Создание биопрепарата на основе выделенных и изученных бактериофагов Enterococcus faecalis

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

СОЗДАНИЕ БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ВЫДЕЛЕННЫХ И ИЗУЧЕННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ ENTEROCOCCUS FAECALIS

03.00.23 - биотехнология

03.00.06 - вирусология

Ковалева Елена Николаевна

Саратов - 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Золотухин Сергей Николаевич

доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент Гулий Ольга Ивановна

доктор биологических наук, профессор Обухов Игорь Леонидович

Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Оренбургский государственный аграрный университет»

Защита диссертации состоится «25» декабря 2009 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова».

Автореферат диссертации разослан «19» ноября 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Энтерококки входят в состав нормальной микрофлоры ротовой полости, кишечника и мочеполовой системы животных и человека, поэтому их обнаружение в объектах внешней среды свидетельствует о биологической контаминации изучаемого объекта (Еремина, Седов, 1994; Anderson, Turner, Lewis, 1997; Бухарин, 2002).

Кроме того, среди этих микроорганизмов встречаются патогенные варианты, способные вызывать поражения мочеполовой системы, бактериальные эндокардиты и бактериемии у людей. Гемолизирующие энтерококки также способны вызывать пищевые отравления и дисбактериозы кишечника (Cassell, 1997; Смирнов, 2000; Kurup, Tee, Loo, Lin, 2001; Макушенко, 2002; Тюрин, 2004).

У животных энтерококки вызывают гастроэнтериты, пневмонии, маститы, эндокардиты, менингиты, септоцемию и другие заболевания (Панин, 1991; Субботин, 2001; Колычев, Петрова, Лазарева, 2006; Иващук, 2006).

Энтерококки в настоящее время являются одними из самых часто встречающихся возбудителей нозокомиальных инфекций. Тем не менее, наибольшую опасность вызывает не столько широкая распространенность этих микроорганизмов, сколько их устойчивость к большому спектру антибактериальных препаратов (Bell, Paton, Turnidge, 1998; Сидоренко, 2003; Hershberger et al., 2005; Kolar et al., 2005). Поскольку из патологического материала чаще всего выделяют E.faecalis, то в большинстве случаев приходиться идентифицировать именно этот вид.

Все вышесказанное обуславливает актуальность своевременной индикации и идентификации изучаемых микроорганизмов. При использовании бактериологических методов идентификация занимает длительное время. Хотя современные методы лабораторной диагностики (Braak et al., 2001; Drews et al., 2006) и являются высокоспецифичными и чувствительными, сложность методик, требования к квалификации персонала, высокая стоимость оборудования и реактивов делает их недоступными для многих бактериологических лабораторий на данный момент.

Таким образом возникает необходимость изыскания специфичных и менее трудоемких методов исследования. Благодаря специфичности действия бактериофаги используются для определения видовой принадлежности микроорганизмов, индикации бактерий в объектах внешней среды, диагностики инфекционных заболеваний.

Цель исследования. Разработка технологии изготовления и применения биопрепарата энтерококковых бактериофагов для идентификации и индикации бактерий вида Enterococcus faecalis в объектах внешней среды.

Задачи исследования

1. Выделить бактериофаги, активные в отношении бактерий вида E.faecalis.

2. Изучить основные биологические свойства выделенных изолятов бактериофагов: морфологию негативных колоний, морфологию фаговых корпускул, литическую активность, диапазон литической активности, специфичность действия, температурную устойчивость, чувствительность к воздействию хлороформа.

3. Отобрать штаммы фагов с заданными биологическим свойствами - высокой литической активностью (титр), широким диапазоном литического действия, выраженной видовой специфичностью, более высоким, чем у бактерий порогом инактивации - для конструирования биопрепарата.

4. Разработать оптимальные параметры идентификации энтерококков с помощью выделенных бактериофагов.

5. Разработать параметры ускоренной индикации бактерий вида E.faecalis в объектах внешней среды с помощью реакции нарастания титра фага. Разработать технологические параметры изготовления и контроля биопрепарата энтерококковых бактериофагов.

Научная новизна

- Впервые выделены бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий вида E.faecalis, патогенных для животных.

- Изучены основные биологические свойства новых изолятов фагов.

- Разработаны параметры идентификации и индикации бактерий вида E.faecalis в объектах внешней среды с помощью бактериофагов.

- Впервые определена технология изготовления биопрепарата бактериофагов бактерий вида E.faecalis.

- Доказана эффективность использования биопрепарата для индикации и идентификации бактерий вида E.faecalis в условиях производства.

Практическая значимость

Выделенные бактериофаги депонированы во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (№ 801/15 и № 802/15 от 24 апреля 2009 года), признаны перспективными и рекомендованы для изготовления диагностических и лечебно-профилактических препаратов.

Разработана «Инструкция по изготовлению и контролю серии бактериофагов E.faecalis EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА», предложены «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида E.faecalis из патологического материала, пищевых продуктов, кормов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов EF - 4 УГСХА, EF - 5 УГСХА» и «Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага бактерий вида E.faecalis в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды», одобренные Научно-техническим советом Ульяновской ГСХА и утвержденные ректором академии (16 июня 2009 года).

Материалы диссертационных исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по биотехнологии, вирусологии, микробиологии для студентов факультета ветеринарной медицины Ульяновской ГСХА, а также при выполнении тем научно-исследовательских работ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная схема выделения энтерококковых бактериофагов позволяет обнаружить и изолировать фаги E.faecalis из объектов внешней среды.

2. Изученные биологические свойства бактериофагов E.faecalis дают возможность применять отобранные изоляты с диагностической целью.

3. Разработанная схема фагоидентификации бактерий вида E.faecalis с применением бактериофагов EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА ускоряет определение видовой принадлежности энтерококков.

4. Разработанные технологические параметры РНФ с использованием фагов EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА значительно сокращают сроки обнаружения гомологичных бактерий в исследуемых объектах.

5. Разработанные технологические параметры изготовления бактериофагов позволили получить фаговый биопрепарат с высокой литической активностью, широким диапазоном действия, строгой видовой специфичностью.

Апробация работы. Материалы работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Аграрная наука и образование в реализации национального проекта «Развитие АПК» (Ульяновск, 2006); Международных научно-практических конференциях: «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2006), «Роль молодых ученых в реализации национального проекта «Развитие АПК» (Москва, 2007), «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008), «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); Международном конгрессе МАКМАХ / ESCMID по антимикробной терапии (Москва, 2009); Молодежном инновационном форуме Приволжского федерального округа (Ульяновск, 2009); Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, 2009).

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов ЕF - 4 УГСХА, ЕF - 5 УГСХА и индикации бактерий вида E.faecalis в объектах внешней среды методом РНФ подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА (14 - 16 апреля 2009 года), во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (22 - 25 апреля 2009 года); актами производственных испытаний на базе бактериологического отдела ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория» (18 - 22 мая 2009 года).

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГУ ВПО «Ульяновская ГСХА».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и список использованных литературных источников (145 всего, в том числе 65 зарубежных авторов). Работа изложена на 154 страницах текста, иллюстрирована 37 таблицами, 16 рисунками и дополнена приложениями.

биопрепарат энтерококковый бактериофаг изолят

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы. Питательные среды и реактивы: мясопептонный бульон, мясопептонный агар (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), лактозопептонная среда, молочно-ингибиторная среда, питательная среда для выделения энтерококков сухая (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой, маннитом (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), биохимические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург); натрий хлорид, желчь дегидратированная, перекись водорода, трихлорметан.

Лабораторная посуда и оборудование: термостат ТС-80М-2, автоклав ГК-100-3, шкаф сушильно-стерилизационный ШСС-80п УХЛ 42, холодильник бытовой, дистиллятор, лабораторные центрифуги ОПн-8УХЛ 4,2, ЦЛС-3, СМ-6М с угловыми и баккет-роторами, ультрацентрифуга Th - 100 (Beckman), набор для фильтрации фагов (Millipore - Millivac), водяная баня, термометр ртутный, микроскоп «Биомед-6» с видеофотонасадкой, электронный микроскоп HU - 12 A, мерные цилиндры, флаконы, чашки Петри, пробирки, пипетки мерные, колбы, штативы, спиртовки, стекла предметные, стекла покровные. Штаммы бактерий:

- 5 референс-штаммов бактерий вида E.faecalis Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (№ 189, № 13, № 345, «Константиновский», «Соколово»), используемых для изготовления вакцин против энтерококкозов сельскохозяйственных животных;

- 40 штаммов бактерий рода Enterococcus (33 - E.faecalis, 7 - E.facium), выделенные нами из патологического материала павших животных, фекалий больных животных, объектов внешней среды;

- 169 штаммов бактерий рода Enterococcus (82 - E.faecalis, 76 - E.facium, 3 - E.raffinosus, 3 - E.casseliflavus, 2 - E.durans, 1 - E.avium, 1 - E.gallinarum, 1 - E.hirae) любезно предоставленные нам НИИ Антимикробной химиотерапии ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия»;

- 65 референс-штаммов бактерий других родов из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА (Staphylococcus: 10 - S.aureus; Streptococcus: 5 - S. pneumoniae; Escherichia: 2 - E.coli; Proteus: 5 - P.vulgaris; Morganella: 3 - M.morganii; Citrobacter: 5 - C.freundii; Enterobacter: 5 - E.cloaceae; Klebsiella: 5 - K.pneumoniae; Yersinia: 5 - Y.enterocolitica; Providencia: 5 - P. rettgeri; Aeromonas: 5 - A.hydrophila; Pseudomonas: 5 - P.aeruginosa; Bacillus: 5 - B.cereus).

Объекты внешней среды: пищевое сырье, бытовые сточные воды, вода открытых водоемов, сточные воды ферм, фекалии больных и патологический материал (кровь сердца, печень, селезенка, кишечник) павших животных.

Штаммы бактериофагов E.faecalis: объектами исследования являлись 7 фагов бактерий вида E.faecalis, выделенные нами из объектов внешней среды.

Методы. Выделение и идентификацию бактерий рода Enterococcus проводили в соответствии с «Методическими указаниями по лабораторной диагностике стрептококкоза животных», утвержденными Департаментом ветеринарии МСХ СССР (1990).

При необходимости использовали дополнительные тесты, изложенные в «Определителе бактерий Берджи» (1997), «Методических рекомендациях по лабораторной диагностике энтерококковой инфекции» (Седов, 1983).

Выделение и изучение основных биологических свойств проводили по методам, предложенным М. Адамсом (1961), Д.М. Гольдфарбом (1961), А.С. Тихоненко (1968), И.П. Ревенко (1978), И.М. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (2006).

Реакцию нарастания титра фага для индикации бактерий вида E.faecalis в объектах внешней среды проводили по методикам, предложенным В.Д. Тимаковым, Д.М. Гольдфарбом (1961), В.Я. Ганюшкиным (1988). Статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятыми методами (Ашмарин, 1962; Бейли, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение бактериофагов E.faecalis

Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактериофагов Enterococcus из объектов внешней среды. Материалом для выделения являлось пищевое сырье, сточные воды и фекалии свиноводческих и молочно-товарных ферм, частных хозяйств Ульяновской и Самарской областей. Всего исследовано 33 пробы.

Исследуемый материал объемом 10 мл засевали в колбу с мясопептонным бульоном в объеме 50 мл, внося при этом по 1 мл 18-часовых бульонных культур бактерий вида E.faecalis № 189, 13, 345, «Соколово», «Константиновский». Посевы инкубировали при температуре 37°С в течение 18 - 24 часов. После инкубации из колбы брали 10 мл жидкости и помешали в стерильную пробирку. Затем, с целью инактивации посторонней микрофлоры, материал обрабатывали хлороформом (1:10) и центрифугировали в течение 30 мин при 700 g.

Полученный надосадок исследовали методом агаровых слоев на присутствие бактериофага, гомологичного энтерококкам. Присутствие бактериофага определяли по наличию прозрачных пятен, хорошо видимых на матовом фоне глубинного роста бактерий. Отбор выделенных бактериофагов и повышение их литической активности проводили пассивированием фагов на индикаторных культурах с периодическим пересевом типичных для данного изолята негативных колоний.

В результате проведенных исследований в отношении бактерий вида E.faecalis выделено 7 штаммов бактериофагов (табл. 1).

Таблица 1 - Источник выделения бактериофагов E.faecalis

Фаги	Индикаторный штамм E.faecalis	Источник	Место и год выделения
EF - 1 УГСХА	E.faecalis БШ № 1	Сточные воды	п. Октябрьский Чердаклинского района, 2006
EF - 2 УГСХА	E.faecalis БШ № 1	Фекалии поросят	Ставропольский район Самарской области, 2006
EF - 3 УГСХА	E.faecalis № 13	Сточные воды	Учебно-опытное хозяйство УГСХА, 2007
EF - 4 УГСХА	E.faecalis № 189	Сточные воды	Птицефабрика «Ульяновская» Чердаклинского района, 2007
EF - 5 УГСХА	E.faecalis № 189	Сточные воды	Подсобное хозяйство ИК № 9 Заволжского района, 2007
EF - 6 УГСХА	E.faecalis № 345	Фекалии телят	п. Первомайский Чердаклинского района, 2007
EF - 7 УГСХА	E.faecalis № 189	Фекалии телят	п. Пятисотенный Чердаклинского района, 2007

Характеристика биологических свойств выделенных бактериофагов. Морфология негативных колоний

Морфологию негативных колоний фагов изучали при посевах фагов методом агаровых слоев. Негативные колонии, образуемые изучаемыми бактериофагами, имели схожую морфологию: колонии округлой формы с ровными краями, в диаметре от 1 до 4 мм, прозрачные, без вторичного роста и зоны неполного лизиса.

Литическая активность

Литическую активность выделенных бактериофагов определяли методами Аппельмана (метод серийных разведений в жидкой питательной среде) и Грациа (метод агаровых слоев на плотной питательной среде).

Литическая активность составляла 10-9 - 10-10 по методу Аппельмана и 4 х 109 - 2 х 1010 по методу Грациа. Все изоляты фагов обладали литической активностью, достаточной для использования их в качестве диагностических препаратов (табл. 2).

Таблица 2 - Литическая активность бактериофагов E.faecalis

Бактериофаги	Литическая активность
	по методу Аппельмана (степень разведения)	по методу Грациа (количество корпускул в 1 мл)
EF - 1 УГСХА	10-9	4 х 109
EF - 2 УГСХА	10-10	1 х 1010
EF - 3 УГСХА	10-10	2 х 1010
EF - 4 УГСХА	10-9	6 х 109
EF - 5 УГСХА	10-9	4 х 109
EF - 6 УГСХА	10-10	2 х 1010
EF - 7 УГСХА	10-9	8 х 109

Диапазон литической активности

Диапазон литической активности изучали методом нанесения бактериофага на газон бактериальных культур бактерий вида E.faecalis.

Опыты показали, что спектр лизиса гомологичных микроорганизмов находился в пределах от 48,3 % до 90,2 % из числа изучаемых штаммов. Максимальный спектр совместного литического действия (94 %) был обнаружен у двух бактериофагов - EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА (табл. 3).

Специфичность

Специфичность энтерококковых бактериофагов изучали методом нанесения фага на газон бактериальной культуры представителей других видов, родов. В результате изучения специфичности выделенных бактериофагов по отношению к представителям других видов рода Enterococcus, других родов установлено, что данные фаги не лизировали ни одну из испытуемых культур (табл. 3).

Таблица 3 - Диапазон активности и специфичность бактериофагов E.faecalis

Род (вид) бактерий	Количество исследуемых штаммов	Бактериофаги серии УГСХА
		EF-1	EF-2	EF-3	EF-4	EF-5	EF-6	EF-7
		Процент лизируемых культур
E.faecalis	120	48,3	58,3	60,8	90,2	86,6	76,7	79,2
E.facium	83	-	-	-	-	-	-	-
E.raffinosus	3	-	-	-	-	-	-	-
E.casseliflavus	3	-	-	-	-	-	-	-
E.durans	2	-	-	-	-	-	-	-
E.avium	1	-	-	-	-	-	-	-
E.gallinarum	1	-	-	-	-	-	-	-
E.hirae	1	-	-	-	-	-	-	-
Streptococcus	5	-	-	-	-	-	-	-
Staphylococcus	10	-	-	-	-	-	-	-
Escherichia	2	-	-	-	-	-	-	-
Proteus	5	-	-	-	-	-	-	-
Morganella	3	-	-	-	-	-	-	-
Citrobacter	5	-	-	-	-	-	-	-
Enterobacter	5	-	-	-	-	-	-	-
Klebsiella	5	-	-	-	-	-	-	-
Yersinia	5	-	-	-	-	-	-	-
Providencia	5	-	-	-	-	-	-	-
Aeromonas	5	-	-	-	-	-	-	-
Pseudomonas	5	-	-	-	-	-	-	-
Bacillus	5	-	-	-	-	-	-	-

Примечание: «-» - отсутствие лизиса.

Температурная устойчивость

При изучении воздействия высокой температурой на изучаемые фаголизаты было установлено, что температурный диапазон в 60 - 65°С существенно снижает активность тестируемых фагов (с 109 до 102), температура выше 67°С полностью их инактивирует. Используемые температурные режимы (диапазон от 60° до 69°С) не снизили активность культуры индикаторного штамма энтерококков (табл. 4).

Таблица 4 - Температурная устойчивость бактериофагов E.faecalis

Температурный режим, °С	Активность штаммов, подвергнутых температурной обработке, количество активных корпускул в 1 мл
	ИШ	EF - 1	EF - 2	EF - 3	EF - 4	EF - 5	EF - 6	EF - 7
60 - 62	7х109	1х108	2х108	5х108	1х108	3х108	2х107	2х108
63 - 64	6х109	2х102	1х102	6х102	7х103	2х103	3х103	1х103
65 - 66	6х109	-	-	4х102	1х101	7х101	-	7х101
67 - 69	6х109	-	-	-	-	-	-	-
Контроль	7х109	5х109	2х109	7х109	1х109	5х109	2х109	3х109

Чувствительность бактериофагов к воздействию хлороформа

Результаты исследований устойчивости фагов к воздействию хлороформа показали, что существенных изменений количества активных корпускул фагов в 1 мл при обработке хлороформом не происходит. Воздействие хлороформом на культуру индикаторного штамма энтерококков в течение 15 минут приводило к полной инактивации изучаемых микроорганизмов (табл. 5).

Таблица 5 - Устойчивость бактериофагов E.faecalis к воздействию хлороформа

Время воздействия хлороформа, мин	Активность штаммов, подвергнутых обработке хлороформом, количество активных корпускул в 1 мл
	ИШ	EF - 1	EF - 2	EF - 3	EF - 4	EF - 5	EF - 6	EF - 7
15	-	2х109	2х109	9х109	1х109	7х109	3х109	6х109
30	-	1х109	1х109	9х109	1х109	5х109	3х109	5х109
45	-	1х109	1х109	6х109	1х109	5х109	1х109	5х109
Контроль	7х109	5х109	2х109	7х109	1х109	5х109	2х109	3х109

Примечание: ИШ - индикаторный штамм культуры бактерий вида E.faecalis № 189.

Морфология фаговых корпускул

Для электронно-микроскопических исследований морфологии фаговых корпускул использовали фаголизаты EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА в титре 3 х 109 - 1 х 1010 фаговых корпускул в 1 мл.

В результате проведенных исследований было установлено, что вирионы фага EF - 4 УГСХА состоят из головки в виде удлиненного многогранника и длинного несокращающегося отростка. Длина головки составляет - 97,2 0,8 нм, ширина - 41,6 0,2 нм; длина отростка - 125 0,8 нм. Вирионы фага EF - 5 УГСХА также состоят из головки в виде удлиненного многогранника и длинного несокращающегося отростка. На конце отростка имеется базальная пластика. Длина головки - 97,2 0,8 нм, ширина - 50,0 0,2 нм, длина отростка - 138,8 0,8 нм. Морфология бактериофагов EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА представлена на рисунках 1, 2.

Таким образом, согласно Международной классификации и таксономии вирусов по морфологии бактериофаги EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА относятся к семейству Siphoviridae, по классификации А.С. Тихоненко - к IV морфологической группе: «Фаги с длинным несокращающимся отростком».



Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Морфология бактериофага EF - 4 УГСХАЧ 36000

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Морфология бактериофага EF - 5 УГСХАЧ 36000

Разработка технологических параметров изготовления и контроля индикаторных энтерококковых бактериофагов

На основании изученных биологических свойств были отобраны два изолята энтерококковых фагов EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА, рекомендованные для изготовления биопрепарата.

Оптимальными технологическими параметрами для изготовления биопрепарата с высокой литической активностью являются: соотношение количества фаговых корпускул к количеству бактериальных клеток индикаторного штамма бактерий вида E.faecalis 1 : 3, время инкубации при температуре 37оС - 6 часов. Для освобождения фаголизатов от жизнеспособных бактерий необходимо применение хлороформа (соотношение 1 : 10 в течение 30 минут).

Разработка параметров ускоренной идентификации бактерий вида E.faecalis с помощью бактериофагов

Используя строгую специфичность бактериофагов EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА в отношении бактерий вида E.faecalis, были отработаны параметры схемы ускоренной идентификации указанных микроорганизмов (рис. 3). В исследованиях использовали воду, комбикорм, мясо, контаминированные бактериями вида E.faecalis в концентрации 105, 104, 103, 102, 101 м.к. в 1 мл.

Посев материала проводили на энтерококкагар, молочно-ингибиторную среду, посевы инкубировали 18 - 24 часа при температуре 37°С. Бульонные культуры, полученные после пересева колоний, микроскопии (окраска по Граму) и при наличии в мазках грамположительных кокков, идентифицировали бактериологическим методом и с помощью отобранных бактериофагов. Идентификацию бактерий проводили методом нанесения фага на газон культуры. Наличие зоны лизиса на сплошном газоне культуры хотя бы одного из фагов указывало на принадлежность исследуемого штамма к виду E.faecalis. Фагоидентификация выделенных штаммов как бактерий вида E.faecalis во всех случаях подтверждена результатами биохимических свойств.

Экспериментальные данные определяют возможность идентификации бактерий вида E.faecalis фагами EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА, срок исследования по сравнению с бактериологическим методом при этом сокращается с 4 до 2 суток при меньшем расходе питательных сред, реактивов, лабораторной посуды.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3. Выделение бактерий вида E.faecalis и ускоренная идентификация с помощью бактериофагов (1) в сравнении с традиционной схемой бактериологического исследования (2)

Разработка оптимальных условий постановки РНФ. Определение количественного показателя РНФ

Для определения уровня нарастания титра, при котором РНФ можно считать положительной, были проведены эксперименты по обнаружению культур E.faecalis разных заражающих концентраций (от 105 до 101 м.к./мл) в мясопептонном бульоне.

Установлено, что результат реакции является положительным, т.е. увеличение количества корпускул фага EF - 4 УГСХА более чем в 5 раз, в пробах, при контаминации мясопептонного бульона бактериями E.faecalis в концентрации 103 м.к./мл, для фага EF - 5 УГСХА - при контаминации мясопептонного бульона бактериями E.faecalis в концентрации 104 м.к./мл.

Установление оптимального времени РНФ

В разработку оптимальных условий постановки реакции входит установление времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие бактериофага с бактериями. Оптимальное время экспозиции выбирали из следующих параметров:

- предварительное подращивание исследуемого материала в течение 5, 16, 24 часов при температуре 37оС, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37оС;

- увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 7, 10, 16, 24 часов при температуре 37оС.

В результате исследований было установлено, что после предварительного подращивания исследуемого материала в течение 5 часов удалось обнаружить энтерококки, гомологичные фагу EF - 4 УГСХА в концентрации 102 м.к./мл, фагу EF - 5 УГСХА - 103 м.к./мл (табл. 6, 7).

Таблица 6 - Чувствительность РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала с фагом EF - 4 УГСХА

Время контакта, часов	Концентрация индикаторной культуры, м.к./мл	Время на исследование, часов
	101	102	103	104	105
	Результат РНФ
5	-	+	+	+	+	22
16	+	+	+	+	+	33
24	+	+	+	+	+	41

Таблица 7 - Чувствительность РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала с фагом EF - 5 УГСХА

Время контакта, часов	Концентрация индикаторной культуры, м.к./мл	Время на исследование, часов
	101	102	103	104	105
	Результат РНФ
5	-	-	+	+	+	22
16	-	+	+	+	+	33
24	+	+	+	+	+	41

Увеличение времени предварительной инкубации до 16 часов повысило чувствительность РНФ на один порядок для обоих фагов. Подращивание материала при 24-часовой экспозиции существенно не повлияло на результаты РНФ.

Во второй серии опытов изучали чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагами.

В результате проведенных исследований было установлено, что при инкубировании материала в течение 7 часов бактерии были обнаружены с помощью РНФ гомологичными фагами EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА в концентрации 102 и 103 м.к./мл исследуемого материала соответственно. Увеличение времени контакта материала с фагами позволило обнаружить исходные бактерии в концентрации 102 всеми фагами. 16 и 24-часовой контакт исследуемого материала с фагами не повлиял на чувствительность РНФ (табл. 8, 9).

Таблица 8 - Чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагом EF - 4 УГСХА

Время контакта, часов	Концентрация индикаторной культуры, м.к./мл	Время на исследование, часов
	101	102	103	104	105
	Результат РНФ
7	-	+	+	+	+	19
10	+	+	+	+	+	22
16	+	+	+	+	+	28
24	+	+	+	+	+	36

Таблица 9 - Чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагом EF - 5 УГСХА

Время контакта, часов	Концентрация индикаторной культуры, м.к./мл	Время на исследование, часов
	101	102	103	104	105
	Результат РНФ
7	-	-	+	+	+	19
10	-	+	+	+	+	22
16	+	+	+	+	+	28
24	+	+	+	+	+	36

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что предварительное подращивание материала увеличивает время реакции, но чувствительность метода при этом не меняется в сравнении с исследованиями без подращивания.

Полученные экспериментальные данные позволяют считать, что наиболее оптимальным является режим РНФ при 7 часовой экспозиции исследуемого материала с фагами без подращивания, когда удается провести индикацию энтерококков в количестве 102 - 103 м.к./мл изучаемого субстрата, на исследование которого затрачивается 19 - 24 часа. Поэтому данный режим рекомендован для дальнейших исследований.

Использование РНФ для индикации бактерий вида E.faecalis в объектах внешней среды

В настоящее время исследователи уделяют большое внимание разработке простых и надежных методов индикации различных патогенных бактерий в объектах внешней среды. Были проведены исследования по определению возможности использования РНФ для обнаружения бактерий вида E.faecalis в объектах внешней среды. Параллельно исследования велись бактериологическими методами.

По результатам исследований проб водопроводной воды, комбикорма, мяса, патологического материала установлено, что увеличение титра фагов EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации бактерий вида E.faecalis 103 м.к./г при наличии посторонней микрофлоры.

При исследовании объектов внешней среды нами было обнаружено существенное преимущество РНФ перед бактериологическим методом исследования. С помощью РНФ за 19 - 24 часа исследования можно обнаружить бактерии вида E.faecalis в изучаемых объектах в количестве 103 м.к./г. Бактериологическим методом удавалось обнаружить бактерии вида E.faecalis в минимальной концентрации 104 м.к./г, но при этом затрачивается не менее 96 часов.

Исследование маститного молока с помощью РНФ на наличие бактерий вида E.faecalis

Для оценки эффективности реакции нарастания титра фага в условиях производства были проведены исследования по фагоиндикации бактерий вида E.faecalis в маститном молоке. Опыт проводился на базе бактериологического отдела ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория». В качестве исследуемого материала использовали 10 проб молока от больных маститом коров животноводческого комплекса «Октябрьский» Чердаклинского района Ульяновской области.

При исследовании бактериологическим методом бактерии вида E.faecalis были выделены из двух проб (20 %). Время исследования составило около 120 часов. При исследовании материала методом РНФ с использованием специфических энтерококковых бактериофагов EF - 4 и EF - 5 серии УГСХА бактерии вида E.faecalis были обнаружены в пяти пробах (50 %). Время исследования составило 24 часа.

Результаты производственного опыта подтверждают более высокую чувствительность реакции нарастания титра фага при обнаружении бактерий вида E.faecalis в сравнении с бактериологическим методом исследования при меньшей затрате времени и реактивов.

Изучение эффективности сконструированного биопрепарата энтерококковых бактериофагов

Для усовершенствования предложенного метода изучалась возможность использования не отдельных монофагов, а их смеси. Установлено, что сконструированный биопрепарат, состоящий их двух энтерококковых бактериофагов ЕF - 4 УГСХА и ЕF - 5 УГСХА, по параметрам необходимым для проведения идентификации и индикации бактерий вида E.faecalis (высокая литическая активность, широкий диапазон литической активности, выраженная видовая специфичность, более высокий, чем у бактерий порог инактивации) соответствует отдельным монофагам. Антагонистический эффект при взаимодействии фагов EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА отсутствует.

ВЫВОДЫ

1. Бактериофаги E.faecalis широко распространены в природе: из 33 проб объектов внешней среды выделено 7 изолятов бактериофагов, активных в отношении бактерий вида E.faecalis.

2. Изучены основные биологические свойства бактериофагов Enterococcus:

- изоляты фагов имели однородные негативные колонии (от 1 до 4 мм);

- литическая активность составила от 10-9 до 10-10 по методу Аппельмана и от 4 х 109 до 2 х 1010 по методу Грациа;

- бактериофаги обладали выраженной специфичностью к бактериям вида E.faecalis;

- все изоляты фагов были термолабильны и хлороформоустойчивы;

- по морфологии бактериофаги EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА относятся к семейству Siphoviridae.

3. Показано, то бактериофаги EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА, отобранные на основании изученных биологических свойств, обладают совместным спектром литической активности 94 % по отношению к имеющимся штаммам бактерий вида E.faecalis и пригодны для конструирования биопрепарата.

4. Разработаны параметры схемы фагоидентификации бактерий вида E.faecalis с помощью созданного биопрепарата индикаторных бактериофагов EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА, позволяющие идентифицировать гомологичные бактерии за 48 часов.

5. Разработаны технологические параметры постановки реакции нарастания титра фага для ускоренной индикации бактерий вида E.faecalis в объектах внешней среды с использованием биопрепарата из фагов EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА, позволяющие обнаружить в исследуемом материале указанные бактерии в концентрации от 103 м.к. в 1 г (1 мл) за 19 - 24 часа.

6. Оптимальными технологическими параметрами для изготовления специфического биопрепарата энтерококковых бактериофагов EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА с высокой литической активностью являются: соотношение количества фаговых корпускул к количеству бактериальных клеток индикаторного штамма бактерий вида E.faecalis 1 : 3, время инкубации при температуре 37оС - 6 часов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложены 2 штамма бактериофагов E.faecalis EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА, обладающие высокой литической активностью, строгой видовой специфичностью, широким спектром литической активности для изготовления биопрепарата.

2. Фагоидентификацию бактерий вида E.faecalis необходимо проводить с помощью набора бактериофагов, согласно «Методическим рекомендациям по выделению и идентификации бактерий вида E.faecalis из патологического материала, пищевых продуктов, кормов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов EF - 4 УГСХА, EF - 5 УГСХА».

3. Индикацию бактерий вида E.faecalis в исследуемых объектах предложено проводить с помощью набора диагностических бактериофагов EF - 4 УГСХА, EF - 5 УГСХА, согласно «Методическим рекомендациям по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага бактерий вида E.faecalis в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды».

4. Изготовление и контроль набора индикаторных энтерококковых бактериофагов проводить в соответствии с «Инструкцией по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов E.faecalis EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ковалева, Е.Н. Перспективы использования бактериофагов для диагностики, лечения и профилактики инфекций, вызываемых бактериями рода Enterococcus / Е.Н. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Молодежь и наука XXI века: материалы Международной научно-практической конференции, 21 - 23 марта, 2006. - Ульяновск, 2006. - Ч.1. - С. 356 - 359.

2. Ковалева, Е.Н. Разработка оптимальной схемы выделения и идентификации Enterococcus faecalis / Е.Н. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Аграрная наука и образование в реализации национального проекта «Развитие АПК»: материалы Всероссийской научно-практической конференции, 22 - 24 ноября, 2006. - Ульяновск, 2006. - Ч. 1. - С. 323 - 325.

3. Ковалева, Е.Н. Выделение и селекция клонов бактериофагов активных в отношении Enterococcus faecalis / Е.Н. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Роль молодых ученых в реализации национального проекта «Развитие АПК»: сборник материалов Международной научно-практической конференции, 29 - 30 мая, 2007. - Москва, 2007. - Ч. 2. - С. 248 - 250.

4. Ковалева, Е.Н. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов Enterococcus / Е.Н. Ковалева, С.Н. Золотухин // Ломоносов: материалы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, 8 - 11 апреля, 2008. - М.: Издательство МГУ, 2008. - С. 7.

5. Ковалева, Е.Н. Определение устойчивости бактериофагов Enterococcus к воздействию высокой температуры и хлороформа / Е.Н. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: материалы Международной научно-практической конференции, 20 - 22 мая, 2008. - Ульяновск, 2008. - Т. IV. - С. 137 - 139.

6. Ковалева, Е.Н. Бактериофаги Enterococcus и перспективы их практического применения в ветеринарии / Е.Н. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел: материалы Международной научно-практической конференции, 9 - 10 октября, 2008. - Москва, 2008. - С. 333 - 336.

7. Ковалева, Е.Н. Биологические свойства бактериофагов Enterococcus / Е.Н. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: материалы Международной научно-практической конференции, 13 - 14 ноября, 2008. - Покров, 2008. - Т. I. - С. 219 - 221.

8. Ковалева, Е.Н. Подбор штаммов бактериофагов Enterococcus для конструирования диагностического препарата / Е.Н. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2008. - Т. 195. - С. 123 - 128.

9. Ковалева, Е.Н. Диапазон литического действия и специфичность бактериофагов Enterococcus faecalis / Е.Н. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - Москва, 2009. - Приложение 1. - Т. 11, № 2. - С.19.

Размещено на Allbest.ru