтрофилов разных доз дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 и времени инкубирования.

Рис. 4. Влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на жизнеспособность эритроцитов мышей

Количественный анализ эритроцитов через 5, 10, 15, 30 и 60 минут инкубации с токсином в дозах 0,5, 1 и 2 мг/мл показал, что КЖЭ практически совпадает с контролем и варьирует от 2,4±0,16 до 2,81±0,21*1012, что находится в пределах погрешности опыта (рис. 4).

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают, что дельта-эндотоксин B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в опытах in vitro не оказывает влияния на количество жизнеспособных эритроцитов, активность миелопероксидазы, лизосомальных катионных белков и фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови мышей.

Действие in vivo дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на лимфоциты крови лабораторных мышей

Изменение содержания лимфоцитов в крови лабораторных мышей после перорального введения 25 и 50 мг/кг дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 практически совпадало с контрольными значениями в течение всего эксперимента. Снижение числа лимфоцитов на 2-3 неделю экспериментов может быть объяснено их участием в формировании адаптивного иммунного ответа на чужеродный антиген (Ciprandi, 1986).

Рис. 5. Влияние дельта-эндотоксина на содержание лимфоцитов крови мышей

При действии дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в большей дозе (100 мг/кг) было отмечено снижение количества лимфоцитов на 31%. Это позволяет сделать вывод о некотором угнетении клеточного иммунитета у теплокровных животных при воздействии бактериальных токсинов (рис. 5).

Действие in vivo дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на субпопуляционный состав нейтрофилов крови лабораторных мышей

Исследование динамики процентного содержания моноцитов крови не выявило достоверных отличий у животных всех групп, получавших эндотоксин, по сравнению с контрольной группой (рис. 6). Поскольку моноциты так же, как и нейтрофилы, участвуют в реализации неспецифических механизмов резистенции организма, то полученные нами результаты свидетельствует об отсутствии негативного воздействия дельта-эндотоксина на резистентность организма мышей.

Рис. 6. Влияние дельта-эндотоксина на содержание моноцитов крови мышей

Рис. 7. Влияние дельта-эндотоксина содержание палочкоядерных нейтрофилов крови

При анализе процентного содержания палочкоядерных нейтрофилов не выявлено достоверных различий между значениями у животных экспериментальных и контрольной групп на всем протяжении исследования (рис. 7).

При изучении действия дельта-эндотоксина на содержание сегментоядерных нейтрофилов было выявлено, что у животных в группах с пероральным введением токсина в дозах 25 и 50 мг/кг на 3 сутки эксперимента происходило повышение количества этих клеток в крови до 48 и 54%, соответственно, по сравнению с 45% в контроле, т.е. повышалось на 6 и 20% (рис. 8).

Рис. 8. Влияние дельта-дотоксина на содержание сегментоядерных нейтрофилов крови

Рис. 9. Влияние дельта-эндотоксина на процентное содержание эозинофилов периферической крови

При исследовании количества эозинофилов в крови мышей не установлено достоверных отличий от контрольных показателей во всех группах, независимо от дозы токсина (рис. 9). Так как эозинофильные сдвиги встречаются при включении аллергического компонента в иммуногенез, можно сделать заключение о том, что изучаемый токсин не вызывает аллергической реакции.

Рис. 10. Влияние дельта-эндотоксина на лейкоцитарный индекс интоксикации периферической крови мышей

Изучение картины крови животных экспериментальных групп выявило значительное повышение показателя лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ) уже в первые сутки эксперимента по сравнению с показателями крови животных контрольной группы за счет увеличения общего числа нейтрофильных гранулоцитов и резкого снижения лимфоцитов, особенно выраженного при действии дельта-эндотоксина в наибольшей дозе 100 мг/кг - на 47% (0,69±0,27).

Установлено, что показатели ЛИИ тем выше, чем больше доза вводимого токсина (рис. 10).

При действии in vivo токсина в дозах 25 и 50 мг/кг было отмечено нарастание значений ЛИИ периферической крови мышей, которые достигли к 21-м суткам максимального значения 0,35±0,10 и 0,31±0,02 у.е. соответственно. Анализ показал, что это повышение было связано с увеличением числа сегментоядерных нейтрофилов. К 28 суткам эксперимента значения ЛИИ в крови животных опытных групп снизились до контрольных цифр и в последующем не отличались от них. При введении дельта-эндотоксина в дозе 100 мг/кг значения ЛИИ в крови мышей, оставаясь на достаточно высоком уровне в течение всего периода наблюдения, претерпевали изменения и в среднем превышали контрольные показатели в 2,5 раза.

Влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vivo на кислородзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы нейтрофилов крови лабораторных мышей

Полученные данные свидетельствуют о том, что на 3 сутки после введения экспериментальным животным дельта-эндотоксина в дозах 25 и 50 мг/кг происходит резкий подъем активности миелопероксидазы, что свидетельствует об активации антимикробной системы нейтрофилов мышей.

На 7 сутки после перорального введения дельта-эндотоксина в дозе 100 мг/кг происходило снижение активности миелопероксидазы по сравнению с контролем на 46%.

Угнетение активности миелопероксидазы в нейтрофилах мышей продолжалось на протяжении всего эксперимента и к 42 суткам достигло 85% относительно контроля. Это, возможно, связано с возрастанием дефицита кислорода в клетках крови и, как следствие, угнетением активности этого фермента, обеспечивающего кислородзависимый бактерицидный эффект (Логвиненко, 2008).

В ходе исследования не установлено изменения активности ЛКБ нейтрофилов крови по сравнению с контролем при введении мышам дельта-эндотоксина в дозе 25 мг/кг; при действии токсина в дозе 50 мг/кг показатели активности ЛКБ были выше контрольных в среднем на 26%.

Отмечено постепенное снижение активности ЛКБ в нейтрофилах мышей, которым вводили токсин в дозе 100 мг/кг, к 14 суткам разница с контрольными показателями составила 54%. К 42 суткам показатели активности ЛКБ снизились до 0,04±0,03, что отличалось от контроля на 85 %.

Так как активность ЛКБ в нейтрофилах отражает выраженность кислороднезависимых защитных механизмов, то можно сделать вывод о том, что в дозе 100 мг/кг дельта-эндотоксин вызывает снижение адаптационной способности организма животных.

При введении мышам больших доз дельта-эндотоксина (500 и 1000 мг/кг) же через сутки происходило снижение активности миелопероксидазы в нейтрофилах крови; на 14 сутки значения СЦК снижались на 50 и 70% по сравнению с контролем (до 0,22±0,02 и 0,18±0,03 у.е. соответственно); к 28 суткам это снижение составило 81% (рис.11).

Рис.11. Оценка активности миелопероксидазы в нейтрофилах крови мышей после воздействия in vivo высоких доз дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52

Полученные результаты можно объяснить, по-видимому, неспецифической реакцией нейтрофилов на чужеродный белок

В ходе исследования было установлено также, что дельта-эндотоксин через сутки после его перорального введения мышам во всех изученных дозах снижает активность лизосомально-катионных белков нейтрофилов, что выражалось в их угнетении (рис. 12). При действии токсина в дозах 500 и 1000 мг/кг активность ЛКБ максимально снижалась относительно контрольных значений до 75 и 74% соответственно (СЦК 0,25±0,07 и 0,24±0,03 у.е.), а в дозе 250 мг/кг - минимальное значение отмечено через 14 суток (СЦК 0,30±0,04 у.е., снижение на 70%).

Угнетающее действие дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vivo в высоких дозах связано, вероятно, с неспецифической реакцией организма на чужеродный белок, способный проникать в кровоток.

Рис. 12. Влияние длительного воздействия дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на активность катионных белков лизосом нейтрофилов крови мышей

Влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на активность трансаминаз и лактатдегидрогеназы в сыворотке крови лабораторных мышей

При определении влияния дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vivo не было выявлено статистически значимых изменений на протяжении всего эксперимента в активности ферментов АлАТ , АсАТ (табл. 1) и ЛДГ (табл. 2) в сыворотке крови при введении мышам всех исследуемых доз.

Отсутствие выраженного влияния на активность ферментов позволяет предположить, что дельта-эндотоксин in vivo не вызывает разрушения клеток и целостности органов и тканей организма животных в целом.

Таблица 1 - Влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на активность АсАТ и АлАТ в крови лабораторных мышей

Таблица 2 - Влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на активность ЛДГ в крови лабораторных мышей

Влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на показатели системы ПОЛ-антиоксидант в сыворотке крови мышей

В ходе проведенных исследований установлено, что воздействие in vivo дельта-эндотоксина в дозах 25, 50 и 100 мг/кг не приводит к статистически значимому изменению уровня МДА и каталазы в сыворотке крови мышей на протяжении всего эксперимента.

Таким образом, проведенные исследования позволили доказать, что дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52, в отличие от традиционных токсинов бактерий, не оказывает воздействия на активность бактерицидных систем нейтрофилов, количество форменных элементов, активность ферментов крови и антиоксидантные системы организма экспериментальных животных.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vitro не оказывает статистически значимого влияния на активность катионных белков, миелопероксидазы, фагоцитарную активность нейтрофилов, на содержание жизнеспособных эритроцитов.

2. Установлено, что дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vivo в больших дозах (500-1000 мг/кг) вызывает снижение активности миелопероксидазы и катионных белков лизосом до 81 и 75% соответственно.

3. Отмечено, что дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в дозах 25 и 50 мг/кг не оказывает влияния на количественный состав эозинофилов, моноцитов, лейкоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов крови лабораторных мышей. Отмечено увеличение сегментоядерных нейтрофилов на 20% при пероральном введении дельта-эндотоксина в дозе 100 мг/кг.

4. Выявлено, что при введении лабораторным мышам всех исследованных доз дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 не отмечено изменений активности ферментов ЛДГ, АсАТ и АлАТ в сыворотке крови животных, что подтверждает отсутствие разрушения клеток под его действии.

5. Показано, что дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vivo во всех изученных дозах не оказывает влияние на уровень вторичного продукта ПОЛ - МДА и активность антиоксидантного фермента - каталазы в крови лабораторных мышей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Феклина, М.С. Изменение активности лактатдегидрогеназы, аланинаминотрасферазы, аспартатаминотрасферазы сыворотки крови мышей под действием дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis /М.С. Феклина, Л.К. Каменек, Д.В. Каменек, Э.К. Юнусова / Вестник новых медицинских технологий. 2009. № 3.-С. 214-215.

2. Феклина, М.С. Влияние дельта эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto на процесс гликолиза в перевиваемых линиях клеток /М.С. Феклина, Л.К. Каменек, Д.В. Каменек. - М., 2008. 16с. Деп. в ВИНИТИ 12.05.08, № 406-В2008.

3. Феклина, М.С. Действие дельта-эндотоксина на активность клеток периферической крови in vivo и in vitro /Д.В. Каменек, М.С. Феклина, Э.К. Юнусова. - М., 2008. 17с. Деп. в ВИНИТИ 12.05.08, № 407-В2008.

4. Феклина, М.С. Влияние дельта-эндотоксина на клетки периферической крови мышей in vivo /М.С. Феклина, Д.В. Каменек, Л.Д. Терехина //Ломоносов: материалы XIV междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. - М., 2007.-С. 77.

5. Феклина, М.С. Оценка влияния дельта-эндотоксина Bacillus thuringien sis на нейтрофилы крови мышей in vivo и in vitro /М.С. Феклина, Д.В. Каменек, С.В.Куркин, Л.Д. Терехина, Д.А. Терехин //Медико-физиологические проблемы экологии человека: всерос. конф. с междунар. участием. - Ульяновск, 2007.-С. 23-24.

6. Феклина, М.С. Влияние дельта-эндотоксина на клетки периферической крови мышей in vivo и in vitro /М.С. Феклина, Д.В. Каменек, С. В. Куркин, Л.Д. Терехина, Д.А. Терехин //Биология - наука XXI века: 11-я междунар. Пущинская школа-конф. молодых ученых. - Пущино, 2007.-С. 116.

7. Феклина, М.С. Оценка безопасности действия дельта-эндотоксина на клетки периферической крови мышей in vivo и in vitro /М.С. Феклина, Л.К. Каменек, О.В. Столбовская, Д.В. Каменек, С.В.Куркин, Л.Д. Терехина //Проблемы экологии и охраны природы, пути их решения: материалы IV Всерос. науч.-практич. конф. - М., 2007.-С. 103-104.

8. Феклина, М.С. Влияние дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на нейтрофилы периферической крови мышей in vivo /М.С. Феклина, Д.В. Каменек, Л.Д. Терехина //Ломоносов: материалы XV междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. - М., 2008.-С. 24.

9. Феклина, М.С. Характер изменения активности клеток под действием дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis /М.С. Феклина, Д.В. Каменек, В.В. Ногичева, Э.К. Юнусова, Л.К. Каменек //Геоэкологические проблемы Среднего Поволжья: сб. науч. тр. регион. науч. семинара. - Ульяновск, 2008.-С. 172-173.

10. Феклина, М.С. Особенности воздействия дельта-эндотоксина на клетки крови in vivo и in vitro /М.С. Феклина, Д.В. Каменек, Э.К. Юнусова, Л.К. Каменек //Геоэкологические проблемы Среднего Поволжья: сб. науч. тр. регион. науч. семинара. - Ульяновск, 2008.-С. 170-172.

11. Феклина, М.С. Изменение активности клеток крови под действием дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis /М.С. Феклина, В.В. Ногичева, Э.К. Юнусова, Л.Ю.Савельева, Л.К. Каменек //Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии: материалы науч.-практ. конф. - Казань, 2008.-С. 139-140.

Размещено на Allbest.ru