Характеристика биологической активности экзополисахаридов бактерий рода Lacto-bacillus и перспективы их использования

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Характеристика биологической активности экзополисахаридов бактерий рода Lactobacillus и перспективы их использования

03.02.03 - микробиология

Правдивцева Мария Ивановна

Саратов - 2012

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Среди самых распространенных биополимеров в природе особое место занимают полисахариды (гликаны) различного происхождения: животного, растительного, микробного (Zhang, Bishop, Kupferle, 1998; Flemming, Wingender, 2001). Данные биополимеры многообразны по строению, локализации в клетках, по своим физико-химическим и биологическим свойствам. Особенно разнообразны полисахариды, синтезируемые микроорганизмами. Микробные экзополисахариды являются объектом интенсивных исследований вследствие их важного значения в строении и метаболизме микроорганизмов. К настоящему времени известно достаточно много микроорганизмов, способных продуцировать экзополисахариды. Среди бактериальных экзополисахаридов значительное внимание уделяется экзополисахаридам молочнокислых бактерий (Sandford, Cottrell, Pettitt, 1984; Sikkema, Oba, 1998; Degeest, Vaningelgem, Vuyst, 2001; Korakli et al., 2001; Bergmaier, Champagne, Lacroix, 2003; Champagne, Gardner, Lacroix, 2007; Полукаров, 2009 и др.). В то же время роль их в живых организмах не является до конца известной. Для обоснования применения экзополисахаридов молочнокислых бактерий в медико-биологической практике, ветеринарии, пищевой промышленности необходимы знания об их биологической активности. В связи с этим исследования, посвященные изучению биологической активности экзополисахаридов молочнокислых бактерий рода Lactobacillus различных штаммов, являются актуальными и могут иметь значительный научный интерес и прикладное значение.

Цель работы - характеристика биологической активности экзополисахаридов молочнокислых бактерий рода Lactobacillus - лаксаранов 1596, 1936, Z и обоснование их практического применения.

Задачи исследований:

1. Оценить токсичность экзополисахаридов L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 (лаксаран 1596), L. delbrueckii B-1936 (лаксаран 1936) и L. delbrueckii ssp. bulgaricus (лаксаран Z) на биотест-объектах Colpoda steinii.

2. Выявить влияние лаксаранов 1596, 1936 и Z на микрофлору толстого кишечника крыс в норме и при различных видах стресса (иммобилизационный, холодовой и этаноловый).

3. Оценить влияние лаксаранов 1596, 1936 и Z на фагоцитарную активность макрофагов белых мышей при фагоцитозе S. aureus 209-P.

4. Исследовать продукцию цитокинов альвеолярными и перитонеальными макрофагами экспериментальных животных в процессе фагоцитоза in vitro S. aureus 209-Р на фоне действия in vivo лаксаранов 1596, 1936 и Z.

5. Оценить ранозаживляющие свойства лаксаранов 1596, 1936, Z и пленок, созданных на их основе.

6. Исследовать антимикробную активность лаксаранов 1596, 1936 и Z в отношении некоторой сапрофитной микрофлоры (Escherichia coli 01, Staphylococcus aureus 209-P, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27533, Candida albicans 130).

7. Изучить влияние добавок лаксаранов 1596, 1936 и Z на структурно-механические, физико-химические, микробиологические и органолептические свойства сыровяленой колбасы «Русич».

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование биологической активности экзополисахаридов L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 (лаксаран 1596), L. delbrueckii B-1936 (лаксаран 1936) и L. delbrueckii ssp. bulgaricus (лаксаран Z). На биотест-объектах C.steinii показано отсутствие их токсичности в концентрации 0, 06 г/кг. Установлена способность лаксаранов 1596, 1936, Z нормализовать кишечную микрофлору в условиях стресса; стимулировать рост некоторых молочнокислых бактерий и подавлять рост энтеропатогенной кишечной палочки и стафилококков в толстом кишечнике при иммобилизационном, холодовом и этаноловом стрессах. Впервые показано in vitro, что введение лаксаранов 1596, 1936, Z in vivo в организм мышей способствует увеличению числа активных макрофагов и завершению процесса фагоцитоза. Введение лаксаранов 1596, 1936 и Z в организм мышей стимулирует синтез провоспалительных цитокинов в разное время процесса фагоцитоза S. aureus 209-P (30 мин, 1 ч, 6 ч). Выявлена способность лаксаранов ускорять заживление ранений резаного типа у крыс. В условиях in vitro исследована антимикробная активность лаксаранов 1596, 1936, Z в отношении некоторой сапрофитной микрофлоры (Escherichia coli 01, Staphylococcus aureus 209-P, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27533, Candida albicans 130). Показано, что лаксараны 1596, 1936, Z в количестве 0,06 г на 1 кг сырья улучшают структурно-механические, физико-химические, микробиологические и органолептические свойства сыровяленой колбасы.

Практическая значимость. Выявленная способность нетоксичных экзополисахаридов L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 (лаксаран 1596), L. delbrueckii B-1936 (лаксаран 1936) и L. delbrueckii ssp. bulgaricus (лаксаран Z) стимулировать рост некоторых молочнокислых бактерий и подавлять рост энтеропатогенной кишечной палочки и стафилококков в толстом кишечнике при иммобилизационном, холодовом и этаноловом стрессах, регулировать активность факторов естественной резистентности, ускорять заживление ранений, оказывать антимикробную активность, открывает перспективы их использования в экспериментальной биологии, фармацевтической и ветеринарной практике. Способность лаксаранов улучшать структурно-механические, физико-химические, микробиологические и органолептические свойства сыровяленых колбас, открывает возможность их использования в пищевой промышленности. Проведены эксперименты по изготовлению сыровяленых колбас с использованием лаксаранов 1596, 1936, Z в учебно-научном производственном цехе-лаборатории мяса и мясных продуктов СГАУ им. Н.И. Вавилова, что подтверждено актом производственных испытаний. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Экзополисахариды L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii ssp. bulgaricus не являются токсичными в концентрации 0,06 г/кг.

2. Экзополисахариды L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii ssp. bulgaricus стимулируют рост некоторых молочнокислых бактерий и подавляют количество энтеропатогенной кишечной палочки и стафилококков в толстом кишечнике в условиях иммобилизационного, холодового, этанолового стрессов.

3. Экзополисахариды L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596, L. delbrueckii В-1936 и L. delbrueckii ssp. bulgaricus в концентрации 0,006 г/мл, стимулируют фагоцитарную активность макрофагов белых мышей и влияют на продукцию основных провоспалительных цитокинов ИЛ-1б и ФНО-б перитонеальными и альвеолярными макрофагами, способствуя активации факторов естественной резистентности.

4. Экзополисахариды L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596, L. delbrueckii В-1936 и L. delbrueckii ssp. bulgaricus приводят к более быстрому заживлению ранений резаного типа у экспериментальных животных (крыс), в большей степени лаксаран Z; проявляют in vitro антимикробную активность в отношении некоторой сапрофитной микрофлоры (E. coli 01, S. aureus 209-P, P. aeruginosa АТСС 27533 и C. albicans 130).

5. Экзополисахариды L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596, L. delbrueckii В-1936 и L. delbrueckii ssp. bulgaricus при добавлении в рецептуру сыровяленых колбас (0,06 г на 1 кг сырья) улучшают их структурно-механические, физико-химические, микробиологические и органолептические свойства.

Работа выполнена на кафедре микробиологии вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» в рамках научно-исследовательской темы: «Роль биологически активных веществ (лектины, экзополисахариды) в регуляции метаболизма про- и эукариот».

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию факультета (института) ветеринарной медицины (Саратов, 2009); Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения - 2009» (Саратов, 2009); профессорско-преподавательской конференции по итогам научно-исследовательской работы (Саратов, 2011); научной Международной конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники» (Шарм - Эль - Шейх, 2009); V общероссийской научной конференции «Актуальные вопросы науки и образования» (Москва, 2009); научной Международной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования» (Рио-де-Жанейро, 2009); IV Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2011); Научно-практическом семинаре с международным участием «Настоящее и будущее биотехнологии в решении проблем экологии, медицины, сельского, лесного хозяйства и промышленности» (Ульяновск, 2011); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011); конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской, учебно-методической и воспитательной работы (Саратов, 2012).

Личный вклад соискателя состоит в подготовке и проведении экспериментальных исследований на всех этапах диссертационной работы, интерпретации полученных результатов, участии в подготовке публикаций.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

2. Собственные исследования

Объект, материалы и методы исследований

В работе использовали экзополисахариды Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 (лаксаран 1596), L. delbrueckii B-1936 (лаксаран 1936) и L. delbrueckii ssp. bulgaricus (лаксаран Z), выделенные по методу А. Welman (2003) в модификации Е.В. Полукарова (2009).

Культуры L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 и L. delbrueckii B-1936 были получены из Российской коллекции микроорганизмов (г. Пущино-на-Оке); L. delbrueckii ssp. bulgaricus - из сухого порошка лиофилизированной бактериальной закваски болгарских палочек, используемую в России для производства йогуртов (Государственное унитарное предприятие производственно - экспериментальный завод РАСХН, г. Москва). В работе также использовали бактерии Escherichia coli 01, Staphylococcus aureus 209-P, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27533, полученные из коллекции бактериальных культур кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии; инфузории Colpoda steinii, полученные из музея культур кафедры физиологии, экологии и биологии ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университета им. Н.И. Вавилова»; грибы - Candida albicans 130, полученные из музея коллекции культур «Государственный научно-исследовательский ветеринарный институт Россельхозакадемии».

Для выращивания молочнокислых бактерий использовали среду А. Welman с соавт. (2003), которая состояла из (г/л): лактозы - 20,0; дрожжевого экстракта - 5,0; гидролизата казеина - 20,0; K₂HPO₄ - 2,0; MgSO₄·7H₂O - 0,1; MnSO₄·4H₂O - 0,05; цитрата аммония - 2,0; ацетата натрия - 5,0; твин-80 - 1,0 мл/л и гидролизованное молоко; для стафилококков - желточно-солевой агар, для эшерихий - Эндо (Голубева, 1985), для псевдомонад - Плоскирева, для сальмонелл - Висмут-сульфит агар, для грибов - Сабуро (Лабинская, 1978).

Определение токсичности проводили по стандартной экспресс-методике определения общей токсичности с использованием простейших в качестве биотест-объектов C. steinii (Виноходов, 1995; Виноходов, Пожаров, 2006).

В работе использовали самцов белых нелинейных мышей со средней массой тела 21 г, а также самок беспородных белых крыс со средней массой 210 г. Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с требованиями Федерального закона от 01.01.1997 г. «О защите животных от жестокого обращения» и положениями Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 18.03.1986 г). Всех животных содержали в стандартных условиях вивария.

Иммобилизационный стресс моделировали путем фиксирования животных (крыс) на спине с использованием мягкой лигатуры в течение 10 минут, холодовой стресс - путем помещения крыс на лед на 10 минут; этаноловый стресс с помощью зонда вводили 1 мл 25 % раствора этилового спирта в желудок крыс.

Альвеолярные макрофаги (АМФ) выделяли из лёгких, а перитонеальные (ПМФ) из брюшной полости мышей по общепринятым методикам (Кондратьева, Воробьёва, Буракова, 2001). Активность процесса фагоцитоза, индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) и индекс активации киллинга (ИАК) вычисляли по общепринятым методикам (Клаус, 1990; Кондратьева, Самуилова, 2001) в условиях in vitro.

Провоспалительные цитокины ИЛ-1б и ФНО-б определяли с помощью иммуноферментных моноклональных тест-систем (производство ООО «Цитокин», г. Санкт-Петербург).

Ранозаживляющие свойства лаксаранов и плёнок, созданных на основе лаксаранов, определяли на модели резаных ран самок белых беспородных крыс. Животные были поделены на группы: контрольные животные, ранения которых не обрабатывали и опытные животные, которым на ранение наносили 50 мкл лаксарана 1596, либо лаксарана 1936, либо Z (0,06 г/кг). Животных контрольной и опытных групп в первые сутки эксперимента фиксировали на специальных планшетах и под эфирным наркозом в межлопаточной области наносили с помощью скальпеля параллельные резаные линейные раны спины длиной до 1 см (Брайловская, 2009).

Антимикробную активность лаксаранов 1596, 1936, Z и плёнок, приготовленных на основе данных лаксаранов, изучали методом диффузии в агар (Лабинская, 1978).

Сыровяленые колбасы изготовляли по рецептуре (Рогов, 2000). В сыровяленых колбасах определяли содержание массовой доли влаги, массовую долю связанной влаги (ВСС) (ГОСТ 51479-99), активную кислотность (рН) (ГОСТ 51478-99), активность воды (а_в) (Алейников, 2007), проводили определение массы продукта на лабораторных весах марки CAS CBX, органолептическую оценку (ГОСТ 9959-91), определение качественного и количественного состава микрофлоры (Лабинская, 1978; Берджи, 1997; Артемьева, 2002).

Статистический анализ результатов проводили по стандартным методикам (Воробьев, Елсуков, 1989). Использовали параметрический t-критерий Стъюдента, достоверными считали различия при вероятности ошибки р0,05.

3. Результаты исследований и их обсуждение

Оценка токсичности лаксаранов на биотест-объекте Colpoda steinii

Биоанализ токсичности лаксаранов 1596, 1936 и Z в концентрации 0,06 г/кг проводили, используя в качестве индикаторного организма инфузории - C.steinii. При микроскопировании простейших в контрольной группе наблюдали, что их количество (30 особей) на протяжении всего времени эксперимента (15 минут) не изменялось. Движение инфузорий было равномерным, передвигались они со скоростью 2 мм/с, морфология их не изменялась. При добавлении лаксарана 1596 и 1936 (в концентрации 0,06 г/кг) к взвеси инфузорий в первые минуты наблюдали нарушение координации движения инфузорий, они начинали двигаться быстрее (2,5 мм/с), через 10 мин движение простейших приходило в норму и в дальнейшем их поведение не отличалось от движения и скорости инфузорий в контроле. При добавлении лаксарана Z к простейшим в такой же концентрации было замечено, что инфузории двигались медленнее (1,5 мм/с), чем в группах с лаксаранами 1596 и 1936.^. При этом инфузории сохраняли жизнеспособность, морфология их не изменялась, только движение ресничек было замедлено в первые минуты эксперимента, через 5 минут их поведение не отличалось от поведения инфузорий в контрольной группе.

Таким образом, так как гибели инфузорий по истечении 15 минут не происходило и все они сохраняли свою подвижность, все исследуемые лаксараны, согласно ГОСТ 13496.7 - 97, можно отнести к нетоксичным соединениям.

Изучение влияния лаксаранов на микрофлору толстого кишечника крыс в норме и при различных видах стресса

Изучали влияние лаксаранов на микрофлору толстого кишечника крыс при ректальном введении 200 мкл лаксаранов в норме и при различных видах стресса (иммобилизационный, холодовой, этаноловый) (табл. 1-3).

Таблица 3 - Влияние лаксарана 1596 и действие различных видов стресса на микрофлору толстого кишечника крыс

Примечание: ° ? P< 0,05 относительно контрольной группы; ^Д ? Р< 0,05 относительно лаксарана 1596; ^*? P< 0,05 относительно иммобилизационного стресса; ^? ? P< 0,05 относительно холодового стресса; * ? P< 0,05 относительно этанолового стресса.

Таблица 2 - Влияние лаксарана 1936 и действие различных видов стресса на микрофлору толстого кишечника крыс

Примечание: ° ? P< 0,05 относительно контрольной группы; ^Д ? Р< 0,05 относительно лаксарана 1936; ^*? P< 0,05 относительно иммобилизационного стресса; ^? ? P< 0,05 относительно холодового стресса; * ? P< 0,05 относительно этанолового стресса.

В ходе проведенных экспериментов было установлено, что в интактной группе животных, которым ничего не вводили, количество молочнокислых бактерий, кишечной палочки, стафилококков практически не отличалось от количества бактерий контрольной группы животных (вводили ректально 200 мкл стерильной дистиллированной воды). Поэтому дальнейшие сравнения производили с показателями животных контрольной группы. В группах животных после иммобилизационного, холодового и этанолового стрессов, было отмечено понижение количества молочнокислых бактерий в 5,2; 1,5 и 1,4 раза, соответственно. Воздействие иммобилизационного стресса способствовало уменьшению количества кишечной палочки до 0,30·10⁵ КОЕ/г, при действии холодового и этанолового стрессов наблюдали увеличение количества кишечной палочки в 2,6 раза и 2,3 раза, относительно контрольной группы животных. Различные модели стресса оказывали влияние и на количество стафилококков. При действии иммобилизационного стресса количество стафилококков увеличилось в 2,4 раза относительно контрольной группы животных (табл. 1).

Таблица 3 - Влияние лаксарана Z и действие различных видов стресса на микрофлору толстого кишечника крыс

Примечание: ° ? P< 0,05 относительно контрольной группы; ^Д ? Р< 0,05 относительно лаксарана Z; ^*? P< 0,05 относительно иммобилизационного стресса; ^? ? P< 0,05 относительно холодового стресса; * ? P< 0,05 относительно этанолового стресса.

Таким образом, как свидетельствуют проведенные исследования, лаксараны способны в организме животных увеличивать количество молочнокислых бактерий и уменьшать количество условно-патогенной микрофлоры (кишечной палочки и стафилококков при всех рассмотренных видах стрессов), т.е. выполнять роль пребиотиков. Возможно, лаксараны могут выполнять питательную функцию для других бактерий, что является характерным для многих полисахаридов (Гринберг, 1980). Как показывают данные, приведенные в таблицах 1-3, лаксараны способны нормализовать микрофлору толстого кишечника крыс в условиях стресса в организме животных.

Влияние лаксаранов in vitro на активность и завершённость процесса фагоцитоза бактерий

При изучении влияния лаксаранов 1596, 1936, Z на процесс фагоцитоза бактерий S. aureus 209-P in vitro было показано, что в контрольной группе животных (которым не вводили лаксараны) при определении числа активных АМФ максимальное увеличение наблюдали к 6 часам процесса фагоцитоза S. aureus 209-Р. ИЗФ был равен - 0,26, фагоцитарный процесс был не завершён. В то время как, наибольшая активность ПМФ у контрольной группы мышей была отмечена через 1 час фагоцитоза S. aureus 209-Р, к 6 часам количество активных ПМФ снижалось. ИЗФ был равен 0,64, что позволило говорить о частичном переваривании микробных клеток.

В группе животных, которым вводили лаксаран 1596, было обнаружено, что активность АМФ была максимальной через 1 час фагоцитоза S. aureus 209-Р на 1 и 3 сутки эксперимента, на 5 и 7 сутки активность АМФ отмечена через 30 минут фагоцитоза S. aureus 209-Р, что было достоверно выше контроля. На 1 и 3 сутки ИАК был равен 0,85 и 0,52, соответственно, скорость фагоцитоза АМФ была выше, чем в контроле; на 5 и 7 сутки - ниже (ИАК равен - 0,11 и - 0,09). Число активных ПМФ при определении фагоцитарного индекса в опытной группе животных в течение всего процесса фагоцитоза S. aureus 209-Р составляло около 45%. На 3 сутки после введения лаксарана 1596 наибольшая активность ПМФ отмечена через 6 часов процесса фагоцитоза S. aureus 209-Р, ИЗФ составил 35 % (табл. 4).

Таблица 4 - Влияние лаксарана 1596 на завершённость процесса фагоцитоза S. aureus 209-Р

Примечание: * - достоверные различия по сравнению с контролем при p<0,05.

Активность ПМФ на 5 сутки эксперимента у мышей была на всех этапах процесса фагоцитоза достоверно выше контрольных значений. Максимальная активность зафиксирована через 1 час процесса фагоцитоза. Наибольшая активность отмечена для ПМФ, выделенных на 7 сутки процесса фагоцитоза, через 30 минут от начала фагоцитоза бактериальных клеток, фагоцитоз был не завершен. Скорость фагоцитоза во все сроки исследования была ниже, чем у контрольных макрофагов, ИАК имел отрицательные значения.

При изучении активности макрофагов из организма животных, которым вводили лаксаран 1936, показано, что для АМФ, выделенных на 1 сутки эксперимента, к 6 часам фагоцитоза in vitro активность АМФ сохранялась на уровне 40%, процесс фагоцитоза был не завершён (табл. 7). Наибольшая активность АМФ, выделенных на 3, 5 и 7 сутки, наблюдалась через 30 минут фагоцитоза S. aureus 209-Р. ИЗФ на 3 и 5 сутки иммуногенеза был равен 0,3, что свидетельствует о частичном переваривании микробных клеток, на 7 сутки ИЗФ имел отрицательные значения, процесс фагоцитоза был незавершённым. ИАК для АМФ у мышей, которым вводили лаксаран 1936, на 1 и 7 сутки имел отрицательные значения - 0,16 и - 0,24, соответственно, скорость фагоцитоза S. aureus 209-Р была ниже, чем в контрольных значениях, в отличие от 3 и 5 суток эксперимента, когда ИАК был равен 0,62 и 0,56, соответственно (табл. 5).

Таблица 5 - Влияние лаксарана 1936 на завершённость процесса фагоцитоза S. aureus 209-Р

Примечание: * - достоверные различия по сравнению с контролем при p<0,05.

Активность ПМФ у данной группы животных, выделенных на 1 и 3 сутки, достигла максимума через 30 минут процесса фагоцитоза S. aureus 209-Р; на 5 и 7 сутки через 1 час - составляла 42% и 28%, соответственно. По полученным данным можно говорить, что на 5 и 7 сутки исследования макрофаги были способны к частичному перевариванию микробных клеток, как и клетки контрольной группы, ИЗФ был равен 0,85 и 0,46. На 1 и 3 сутки процесс фагоцитоза был не завершённым (-0,06 и 0,06) (табл. 6). ИАК имел отрицательные значения на 1, 3 и 7 сутки. На 5 сутки скорость фагоцитоза была выше, чем в контроле (ИАК равен 0,21).

Таблица 6 - Влияние лаксарана Z на завершённость процесса фагоцитоза S. aureus 209-Р

Примечание: * - достоверные различия по сравнению с контролем при p<0,05.

Во все сроки исследований после введения животным лаксарана Z максимальное число активных АМФ наблюдалось через 30 минут фагоцитоза S. aureus 209-Р, к 6 часам фагоцитоза S. aureus 209-Р количество активных АМФ снижалось, что говорило о частичном переваривании микробных клеток. Активность ПМФ у мышей этой группы была максимальной через 30 минут фагоцитоза S. aureus 209-Р во все сроки исследований. ИЗФ на 1 сутки эксперимента имел отрицательные значения, фагоцитоз был не завершён. На 3, 5 и 7 сутки наблюдали частичное переваривание микробных клеток. По оценке активации киллинга показано, что скорость фагоцитоза АМФ была выше, чем ПМФ.

Изучение влияния лаксаранов на синтез провоспалительных цитокинов при фагоцитозе бактерий

При изучении влияния лаксаранов на синтез провоспалительных цитокинов при фагоцитозе S. aureus 209-P in vitro было установлено, что продукция ИЛ-1б АМФ в контрольной группе была равна 18 пг/мл через 0,5 и 1 час, а к завершению процесса фагоцитоза - 16 пг/мл. Синтез ИЛ-1б ПМФ контрольной группы животных в процессе фагоцитоза S. aureus 209-P равнялась 14, 16,17 пг/мл, соответственно.

После внутрибрюшинного введения лаксарана 1596 мышам было показано, что синтез ИЛ-1б при фагоцитозе S.aureus 209-P достоверно превышал контрольные значения через 6 часов в АМФ на 1, 3, 7 сутки после введения лаксарана 1596, и в течение всего процесса фагоцитоза - в АМФ на 5 сутки (рис.1а). Синтез ИЛ-1б ПМФ 1, 3 и 5 сутки после введения мышам лаксарана 1596, в течение всего процесса фагоцитоза S. aureus 209-P был выше контрольных значений. Продукция ИЛ-1б в ПМФ через 7 суток была достоверно выше контроля в 1,6 раза через 30 минут процесса фагоцитоза S.aureus 209-P (рис. 1б). Наряду с ИЛ-1б определяли продукцию ФНО-б. Синтез ФНО-б АМФ контрольной группы животных в динамике процесса фагоцитоза равнялся 135, 127, 120 пг/мл для 30 минут, 1 и 6 часов, а ПМФ - 105, 96 и 92 пг/мл, соответственно. На 1 и 7 сутки после введения мышам лаксарана 1596 продукция ФНО-б АМФ была на уровне контрольных значений, а на 3, 5 сутки синтез ФНО-б был достоверно ниже контрольных значений во все время процесса фагоцитоза S.aureus 209-P (рис. 1в). Продукция ФНО-б ПМФ после внутрибрюшинного введения лаксарана 1596 на 1, 3 и 5 сутки была достоверно ниже контрольных значений. Тогда как на 7 сутки эксперимента количество ФНО-б составляло 180 пг/мл, что в 1,7 раз выше контрольных значений (рис. 1г).

Такое позднее воздействие лаксарана 1596 на фагоциты (7 сутки после введения) можно объяснить, очевидно, тем, что именно на этом этапе биологический эффект лаксарана 1596 в отношении продукции макрофагами ФНО-б начинает проявляться.

а б

в г

Рис. 1. Влияние лаксарана 1596 на продукцию ИЛ-1б АМФ (а), ПМФ (б) и ФНО-б АМФ (в), ПМФ (г), при фагоцитозе бактерий S. aureus 209-P

Аналогичные результаты были получены и при введении мышам лаксарана 1936.

После введения мышам лаксарана Z содержание ИЛ-1б, продуцируемого АМФ и ПМФ, в процессе фагоцитоза S. aureus 209-P незначительно отличалось от контрольных значений. Количество ФНО-б, продуцируемого АМФ было достоверно ниже контроля во время всего процесса фагоцитоза S. aureus 209-P. Продукция ФНО-б ПМФ выделенные из организма животных на 3, 5 и 7 сутки процесса фагоцитоза S. aureus 209-P in vitro была ниже контрольных значений, в отличие от 1 суток, где количество ФНО-б через 30 минут, 1 час и 6 часов было в 1,3 раза; 1,4 раза и 1,4 раза, соответственно, выше контрольных значений.

Исследование ранозаживляющих свойств лаксаранов и пленок, созданных на основе лаксаранов

При изучении ранозаживляющих свойств лаксаранов и пленок, созданных на их основе, в контрольной группе в течение первых суток после нанесения раны отмечали образование сгустка крови, края раны были широкие и цвет раны красно-коричневый. На третьи сутки опыта эпидермис плотно прилегал к стенке раневого канала и по краям раны под струпом начинал загибаться. При этом края раны были широкими по сравнению с первым днем эксперимента. К четвертым суткам начиналось восстановление эпителия и формирование на месте дефекта грануляционной ткани. На пятые сутки грануляционная ткань не полностью заполняла раневой канал, наблюдали рост эпителия под струпом по боковой поверхности раневого канала. К шестым суткам эпидермис не полностью перекрывал рану, она была заполнена первичной грануляционной тканью, т.е. отмечалось частичное заживление раны с помощью рубца. По истечении семи дней эксперимента рубец на кожи животных был четко виден.

При нанесении на рану лаксарана 1596 было замечено, что на поверхности раны в первые сутки образовывалась новая бледно-розовая грануляционная ткань на основе пролиферации эндотелия капилляров и фибробластов, которые стимулируют рост ткани через продукцию коллагена (Аничков, 1951). На третьи сутки пролиферирующий эпителий покрывал грануляционную ткань не полностью. На четвертые сутки эпидермис полностью закрывал раневую щель, формировался рубец с помощью рубцевой ткани. По истечении семи суток эксперимента рубца на коже животных было почти не заметно.

При нанесении на рану крыс лаксарана 1936 (0,06 г/кг) через сутки наблюдали, что края раны были узкими и на поверхности образовывался свежий сгусток крови, что свидетельствовало о дальнейшем заживлении раны. На третьи сутки эксперимента наблюдался процесс фиброплазии (заживление раны), на поверхности ранения проходил синтез коллагена, образовалась корочка. Отпадение корочки, наблюдали на четвертые сутки края раны, сблизились до полного контакта друг с другом, что обеспечило рубцевание раны. На седьмые сутки рубец слегка был заметен.

При нанесении на поверхность раны лаксарана Z в концентрации (0,06 г/кг) процесс ранозаживления значительно ускорялся, по сравнению с другими лаксаранами 1596 и 1936. Образование корочки на ране происходило уже на вторые сутки. К третьим суткам у крыс этой группы восстановление эпителия происходит интенсивнее, чем у крыс, раны которых обрабатывали лаксаранами 1596, 1936. Образование рубца происходило уже на третьи сутки, а к шестым суткам эксперимента рубец становился слегка заметным и не был заметен на 7 сутки.

При исследовании ранозаживляющих свойств пленки, содержащей лаксаран 1596 было показано, что образование корочки происходило на четвертые сутки эксперимента, при этом рубец образовывался на шестые и был заметен на седьмые сутки эксперимента. У животных, которым на поверхность ранения наносили плёнку, образованную на основе лаксарана 1936, морфологические изменения в области раны в ходе всего времени эксперимента были аналогичны таковым, как и у животных контрольной группы. При нанесении животным на область ранения плёнки, приготовленной на основании лаксарана Z, образование корочки происходило на третьи сутки, которая отпадала на пятые сутки; рубец был слегка заметен на седьмые сутки эксперимента.

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что нанесение на раны крыс лаксаранов способствует более быстрому их заживлению, по сравнению с контролем и пленками, в состав которых они входили.

Исследование антимикробной активности лаксаранов и плёнок, созданных на их основе

Антимикробную активность лаксаранов 1596, 1936, Z и пленок, созданных на основе данных лаксаранов с добавлением связующего агента и пластификатора (Бухарова, 2004), определяли методом диффузии в агар (Лабинская, 1978). Было показано, что лаксараны 1596, 1936 и Z обладают антимикробной активностью в отношении E. coli 01, S. aureus 209-P, P. aeruginosa АТСС 27533, C. albicans 130, которые, как известно из литературных источников (Шляпников, Рыбкин, 1999; Блатун, 2007), наиболее часто встречаются в ранах с первичным загрязнением. При исследовании антимикробной активности пленок, созданных на основе данных лаксаранов, было показано, что плёнки с лаксараном 1596 и лаксараном 1936 ингибировали рост всех взятых в опыт тест-культур. Пленка, в состав которой входил лаксаран Z, не обладала антимикробной активностью по отношению к изучаемым бактериям.

Влияние лаксаранов на выход готового продукта и структурно-механические, физико-химические, микробиологические, органолептические свойства сыровяленых колбас

Изучали влияние лаксаранов 1596, 1936, Z на качество сыровяленых колбас на примере сыровяленой колбасы «Русич». Было показано, что при определении выхода готового продукта в контрольном образце к 21 суткам созревания масса батона снижалась на 40 %, в то время как в образцах, содержащих лаксараны 1596, 1936, Z, потеря массы батонов уменьшилась на 52 %, 47 %, 57 %, соответственно. Снижение массы батона в сыровяленой колбасе свидетельствует о хорошем качестве продукта (Фатьянов, 2008). Содержание влаги и ВСС в контрольном образце были равны 31 % и 52 %, соответственно. Наименьшее содержание влаги и наибольшее содержание влагосвязывающей способности были в образце с лаксараном Z. В контрольном образце количество рН и активности воды было равно 5,58 и 0,85. В образцах содержащих либо лаксаран 1596, либо 1936, либо Z, рН равнялся 4,19; 4,18 и 4,00; активность воды - 0,75; 0,74 и 0,71, соответственно. Следует отметить, что значения показателя активности воды в сыровяленых колбасах ниже 0,86 в совокупности со значениями показателя рН ниже 5,2 гарантирует микробиологическую безопасность продукта при употреблении и хранении (Фатьянов, 2008). В процессе исследований было показано, что в контрольном образце к концу периода созревания количество молочнокислых микроорганизмов было больше, чем в начале созревания в 41 раз. В образце, содержащим лаксаран Z, к концу периода созревания количество молочнокислых микроорганизмов увеличилось в 397 раз, в отличие от образцов, содержащих лаксаран 1596 и лаксаран 1936, где количество молочнокислых бактерий к концу срока созревания возросло в 40 раз и 197 раз, соответственно. В процессе дальнейших исследований было показано, что в контрольном образце к концу созревания (21 сутки) количество E.coli, стафилококков, микроскопических грибов обнаружено не было. Добавление лаксаранов 1596, 1936 и Z в сыровяленые колбасы приводило к полному исчезновению E. coli, стафилококков уже на 14 сутки, микроскопических грибов на 7 сутки созревания, что говорит о более раннем подавлении санитарно-показательной микрофлоры. Наименьшее количество E. coli, стафилококков, микроскопических грибов наблюдали в сыровяленых колбасах, приготовленных с добавлением лаксарана Z в течение всего периода созревания (21 сутки). Возможно, это объясняется тем, что лаксаран Z в отличие от лаксаранов 1596 и 1936, способствует в большей степени снижению рН и активности воды в опытных образцах. Сальмонелл и протей во всех образцах и в контроле в течение всего процесса созревания (сушки) не обнаружено.

Лаксараны 1596, 1936 и Z улучшают и органолептические свойства сыровяленых колбас (аромат, текстуру, нежность, консистенцию, вкус).

Таким образом, лаксараны 1596, 1936, Z, как показали экспериментальные исследования, способствуют улучшению качества сыровяленых колбас, что открывает перспективы их использования в пищевой промышленности.

Выводы

1. Установлено, что экзополисахариды L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 (лаксаран 1596), L. delbrueckii B-1936 (лаксаран 1936) и L. delbrueckii ssp. bulgaricus (лаксаран Z) в концентрации 0,06 г/кг не являются токсичными для биотест-объектов C. steinii.

2. Выявлено влияние лаксаранов 1596, 1936, Z на микрофлору толстого кишечника белых крыс в норме и при стрессах (иммобилизационный, холодовой и этаноловый), увеличивая содержание молочнокислых бактерий и снижая присутствие энтеропатогенной кишечной палочки и стафилококков.

3. Обнаружено, что лаксараны 1596, 1936, Z оказывают влияние на фагоцитарную активность макрофагов при фагоцитозе S. aureus 209-P in vitro в концентрации 0,006 г/мл.

4. Впервые показано, что лаксараны 1596, 1936, Z в концентрации 0,006 г/мл in vitro обладают различной способностью к стимуляции синтеза провоспалительных цитокинов ИЛ-1б и ФНО-б альвеолярными и перитонеальными макрофагами мышей в процессе фагоцитоза бактерий.

5. Показано, что лаксараны 1596, 1936, Z способствуют более быстрому заживлению резаных ранений у экспериментальных животных (крыс), по сравнению с контролем. Лучший эффект был отмечен при обработке ран лаксараном Z.

6. Обнаружено, что лаксараны 1596, 1936, Z в концентрации 0,06 г/кг проявляют антимикробную активность in vitro в отношении некоторой сапрофитной микрофлоры (E. coli 01, S. aureus 209-P, P. aeruginosa ATСС, C. albicans 130).

7. Установлено, что лаксараны 1596, 1936, Z оказывают влияние на физико-химические, структурно-механические, микробиологические, органолептические свойства сыровяленых колбас. Способствуют улучшению их качества, открывая перспективы использования в пищевой (мясоперерабатывающей) промышленности.

лаксаран экзополисахарид стресс ранозаживляющий

Список работ, опубликованных на теме диссертации

1. Бактерицидные свойства гелей, созданных на основе экзополисахаридов бактерий / М.И. Правдивцева, Л.В. Карпунина, Е.В. Полукаров [и др.] // Успехи современного естествознания. 2009. № 4. С. 49.

2. Влияние лаксарана 1936 на микрофлору, содержащуюся в толстом отделе кишечника самок крыс в условиях холодового стресса / М.И. Правдивцева, Л.В. Карпунина, Е.В. Полукаров [и др.] // Успехи современного естествознания. 2009. №7. С.18.

3. Правдивцева М.И., Карпунина Л.В., Полукаров Е.В. Определение токсичности экзополисахаридов некоторых молочнокислых бактерий биопробой на инфузории колподы // Успехи современного естествознания. 2008. № 12. С.43.

4. Правдивцева М.И, Карпунина Л.В., Полукаров Е.В. Бактерицидные свойства гелей, созданных на основе экзополисахаридов лактобацилл // Материалы всероссийской науч.-практ. конф., посвященной 90-летию факультета (института) ветеринарной медицины. Саратов, 2009. С. 18 - 19.

5. Влияние лаксарана Z на микрофлору толстого отдела кишечника самок крыс в условиях иммобилизационного стресса / М.И. Правдивцева, Л.В. Карпунина, А.В. Нурмухамедов [и др.] // Успехи современного естествознания. 2009. № 8. С.101.

6. Ранозаживляющие свойства экзополисахаридов бактерий рода Lactobacillus / М.И. Правдивцева, Т.П. Кикалова., Е.В. Полукаров [и др.] // Вавиловские чтения - 2009: материалы междунар. науч.-практ. конф. Саратов, 2009. С. 292 - 293.

7. Изучение влияния экзополисахаридов молочнокислых бактерий на физико-химические и органолептические свойства сыровяленых колбас / М.И. Правдивцева, И.В. Мокрецов, Л.В. Карпунина [и др.] // Безопасность и качество товаров: материалы VI междунар. науч.-практ. конф. Саратов, 2010. С. 126 - 128.

8. Правдивцева М.И., Полукаров Е.В., Карпунина Л.В. Фунгицидные свойства гелей, созданных на основе экзополисахаридов бактерий // Современные наукоемкие технологии. 2010. №10. С.74.

9. Правдивцева М.И, Карпунина Л.В., Мокрецов И.В. Изучение влияния экзополисахаридов молочнокислых бактерий на микробиологические свойства сыровяленых колбас // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. 2010. № 8. С.23 - 27.

10. Изучение фагоцитарной и цитокиновой активности макрофагов при действии экзополисахаридов бактерий рода Lactobacillus / М.И. Правдивцева, Е.А. Горельникова, О.В. Абросимова [и др.] // Биологически активные вещества: прошлое, настоящее, будущее: Всероссийский симпозиум с междунар. участием. Москва, 2011. С. 94.

11. Правдивцева М.И., Горельникова Е.А., Карпунина Л.В. Влияние экзополисахаридов лактобацилл на синтез ИЛ-1б и ФНО-б макрофагами мышей при фагоцитозе Staphylococcus aureus // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. 2011. № 4. С.14 - 16.

12. Оценка влияния экзополисахаридов молочно-кислых бактерий рода Lactobacillus на фагоцитарную активность макрофагов белых мышей / М.И. Правдивцева, Е.А. Горельникова, О.В. Абросимова [и др.] // Известия Самарского научного центра РАН. 2011. Т. 13, № 5. С. 276 - 278.

13. Правдивцева М.И., Карпунина Л.В. Биологическая активность экзополисахаридов лактобацилл // Химия и биохимия углеводов: IV Всеросийская школа-конференция, 14-16 сентября 2011. Саратов, 2011. С. 69.

14. Правдивцева М.И., Карпунина Л.В., Сметанина М.Д. Влияние экзополисахаридов лактобацилл на микрофлору толстого отдела кишечника самок крыс при различных видах стресса // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия Химия. Биология. Экология. 2011. Т. 11, Вып. 2. С. 89 - 94.

15. Правдивцева М.И., Карпунина Л.В., Бухарова Е.Н. Влияние лаксаранов на процесс заживления ран у животных // Аграрная наука в XXI веке; проблемы и перспективы: сборник науч. статей VI всероссийской науч. - практ. конф. Саратов, 2012. Ч.II. С. 82 - 84.

16. Горельникова Е.А., Правдивцева М.И., Карпунина Л.В. Синтез цитокинов макрофагами мышей на фоне действия лаксарана 1596 // Вавиловские чтения - 2010: материалы междунар. науч.-практ. конф. Саратов, 2010. С. 136.

17. Биологическая активность экзополисахаридов бактерий и перспективы применения / Л.В. Карпунина, Е.Н. Бухарова, А.В. Нурмухамбетов, М.И. Правдивцева [и др.] // Настоящее и будущее биотехнологии в решении проблем экологии, медицины, сельского, лесного хозяйства и промышленности: сборник науч. тр. науч. - практ. семинара с междунар. участием. Ульяновск, 2011. С. 110 - 111.

Размещено на Allbest.ru