Биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и разработка биотехнологических параметров его культивирования

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и разработка биотехнологических параметров его культивирования

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Симоненко Наталья Валерьевна

Саратов 2011

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Саратовском научно-исследовательском ветеринарном институте Россельхозакадмии

Научный руководитель доктор ветеринарных наук

Ласкавый Владислав Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент

Гулий Ольга Ивановна,

доктор биологических наук, профессор

Хайруллин Рамиль Магзинурович

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Защита диссертации состоится «16» июня 2011 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова».

Автореферат диссертации разослан «11» мая 2011 г. и размещен на сайте: www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу:410012, г. Саратов, Театральная пл.1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Трансмиссивный (вирусный) гастроэнтерит свиней (ТГЭС) - остро протекающая, высоко контагиозная болезнь, которая поражает животных всех возрастных групп, но главным образом поросят до 3-х месячного возраста и наносит значительный экономический ущерб промышленному свиноводству (Ястребов, 1999; Сергеев, 2007; Lanteir et al., 1990; Saif, 1999).

Определённые успехи в борьбе с ТГЭС связаны с внедрением в практику живых культуральных моно- и ассоциированных вакцин, результативность применения которых в крупных свинокомплексах, как правило, недостаточно эффективна, что связано с существенными нарушениями технологии содержания и кормления, несоблюдением обязательных ветеринарно-санитарных требований, перегруппировкой и завозом из отдалённых регионов России и зарубежных стран животных, хронически инфицированных вирусами и бактериями с различным уровнем патогенности (Ласкавый, 1998; Алипер, 2002; Красочко и др., 2005; Ласкавый и др., 2007).

За последние 10-15 лет в мире резко возрос объем научных разработок, связанных с более широким применением перевиваемых линий клеток (ПЛК) в качестве субстрата для производства иммунобиологических препаратов (ИБП). Важное место в решении задач применения ПЛК в биотехнологии занимают вопросы выбора, контроля и стандартизации свойств, совершенствования технологии культивирования ПЛК, создания рабочих и посевных банков клеток в жидком азоте, поиска и апробации новых более эффективных антибактериальных препаратов, а также проблем контаминации и деконтаминации культур клеток и ИБП от бактерий и микоплазм (Тарасов, 1990; Ночевный, 2002; Герасимов, 2006).

Исследования, направленные на поиск, паспортизацию и стандартизацию ПЛК, предназначенных для получения вируса ТГЭС с выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, а также разработка более стабильного по генетическим и иммунобиологическим показателям авирулентного штамма вируса ТГЭС, пригодного для профилактики данного заболевания у свиней разных половозрастных групп, является актуальной задачей на современном этапе и имеет большое практическое значение.

Цель работы - изучение биологических свойств штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, оптимизация условий его культивирования в перевиваемой линии клеток и обоснование использования в качестве потенциального вакцинного препарата.

Для достижения поставленной цели нами были определены следующие задачи:

1. Провести селекцию штамма ВН-96 вируса ТГЭС и изучить его физико-химические свойства.

2. Оценить в сравнительном аспекте чувствительности первичной и перевиваемых тест-культур клеток к вирусу ТГЭС; провести отбор наиболее перспективной ПЛК в качестве субстрата для серийного производства вирусного антигена.

3. Подобрать средства и методы деконтаминации тест-культур с использованием моно- и комплексных препаратов на основе фторхинолонов и поверхностно активных веществ;

4. Осуществить стандартизацию и паспортизацию культуральной модели в качестве субстрата для получения штамма ВН-96 вируса ТГЭС;

5. Определить оптимальные условия культивирования штамма ВН-96 вируса ТГЭС стационарным и роллерным методами; оптимизация условий стабилизации штамма ВН-96 вируса ТГЭС;

6. Изучить антигенные и иммуногенные свойства штамма ВН-96 вируса ТГЭС; обосновать перспективность его использования в качестве вакцинного препарата.

Научная новизна. Впервые выделен и изучен штамм ВН-96 вируса ТГЭС, определены оптимальные условия его культивирования и изучена бляшкообразующая способность. На основании изучения антигенных и иммуногенных свойств обоснована перспективность использования штамма ВН-96 вируса ТГЭС в качестве вакцинного препарата.

Впервые доказана возможность и перспективность использования метода проточной цитометрии для экспресс-оценки культуральных, цитометрических и морфологических показателей, а также выбора наиболее перспективной культуральной модели для репродукции вируса ТГЭС.

Практическая значимость. Разработаны методы концентрирования и очистки культурального вируса ТГЭС штамм ВН-96. Апробирован эффективный способ деконтаминации линии клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) при помощи моно- и комбинации препаратов на основе ЭнрофлонаК и поверхностно-активных веществ. Определена оптимальная схема деконтаминации ПЛК сублинии СПЭВ-б от микоплазм. Подготовлены для практического использования очищенные от микоплазм-контаминантов эталонный и рабочий криобанки ПЛК сублинии клеток СПЭВ-б со стабильными культуральными и цитометрическими показателями. Определены оптимальные условия культивирования вируса ТГЭС в ПЛК сублинии СПЭВ-б стационарным и роллерным методами. Предложена защитная среда оптимального состава, разработаны режимы лиофилизации и условия хранения сухих форм культурального вируса ТГЭС.

По материалам диссертационной работы опубликованы «Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов и производства иммунобиологических препаратов ветеринарного назначения» (в соавторстве с Л. П. Дьяконовым, В. П. Уласовым, Б. В. Соловьевым, 2007), утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН А.М. Смирновым от 19.10.2007г.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основании определения размеров и морфологии частиц, изучения физико-химических свойств, электрофоретической подвижности и молекулярной массы структурных белков, антигенных и иммуногенных свойств подтверждена подлинность и специфичность штамма ВН-96 вируса ТГЭС.

2. Перевиваемая линия клеток СПЭВ-б наиболее чувствительна к штамму ВН-96 вируса ТГЭС.

3. Эффективная деконтаминация линии клеток почки эмбриона свиньи от микоплазменной инфекции достигается при использовании энрофлона-К и комбинаций препаратов норфлоксацина с этонием и энрофлона-К с твином-80.

4. Оптимальными условиями для выращивания линии клеток СПЭВ-б и репродукции штамма ВН-96 вируса ТГЭС являются: посевная концентрация клеток 150 тыс./мл, заражение в суспензию в дозе 5,0-6,0 lg ТЦД₅₀, время адсорбции вируса клетками не менее 60 минут при 37єС, применение фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота и культивирование вируса роллерным методом.

5. Для замораживания и лиофилизации штамма ВН-96 вируса ТГЭС в биотехнологическом процессе эффективно использование защитной среды ВГНКИ-3.

Работа выполнена в лаборатории бактериальных и вирусных инфекций ГНУ Саратовского научно исследовательского ветеринарного института Россельхозакадемии по научно-исследовательской теме: «Усовершенствовать средства и методы защиты поросят от вирусных инфекций» (№ рег. ВНТИЦ 01200607301) в рамках программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на: Международной научно-производственной конференции «Экологобиологические проблемы повышения продуктивного долголетия животных» (Екатеринбург, 2006 г.); Международной научно-практической конференции «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы, задачи и пути научного обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК» (Новочеркасск, 2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы, методы, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, практических предложений, списка литературы. Список литературы включает 218 источников, в том числе 136 отечественных и 82 зарубежных. Работа иллюстрирована 27 таблицами и 12 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

В работе использовали: штаммы вируса ТГЭС: штамм «ТО₃₆SD₁₉₂» (Япония) с титром 8,0 lgТЦД₅₀/мл, полученный из коллекции микроорганизмов Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии (ВИЭВ) в 1973 г; штамм «РИМС», полученный из сухой лиофилизированной вакцины РИМС (ГДР); штамм ВН-96 с титром 6,5-7,5 lgТЦД₅₀/мл выделен из вакцинного штамма «РИМС» (методом предельных разведений с последующим 5-кратным клонированием микробляшек) на перевиваемой культуре СПЭВ (крупнобляшечный вариант).

В качестве материала для исследований использовали:

- трофоварианты линии клеток почки эмбриона свиньи, полученные из Всероссийского государственного НИИ контроля, стандартизации и сертификации (ВГНКИ) ветпрепаратов (СПЭВ, 305 пассаж) и из Всероссийского научно-иследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВ и М) (СПЭВ, 184 пассаж), которые пассировали стационарным и роллерным методами в соответствии с требованиями паспорта. Для различия трофовариантов линии клеток СПЭВ, сохраняемые в ВГНКИ ветпрепаратов (305 пассаж), были обозначены как СПЭВ-а, а линии клеток СПЭВ, сохраняемые в ВНИИВВ и М (184 пассаж), как СПЭВ-б. Эффективность пассирования перевиваемых линий оценивали по урожаю клеток (УК), индексу пролиферации (ИП) и морфологии клеток в культуре;

- питательные среды: «199», «Игла МЕМ», «Игла ДМЕМ», 0, 2% раствор версена, фосфатно-буферный раствор (ФБР) с рН 7,2-7,4; 0,25% раствор трипсина (ФС 42-3321-96); L-глутамин сухой (ТУ 6-09-16-1426-87); сыворотки крови (СК) плодов коров (ФС 42-3368-97) и крупного рогатого скота (ВФС 42-268ВС-90) в концентрации 5-10%;

- фторхинолоны (ФХЛ): в качестве антимикоплазменных средств испытывали энрофлон-К (ТУ 934342-016-47611900-00), изготовленный на основе энрофлоксацина в дозе 10 мкг/мл и 2 комплексных препаратов на основе норфлоксацина (50 мкг/мл) и энрофлона-К (35 мкг/мл) с поверхностно-активными веществами (ПАВ) - этонием и Тween-80 (SERVA 374775) в дозе 7 мкг/мл.

При проведении экспериментальных исследований использовали лабораторных и сельскохозяйственных животных: 16 кроликов (2-2,5 кг), 28 белых крыс (170-200 г), 35 новорожденных поросят, 50 свиней разных возрастных групп.

Индикацию микоплазм в клеточных культурах проводили микробиологическим методом в соответствии с Методическими рекомендациями по выделению, культивированию и идентификации микоплазм, ахолеоплазм и уреаплазм (1983), а также цитохимическим методом (ЦХМ) контроля, основанном на окраске ДНК клеток микоплазм флюорохромами: оливомицином или Hoechst-33258 (Методические рекомендаций по способу выявления микоплазм в культурах перевиваемых клеток, 1983). Индикацию микоплазм культур клеток в полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили на базе ВГНКИ ветпрепаратов совместно с д.б.н. И.Л. Обуховым в соответствии с требованиями Методических указаний по диагностике возбудителей микоплазмоза методом полимеразной цепной реакции (1997).

Для очистки ПЛК от микоплазменной инфекции использовали различные препараты на основе ФХЛ. Схема деконтаминации тест-культур предусматривала внесение антимикоплазменных препаратов в суспензию изолированных клеток в течение 10 пассажей. Результативность деконтаминации ПЛК от микоплазм оценивали по ростовым свойствам, морфологии клеток в культуре, индексу пролиферации (ИП) и результатам цитохимического метода (ЦХМ) и полимеразно цепной реакции.

Чувствительность деконтаминированных и исходных (контроль) линий клеток СПЭВ к вирусу ТГЭС оценивали в течение 3 пассажей. Доза и способ заражения (в суспензию клеток и на монослой), условия и длительность культивирования вируса были оптимальными. Уровень накопления вируса оценивали микрометодом на плашках и выражали в lg ТЦД₅₀/мл. Активность вируса оценивали по методу Рида и Менча.

ПЛК сублиний СПЭВ-а и СПЭВ-б выращивали в стационарных условиях на покровных стеклах в пробирках в соответствии с требованиями паспорта. Цитометрическое исследование проводили на лазерном проточном цитофлуориметре-сортере EPICS^R «Elite» (Coulter, USA), оборудованном аргоновым лазером CYONICS (Uniphase, USA) с длиной волны возбуждения 488 нм и мощностью луча 15 mBт. Полученные гистограммы подвергали математической обработке с использованием программ EXPO32 (Beckman-Coulter, USA) и Multi Cyce (Phoenix Flow Systems, USA).

Тест-культуры инфицировали штаммом ВН-96 вируса ТГЭС в дозе 4,0 lg ТЦД₅₀ через 72 часа культивирования. Фиксацию и окрашивание опытных и контрольных культур осуществляли через 3, 4 и 5 суток после заражения. Покровные стекла извлекали из пробирок, отмывали физиологическим раствором, фиксировали в растворе Буэна два часа при комнатной температуре, отмывали 70%-ным этанолом в течение суток и окрашивали смесью азура с эозином по Романовскому. Препараты изучали в световом микроскопе и фотографировали при увеличении 32Ч10 с зеленым фильтром на пленку «Микрат-300».

Для изучения бляшкообразующей способности штамма ВН-96 по методу С. Д. Дальбекко и А. М. Фоггота (1954) использовали перевиваемую линию клеток СПЭВ, выращенной в пластиковых матрасах объемом 25 см². Наблюдение за появлением бляшек осуществляли ежедневно с 3 по 7 сутки. Подсчет, оценку величины и формы бляшек проводили на светлом фоне. Электронно-микроскопический анализ вируса ТГЭС проводили по методике А.П. Пономарева с помощью электронного микроскопа JEM-100В (Jeol, Япония) при увеличении Ч 245000.

Концентрирование культурального вируса ТГЭС проводили центрифугированием в градиенте сахарозы по методу C.M. Horzinek (1982). Полученную суспензию очищенного вируса использовали для анализа белков при помощи электрофореза в додецилсульфат натрия полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ) при постоянном напряжении 80В в течение 20 мин и в дальнейшем при напряжении 200В в течение 3-х часов. Результаты разделения протеинов на электрофореграмме обрабатывали с помощью программы Gel-Imager, пакета программы Gel explorer версия 1,0 (ДНК-технология, Москва).

Оценку идентичности генома вируса ТГЭС из очищенного и сконцентрированного материала проводили с помощью ПЦР. Выделяли РНК вируса ТГЭС с использованием коммерческого набора с суспензионным силикатным сорбентом NucleoS+TM (Биоком, г. Москва) согласно инструкции производства препарата. Результаты ПЦР документировали на трансиллюминаторе, оснащенным видеосистемой DNA-analyzer.

Лиофилизацию штамма ВН-96 вируса ТГЭС 5-го пассажа с активностью 6,5 lgТЦД₅₀/мл проводили в ампулах ШПВ-6 в «Лаборатории инструментальных методов контроля» ФГУ ВГНКИ на установке LIOVAK GT-2. В качестве защитных сред (ЗС) использовали обезжиренное молоко (ОМ), среду ВГНКИ-3 и среду ЛС-18. В контроле лиофилизацию штамма ВН-96 вируса ТГЭС проводили без стабилизатора.

Для иммунизации крыс и кроликов использовали штаммы вируса ТГЭС ВН-96 и «ТО₃₆SD₁₉₂» и инактивированную вакцину ЧССР. Активность сывороток крови оценивали в реакции нейтрализации (РМН), проводимой по Методике выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней в реакции нейтрализации на микропанелях (2000).

Проверку антигенной и биологической активности штамма ВН-96 вируса ТГЭС проводили на 12 подсвинках, серонегативных по отношению к ТГЭС. Перед введением и через 22 дня после инъекции вируса сыворотки крови животных исследовали в РМН на наличие антител к вирусу ТГЭС. За животными проводили ежедневное наблюдение, а первые 3 дня после введения вируса проводили термометрию. Исследование биологической активности и стабильности штамма ВН-96 вируса ТГЭС проводили путем титрования в РМН и последовательного 7-ми кратного пассирования на перевиваемой линии клеток СПЭВ. в культуре клеток СПЭВ. Исходный вирус и культуры 3, 5 и 7 пассажей титровали в планшетах в 3-кратной повторности.

Достоверность результатов подтверждали путём статистической обработки результатов по общепринятым методикам и определения различий средних значений с помощью критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса ТГЭС

На предварительном этапе нашей работы сравнительное изучение пригодности линии клеток СПЭВ для контроля специфической активности вируса ТГЭС проводилось с использованием штамма «РИМС». Активность образцов этого штамма вируса ТГЭС по ЦПД и методом бляшек была сопоставимой и достигала, соответственно, 6,22±0,07 lg ТЦД₅₀/мл и 6,06±0,23Ч10⁶ БОЭ/мл. Под агаровым покрытием клетки монослоя равномерно окрашивались и сохраняли жизнеспособность в течение 8-9 суток, затем наблюдался их частичный лизис, достигающий максимума к 10-12 дню после заражения. Бляшки округлой формы различного размера выявлялись с 4-суток наблюдения и достигали максимальной величины на 6-7 сутки (рис. 1).

Рис. 1. Бляшки, образуемые в монослое ПЛК СПЭВ штаммом ВН-96 вируса ТГЭС: К - контроль ПЛК, 4,5-опытные образцы ПЛК

Сравнительное изучение физико-химических свойств штамма ВН-96 вируса ТГЭС

Для электронно-микроскопического анализа выделенного варианта ВН-96 вируса ТГЭС использовали метод негативного контрастирования. Установлен диаметр вирионов на уровне 144,8±7,2 нм. При измерении вирионов в окрашенных фосфо-вольфрамовой кислотой препаратах были обнаружены плеоморфные, оболочечные вирионы со слоем булавовидных отростков (пепломеров) в виде короны длиной 12-20 нм. В суспензии присутствовали преимущественно неповрежденные вирусные частицы (более 90%). Количество дефектных частиц было невелико (рис.2)..

Рис. 2. Электронная микрофотография сконцентрированного препарата штамма ВН-96 вируса ТГЭС ( Ч 245000)

Сравнительный анализ размеров и морфологической характеристики частиц свидетельствовал о том, что они соответствуют вирусу рода Coronavirus животных. Нами был проведен анализ структурных белков штамма ВН-96 вируса ТГЭС методом электрофореза в ДСН-ПААГе и получена электрофореграмма с достаточным разделением белковых фракций маркера и вируса ТГЭС, что позволило сделать вывод о достаточно высокой концентрации вирусных белков в пробе после стандартной окраски геля красителем КУМАССИ-G850. Анализ молекулярных масс выявленных белков показал, что они специфичны для вируса ТГЭС.

Были выявлены: белок P (крупный поверхностный гликопротеин S) с молекулярной массой 170-200 кДа; белок N (основной нуклеокапсидный протеин) с молекулярной массой 50-62 кДа и белок М (матриксный мембранный протеин) с молекулярной массой 25-35 кДа (рис. 3).

В треке вирусных протеинов отмечено наличие фракции 15-17 кДа. По данным Wesley R.D. и Woods R.D. (1986) такую же величину имеет негликолизируемый протеин 17кДа (17К), который принадлежит структурному белку вируса ТГЭС. Следовательно, было достигнуто разделение всех известных белков вируса ТГЭС. Для идентификации нуклеиновой кислоты вируса ТГЭС нами была испытана технология изготовления тест-системы для ПЦР с использованием специфического праймера - консервативного участка генома S вируса ТГЭС, содержащего 886 пар нуклеотидов (пн).

Рис. 3. Электрофореграмма структурных белков очищенного и сконцентрированного препарата штамма ВН-96 вируса ТГЭС

Примечание: ВТГС - трек структурных белков ТГЭС, Маркер - трек молекулярного белкового маркера“Precision plus protein standards AllBlue”.

Результаты испытаний показали, что эта методика позволяет достоверно судить о наличии в концентрированном и очищенном образце генома вируса ТГЭС. На полученной электрофореграмме продуктов ПЦР в агарозном геле было достигнуто достаточно высокое разделение ДНК-маркера (DNA-Ladder 100) и комплементарной ДНК (кДНК) антигена вируса ТГЭС. В треках вирусной нуклеиновой кислоты выявлена единственная характерная фракция специфического продукта ПЦР (кДНК величиной 886 пн), свидетельствующая о наличии генома вируса ТГЭС в исследованной пробе (рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграмма продуктов ПЦР кДНК, полученной из концентрированного препарата штамма ВН-96 вируса ТГЭС

Примечание: К (-) - отрицательный контроль ПЦР; ВТГС - трек продуктов ПЦР кДНК препарата концентрированного ТГЭС; М - трек молекулярного ДНК-маркера “DNA-Ladder 100”.

Сравнительная оценка чувствительности перевиваемых сублиний клеток почки эмбриона свиньи к вирусу ТГЭС

Нами были изучены на пригодность для использования в биотехнологии получения антигенного препарата вируса ТГЭС ПЛК сублиний СПЭВ-а и СПЭВ-б. Установлено, что клетки сублинии СПЭВ-б существенно отличаются in-vitro от сублинии СПЭВ-а по уровню адгезии, морфологическим показателям и ростовым свойствам. Клетки сублинии СПЭВ-а были зернистыми, рисунок монослоя слабо выражен, к концу периода роста в культуре отмечали дегенеративные изменения, а в культуральной жидкости - округлые апоптозные тельца, количество которых в процессе длительного культивирования возрастало.

Клетки сублинии СПЭВ-б, после хранения в жидком азоте в течение 30 лет, имели, по тесту витального окрашивания трипановым синим, жизнеспособность на уровне 82-86%,. При этом они сохранили свои адгезивные свойства и, в течение трех пассажей (общий 178-ой пассаж), полностью восстановили ростовые характеристики. На третьи сутки культивирования формировался конфлюэнтный клеточный монослой, цитоплазма клеток была мелкозернистая и вакуолизирована незначительно, ядерный хроматин равномерно распределен по всей кариоплазме. Изредка в монослое встречались гигантские и двуядерные клетки, местами отмечены интенсивно окрашенные участки монослоя, состоящие из клеток, растущих в несколько слоев (фокусы многослойного роста). На фоне нормальных митозов достаточно часто встречались неправильные - с отставанием хромосом в метафазе - 3-х и 4-х полюсные митозы.

При заражении ПЛК СПЭВ штаммом ВН-96 вируса ТГЭС было установлено, что более высокочувствительной тест-культурой является сублиния клеток СПЭВ-б, в которой вирус репродуцируется более интенсивно и накапливается в максимальных титрах 7,0-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. Сублиния клеток СПЭВ-а оказалась менее чувствительной культуральной моделью для размножения вируса, т.к. накопление вируса в пассажах было на 0,5 lg ТЦД₅₀/мл ниже и не превышало 7,0 lg ТЦД₅₀/мл.

Стандартизация перевиваемых сублиний клеток СПЭВ - субстратов для производства штамма ВН-96 вируса ТГЭС

В процессе биотехнологического производства антигена вируса очень важен этап контроля ПЛК на микоплазменную контаминацию. В нашей работе для индикации микоплазм в культурах сублиний клеток СПЭВ-а и СПЭВ-б параллельно использовали микробиологический и цитохимический методы контроля, а также ПЦР.Анализ полученных результатов показал, что микоплазменная инфекция сублиний клеток СПЭВ установлена в обеих тест-культурах как в ПЦР, так и ЦХМ, который пригоден для предварительного контроля и оценки уровня инфицированности клеточных культур микоплазмами. Микробиологический метод контроля оказался не эффективным (табл. 1).

селекция штамм вирус

Таблица 1- Сравнительная оценка чувствительности методов индикации микоплазм - контаминантов в первичной и перевиваемых культурах клеток

Наименование культуральных моделей	Шифр культур	Результаты индикации микоплазм
		Методы контроля
		ПЦР	ЦХМ	ММ
Перевиваемые сублинии клеток почки эмбриона свиньи	СПЭВ-а	+	+	-
	СПЭВ-б	+	+	-
Первичная культура клеток почек эмбрионов свиньи	ПЭС	-	-	-

Примечание: (-) - отрицательный результат; (+) - положительный результат контроля.

Далее были решены вопросы деконтаминации сублиний клеток СПЭВ от микоплазм-контаминантов при помощи моно- и комплексных препаратов на основе фторхинолонов. Установлено, что энрофлон-К в оптимальной дозе является достаточно активным в отношении микоплазм-контаминантов и умеренно-токсичным для сублиний клеток СПЭВ. Применение препарата по методу Mowles (1988) в течение 10 пассажей позволило очистить культуры клеток от микоплазменной инфекции благодаря оптимальному соотношению дозы ФХЛ, концентрации клеток и уровня инфицированности микоплазмами клеток в культурах.

Комбинации препаратов на основе фторхинолонов и ПАВ также характеризовались выраженными антимикоплазменными свойствами и обеспечили деконтаминацию сублинии клеток СПЭВ-б от контаминанта в течение первых 5 пассажей.

Препарат на основе норфлоксацина (50 мкг/мл) и этония (7,0) даже в более высокой концентрации оказался менее токсичным и вызывал лишь незначительные цитоморфологические изменения сублинии клеток СПЭВ-б, а последующее восстановление культуральных и морфологических показателей происходило в более короткие сроки (рис. 5).

Рис. 5. Перевиваемая линия клеток СПЭВ: а - чистая культура СПЭВ; б - разрушение культуры СПЭВ микоплазмами (начальная стадия), появление «окон» по стрелке; в - инфицированная микоплазмами культура СПЭВ; г - культура СПЭВ после деконтаминации Энрофлоном-К

Последующее 10-ти кратное пассирование культуры клеток с контрольным набором антибиотиков не изменило положительного результата. Достоверность деконтаминации образцов субкультур СПЭВ была подтверждена ЦХМ и в ПЦР.

Свободные от микоплазм-контаминантов сублинии клеток СПЭВ-а и СПЭВ-б обладали выраженными ростовыми свойствами и в процессе серийного пассирования сохраняли исходную морфологическую структуру монослоя без признаков дегенерации клеток в культуре. Деконтаминированные от микоплазменной инфекции культуральные модели были размножены в стационарных условиях в соответствии с требованиями паспорта. Повторный контроль в ПЦР не выявил микоплазменной инфекции в образцах деконтаминированных сублиний клеток, сохраняемых в банке в жидком азоте.

Для анализа и стандартизации наиболее перспективных для практики линий клеток ряд авторов рекомендовали метод проточной цитометрии (ПЦ) (Полетаев, 1989; Ночевный и др. 2003). В нашей работе была проведена оценка пригодности и перспективности использования ПЦ для анализа трофовариантов линий клеток СПЭВ-а и СПЭВ-б по следующим показателям: размерам клеток, гранулярности, распределению ДНК по фазам клеточного цикла и запрограммированной клеточной гибели - апоптозу.

Анализ клеток СПЭВ-а и СПЭВ-б с использованием малоугольного и 90є светорассеивания показал, что исходные образцы суспензий содержат соответственно 42,8 и 52,65 % пролиферирующих клеток, а также конгломераты, состоящие из 2-3 и более клеток. Отмечено также, что трофоварианты линии клеток СПЭВ-а, прошедшие дополнительно 111 пассажей, увеличились в среднем на 15% и достигли среднестатических размеров 18,87±2,11 мкм. В тоже время клетки линии СПЭВ-б, сохраняемые в криобанке с 1972 г., состояли из прозрачных, мелкозернистых, эпителиоподобных клеток размером не более 15,0±2,50 мкм (табл. 2).

Таблица 2 - Сравнительная характеристика культуральных и цитометрических показателей трофовариантов ПЛК СПЭВ

Показатели	Значение показателей
	Наименование тест-культур
	СПЭВ - а	СПЭВ - б
Источник получения	ВГНКИ	ВНИИВВ и М

Культуральные свойства

Номер пассажа	305	184
Ростовая питательная среда	«Игла МЕМ» (10% сыворотки крови к. р. С.)
Индекс пролиферации (ИП).	3 - 5	4 - 6
Контаминация микоплазмами	-	-

Цитометрические показатели

Размеры клеток, мкм	18,87 ± 2,11	15,86 ± 2,50
Гранулярность (МЕАМ)	461	379
Апоптоз, %	41,8	3,6
Фазы клеточного цикла	S G2/G1 S+G2+M,%	22,7 1,945 24,0	3,3 1,917 10,3
	Показатели	PC %	CV	PC %	CV
	G1+GO G2+M	76,0 1,3	6,6 3,5	89,7 7,0	4,9 5,1

По показателю гранулярности исследуемые сублинии клеток СПЭВ заметно отличаются друг от друга, что подтверждают показатели МЕАМ для клеток сублинии СПЭВ-а на уровне 461 и для сублинии СПЭВ-б в пределах 379. Следует также отметить, что увеличение размеров и гранулярности клеток сублинии СПЭВ-а происходит параллельно в результате неадекватных условий и длительности пассирования клеток in-vitro.

Результаты сравнительного изучения распределения ДНК по фазам клеточного цикла ПЛК СПЭВ, прошедших различное количество пассажей, показали, что культура СПЭВ-б оказалась более перспективной для практики, чем сублиния СПЭВ-а. Это заключение обосновано тем, что клетки СПЭВ-б интенсивно пролиферируют (ИП4-6) in vitro, а показатель G2/G1 равный 1,917 характерен для нормально растущей культуры и указывает на отсутствие в популяции аномальных клеток с измененным количеством ДНК. Анализ гистограмм распределения клеток в зависимости от содержания ДНК показал, что для линий клеток СПЭВ-б показатель апоптоза был в 11,6 раза ниже, чем в культуре клеток СПЭВ-а и не превышал 3,6%.

Полученные данные, а также высокие ростовые свойства и удовлетворительные показатели клеточного цикла дают основание рекомендовать в качестве наиболее перспективного клеточного субстрата ПЛК СПЭВ-б, как для производства антигена, так и для контроля активности вируса ТГЭС. Напротив, длительное пассирование сублинии клеток СПЭВ-а и неудовлетворительные показатели клеточного цикла привели к значительному приросту (41,8%) апоптотических клеток. Эти факты говорят о старении и практической непригодности данной культуральной модели.

Таким образом, в результате исследований в качестве тканевого субстрата нами предложена перевиваемая сублиния клеток СПЭВ-б, характеризующаяся высоким ростовым потенциалом, оптимальными показателями ПЦ, нормальной морфологией и высокой чувствительностью к вирусу ТГЭС.Экспериментально подтверждена коррелятивная зависимость величины апоптоза и качества тест-культуры.

Этот факт указывает на возможность и перспективность использования достаточно экономичного метода ПЦ для экспресс-оценки, выбора и стандартизации образцов ПЛК гомологичного вида, но сохраняемых в российских и международных криобанках, а также позволяет рассматривать апоптоз в качестве объективного, практически значимого показателя, при выборе наиболее перспективного клеточного субстрата, отвечающего требованиям ВОЗ, как для целей диагностики, так и производства вакцин.

Оптимизация условий культивирования вируса ТГЭС в перевиваемой сублинии клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ-б

На следующем этапе работы была решена задача разработки оптимальных условий культивирования вируса ТГЭС штамма ВН-96 и штамма ТО₃₆SD₁₉₂ в стационарных и роллерных культурах клеток СПЭВ в зависимости от факторов внешней среды.

Анализ полученных данных показал, что для получения максимальных титров штамма ВН-96 вируса ТГЭС оптимальными являются значения следующих факторов: посевная концентрация клеток 150 тыс./мл, заражение в суспензию в дозе 5,0-6,0 lg ТЦД₅₀, время адсорбции вируса клетками не менее 60 минут при 37єС, применение фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота и культивирование вируса роллерным методом.Эти показатели являются наиболее существенными, взаимозависимыми и определяющими, в итоге, уровень накопления вируса ТГЭС. В указанных условиях накопление штамма ВН-96 вируса ТГЭС достигал 6,5-7,5 и даже 8,0 lg ТЦД₅₀/мл, что было подтверждено в экспериментальных условиях и, в последующем, в условиях производства (табл. 3).

Таблица 3 - Влияние дозы заражения на уровень накопления штамма ВН-96 вируса ТГЭС в сублинии клеток СПЭВ-б

Доза заражения, lg ТЦД50	Время адсорбции, мин.	Накопление вируса, lg ТЦД50/мл
		Срок культивирования, сут.
		3	4	5	6	7
3,0	60	1,89±0,2	3,11±0,2	3,89±0,2	4,61±0,1	3,56±0,1
4,0		5,0±0,3	5,56±0,1	6,0±0,3 *	5,28±0,3	4,0±0,3
5,0		5,39±0,4	7,0±0,3 *	6,78±0,2	5,33±0,3	5,0±0,3
6,0		5,89±0,2	7,0±0,3 *	6,89±0,4	5,89±0,2	5,0±0,3

Примечание: * - срок максимального накопления вируса (сутки).

Серийное пассирование штамма ВН-96 вируса ТГЭС в перевиваемой сублинии клеток СПЭВ-б

Возможность и перспективность длительного пассирования штамма ВН-96 вируса ТГЭ в сублинии клеток СПЭВ-б оценивали в оптимальных условиях и сроках культивирования, соответствующих ранее установленным показателям. Полученные данные свидетельствуют о том, что сублиния клеток СПЭВ-б является достаточно чувствительным субстратом для серийного пассирования штамма ВН-96 вируса ТГЭ свиней. Параллельно оценивали характер цитоморфологических изменений в тест-культуре под воздействием вируса ТГЭС. Контрольная монослойная сублиния клеток СПЭВ-б была представлена прозрачными, мелкозернистыми, эпителиоподобными клетками полигональной формы, которые сохранялись без смены ростовой среды в течение 6-8 суток. Урожай клеток в монослойной культуре в 1 л матрасе достигал 35-40 млн.

В инфицированной сублинии клеток СПЭВ-б дегенеративные изменения под воздействием штамма ВН-96 обнаруживались через 36-48 часов после заражения. На 3-4 сутки наблюдения отмечается массовое округление клеток (круглоклеточная дегенерация) и их частичное отслоение от субстрата с образованием «окон». Ряд клеточных элементов сливаются в многоядерные симпласты.

Таким образом, в результате проведенных исследований для серийного пассирования вируса ТГЭС была предложена высокочувствительная, неконтаминированная сублиния клеток СПЭВ-б, обеспечивающая накопление штамма ВН-96 на уровне 7,0-7,33 lg ТЦД₅₀ в течение 10 пассажей.

Опытно-промышленное производство штамма ВН-96 вируса ТГЭС

Производство иммунобиологических препаратов требует выпуска больших объемов активных антигенов с минимальными затратами труда, средств и времени. Решение данной проблемы предполагает применение более эффективного и более производительного роллерного метода культивирования вирусов.

В проведенных нами экспериментах оценивали возможность и перспективность культивирования штамма ВН-96 вируса ТГЭС в сублинии клеток СПЭВ-б роллерным методом. Для этого использовали пластиковые роллерные бутыли объемом 2л (Rollerbottle Cellmaster) фирмы Greiner bio-one Weaton (USA). Скорость вращения бутыли составляла 12 об/час. В контрольных экспериментах вирус выращивали в стационарных условиях в пластиковых матрасах (Greiner) объемом 0,6 л. Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что культивирование вируса ТГЭС во вращающихся бутылях является более эффективным и производительным, чем метод стационарных культур (табл. 4).

Таблица 4 - Сравнительное культивирование штамма ВН-96 вируса ТГЭС

Метод культиви рования	Объем сосудов, л	Полезная площадь сосудов, см2	ПКК, тыс./мл	Объем суспензии, мл	Доза заражения, lg ТЦД50	Срок культи вир., сут.	Накопление вируса, lg ТЦД50/мл
Роллерный	2,0	840	200	300	5,5	5	7,5±0,1
Стационарный (контроль)	0,6	150	150	150			6,6±0,2

Примечание: ПКК - посевная концентрация клеток.

Во вращающихся сосудах отмечали практически 100%-ную адгезию клеток СПЭВ-б к поверхности субстрата, в контрольных - не более 90-95%, а монослойные культуры формировались на 24 часа раньше, чем в матрасах. Границы клеток и рисунок монослоя в роллерных культурах были более выраженными, зернистость отсутствовала. К 5 суткам наблюдения рН среды снижался с 7,4-7,6 до 6,9-7,1, за счет увеличения метаболической активности клеток в культуре.

Таким образом, роллерный метод культивирования обеспечивает оптимальные условия для репродукции штамма ВН-96 вируса ТГЭС в большей части клеточной популяции и накопление больших объемов антигена с активностью не ниже 7,33-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. Стабильное изготовление стерильного антигена наиболее реально при использовании энрофлона-К, обладающего выраженными антибактериальными и антимикоплазменными свойствами, что особенно важно при крупномасштабном производстве ПЛК, вируссодержащих материалов и иммунобиологических препаратов.

Установление оптимальных параметров лиофильного высушивания культурального вируса ТГЭС

Установлено, что при стандартных условиях лиофильного высушивания культурального вируса ТГЭС практически равноценным защитным эффектом характеризовались стабилизаторы ВГНКИ-3 и ОМ. Визуальный контроль показал, что высушенные образцы штамма ВН-96 вируса ТГЭС представлены в форме аморфных «таблеток» светлых тонов, не содержат «кратеров» и «каверн», имеют форму нижней части ампул и легко отделяются от стекла при легком встряхивании.

Снижение активности в образцах вируса с оптимальными защитными средами в результате замораживания и лиофилизации составляло, соответственно, с ОМ 0,7-0,9 lg ТЦД₅₀/мл. Дальнейшие исследования по термоинактивации сухих образцов штамма ВН-96 вируса ТГЭС в течение года при 20±2є С и 37±0,5є С подтвердили равноценность (р<0,01) стабилизирующих свойств, защитных сред ВГНКИ-3 и ОМ при коэффициенте корреляции (R) соответственно 0,85 и 0,80 и целесообразность применения на практике стабилизатора ВГНКИ-3. Это обусловлено тем, что исходное сырье для производства ОМ нестандартно по качеству, поэтому с практической точки зрения более целесообразно и более практично использовать защитную среду ВГНКИ-3. Полученные данные свидетельствуют о том, что лиофилизированный штамм ВН-96 вируса ТГЭС со стабилизатором ВГНКИ-3 является достаточно стабильным препаратом (табл. 5).

Таблица 5 - Стабильность штамма ВН-96 вируса ТГЭС, высушенного с различными защитными средами при температуре 20±2є С

Сроки хранения, сут.	Активность вируса, lg ТЦД50/мл
	Наименование защитных сред
	ВГНКИ-3	ЛС-18	ОМ
Нативный вирус 0-проба 120 240 360	6,5 5,56±0,1 5,56±0,1 5,11±0,2 4,56±0,1	6,5 5,36±0,1 5,11±0,2 4,56±0,1 4,28±0,2	6,5 5,56±0,1 5,39±0,1 5,11±0,2 4,89±0,2
R	0,9	0,8	0,5

При температуре минус 20є С в течение 2-х лет музейного хранения (срок наблюдения) препарат практически сохранил исходную активность вируса. При 4-8є С сухой препарат также сохранял стабильность, и лишь через 18-24 мес. хранения потери активности вируса достигали 1,0 lg ТЦД₅₀/мл.

Таким образом, в результате сравнительных исследований для практического использования были предложены защитная среда ВГНКИ-3 и оптимальные режимы высушивания полуфабриката, обеспечивающие сохранность вируса ТГЭС не менее 2-х лет хранения, как в замороженном состоянии, так и в условиях бытового холодильника.

Изучение антигенных свойств штамма ВН-96 вируса ТГЭС

Для доказательства возможности применения штамма ВН-96 вируса ТГЭС в культуре клеток СПЭВ-б для изготовления нативных и лиофилизированных образцов антигенов против ТГЭС нами были проведены сравнительные исследования по оценке его антигенных свойств, штамма «ТО₃₆SD₁₉₂» и вакцины производства ЧССР.

Установлено, что на 30-й день после иммунизации всеми испытуемыми штаммами вируса ТГЭС в сыворотках крови белых беспородных крыс были выявлены специфические вируснейтрализующие антитела при постановке реакции нейтрализации (РН). При этом, в сыворотке крови крыс при введении штамма ВН-96 антитела определялись в разведении 1/128 и при введении вакцины ЧССР - 1/256, что было выше значений для сыворотки крови крыс при введении штамма «ТО₃₆SD₁₉₂».

Полученные результаты позволили провести дальнейшие сравнительные исследования антигенных свойств штамма ВН-96 и вакцины производства ЧССР на кроликах. Выявлены специфические вируснейтрализующие антитела в РН при разведении сывороток крови 1/512, что подтвердило одинаково высокую антигеную активность этих штаммов.

На следующем этапе исследований антигенную активность штамма ВН-96 определяли на 12 серонегативных по отношению к ТГЭС подсвинках. За животными проводили ежедневные наблюдения, а первые три дня после введения вируса измеряли температуру тела. Клинические наблюдения за иммунизированными животными не выявили у поросят каких-либо отклонений в их состоянии; животные оставались клинически здоровыми на протяжении всего срока наблюдений. Через 22 дня после иммунизации все подсвинки стали сероположительными, титры специфических антител определялись на уровне 4,5-7,0 log₂ против штамма «Ленинградский» и 5,5-7,5 log₂ против штамма ВН-96.

Исследование биологической активности штамма ВН-96 вируса ТГЭС изучали с помощью проведения 7 последовательных пассажей на культуре клеток СПЭВ. Исходный титр вируса составлял 5,250,25 lg ТЦД₅₀/см³. На 3-ем пассаже титр вирус составлял 5,750,31 lg ТЦД₅₀/см³, а к 5-му пассажу вирус накапливался в максимальных титрах и составлял 7,000,51 lg ТЦД₅₀/см³.В то же время дальнейшее пассирование не привело к повышению титра ТГЭС штамма ВН-96.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что выделенный штамм ВН-96 вируса ТГЭС обладает выраженными антигенными свойствами и высокой биологической активностью. Данный факт позволил сделать вывод о перспективности его использования для конструирования вакцины.

Сравнительная оценка иммунобиологических свойств штамма ВН-96 вируса ТГЭС в условиях свиноводческого комплекса

Для оценки вирулентности штамма ВН-96 вируса ТГЭС использовали 15 однодневных поросят, полученных от серонегативных по ТГЭС свиноматок. Предварительно сухой препарат в ампулах разводили физраствором и вводили перорально (п/о) в объёме 5 мл/гол., содержащем вируса 10⁵ lg ТЦД₅₀. Пяти контрольным животным препарат не вводили и содержали их отдельно при температуре 32-35 °С. Клинические признаки ТГЭС (температурная реакция, диарея, рвота, мышечная дрожь и конвульсии) и других вирусных инфекций (классической чумы свиней, болезни Ауески, РРС, везикулярной болезни, энтеро-, парво- и аденовирусов) отсутствовали. Гибели поросят в течение срока наблюдения (20 суток) не отмечено. Следовательно, штамм ВН-96 вируса ТГЭС является авирулентным, не вызывает поствакцинальных осложнений и гибели животных.

Реверсибельность аттенуированного штамма ВН-96 вируса ТГЭС оценивали на новорожденных безмолозивных поросятах в течение 5 пассажей. Для каждого пассажа штамма использовали по 5 поросят. В первом пассаже для интраназального заражения животных использовали исходный штамм в дозе 2Ч10^6,5 lg ТЦД₅₀. Через 2-3 суток 2-х поросят из 5-ти забивали. Из тканей тонкого отдела кишечника, лёгких и лимфоузлов готовили 10 % суспензию, которую осветляли центрифугированием, добавляли антибиотики и в качестве исходного материала в объёме 5 мл использовали для интраназального заражения (2-ой пассаж) поросят, а также для вирусвыделения на культуре клеток СПЭВ. Аналогичным образом проводили 3-5 пассажи. После каждого пассажа 3 оставшихся вакцинированных поросят выдерживали в течение 10 суток и оценивали общее состояние животных по клиническим признакам. Проведённые исследования показали, что штамм ВН-96 сохраняет исходные биологические свойства в течение 5 пассажей.

Иммуногенность штамма ВН-96 оценивали на 25 дневных поросятах, полученных от серонегативных по ТГЭС свиноматок. Опытных поросят (15 голов) однократно внутримышечно вакцинировали штаммом ВН-96 в дозе 4,2 lg ТЦД₅₀. Контрольных поросят (10 голов) не вакцинировали и содержали отдельно при температуре 32-35°С. Через 10 дней после введения вируса отбирали пробы крови. Полученные сыворотки исследовали в РМН на наличие специфических антител. Результаты исследований показали, что штамм ВН-96 вируса ТГЭС обеспечивает синтез вируснейтрализующих антител в организме привитых поросят, определяемых в сыворотке крови в титре 2,11±0,39 log₂, и 100% сохранность вакцинированных поросят.

Таким образом, проведенные исследования позволили выделить и охарактеризовать биологические свойства штамма ВН-96 вируса ТГЭС, которые сохраняются в течение 5 пассажей. Доказано, что штамм ВН-96 является безвредным и авирулентным для лабораторных животных и поросят, генетически стабилен в процессе серийного пассирования, характеризуется выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, что позволяет рекомендовать его для конструирования вакцины против вируса ТГЭС. Отработаны биотехнологические параметры культивирования штамма ВН-96 вируса ТГЭС, использования и деконтаминации ПЛК СПЭВ, обоснованы используемые питательные среды и ростовые добавки, оптимальные режимы замораживания и лиофилизации культурального вируса ТГЭС, рекомендованные к практическому использованию.

Выводы

1. Показано, что по размерам и морфологии частиц, электрофоретической подвижности и молекулярной массе структурных белков, по наличию в треках ПЦР вирусной нуклеиновой кислоты характерной фракции комплементарной ДНК (кДНК) величиной 886 пар нуклеотидов вирионы штамма ВН-96 соответствуют показателям коронавируса свиней. Специфичность штамма ВН-96 подтверждена в реакции нейтрализации со специфической сывороткой крови и в ПЦР.

2. Установлена различная чувствительность первичной культуры клеток почек эмбриона поросят и перевиваемых сублиний клеток СПЭВ к штамму ВН-96 вируса ТГЭС. Наиболее чувствительной и перспективной культуральной моделью для практического применения является ПЛК сублинии СПЭВ-б.

3. Выявлено, что деконтаминация линии клеток СПЭВ в максимальных концентрациях, не превышающих 40-50 тыс./мл, от микоплазменной инфекции наиболее успешна при использовании моно-препарата на основе энрофлона-К по методу Мовлеса и двух комбинированных препаратов: норфлоксацин (50мг/мл) + этоний (7мкг/мл) и энрофлон-К (35 мкг/мл) + твин-80 (7мкг/мл).

4. Определена целесообразность применения метода проточной цитометрии для экспресс-оценки и выбора наиболее перспективной культуральной модели для производства антигена и контроля активности вакцины против ТГЭ свиней. Установлена обратная зависимость ростовых свойств и величины апоптоза сублинии клеток СПЭВ-б.

5. Максимальное накопление вируса (6,67-7,33 lg ТЦД₅₀/мл) происходит при посевной концентрации ПЛК сублинии клеток СПЭВ-б 150тыс/мл, заражении в суспензию клеток ПЛК штамма ВН-96 вируса ТГЭС из расчета 5,0 lg ТЦД₅₀/мл, адсорбции вируса клетками в течение 60 минут при 37С. Оптимальной ростовой питательной средой является среда «Игла МЕМ» с 2-4% фетальной сывороткой крови; накопление вируса роллерным методом достоверно выше на 0,7-1,0 lg ТЦД₅₀/мл, чем в стационарной культуре.

6. Определена эффективная защитная среда - ВГНКИ-3, в которой лиофильно высушенный штамма ВН-96 сохраняет безвредность для лабораторных животных и исходную активность не менее двух лет, при температуре хранения 4-6є и минус 20єС.

7. Штамм ВН-96 вируса ТГЭС обладает безвредностью, авирулентностью для лабораторных животных и поросят, сохраняет исходные биологические свойства в течение 5-и пассажей, генетически стабилен в процессе серийного пассирования, характеризуется выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, что позволяет использовать его для конструирования вакцины против вируса ТГЭС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов и производства иммунобиологических препаратов ветеринарного назначения // Дьяконов Л. П., Уласов В. Н., Соловьев Б. Н., Симоненко Н. В. и др. - М. - 2006 г.

2. Методические указания по поддерживанию, хранению и контролю линии клеток «СПЭВ-б», утвержденные ФГУ ВГНКИ от 6 апреля 2007 г.

3. Для деконтаминации линии клеток СПЭВ от микоплазменной инфекции рекомендуется использовать моно-препарат на основе энрофлона-К и два комбинированных препарата на основе норфлоксацина с этонием и энрофлон-К с твином-80. Максимальные концентрации обрабатываемых ПЛК не должны превышать 40-50 тыс./мл. Сыворотки крови, вносимые в питательную среду, необходимо предварительно обработать с профилактической целью энрофлоном-К в дозе 20 мкг/мл в течение 72 часов при 37є С.

4. Рекомендуется для экспресс-оценки и выбора наиболее перспективной культуральной модели для производства антигена использовать метод проточной цитометрии, при котором достигается быстрая оценка характеристик клеток по показателям: размеры клеток, гранулярность, распределение ДНК по фазам клеточного цикла и запрограммированная клеточная гибель - апоптоз.

5. Для лиофилизации штамма ВН-96 вируса ТГЭС предлагается применять защитную среду ВГНКИ-3, обеспечивающую его безвредность для лабораторных животных и сохранение исходной активности штамма не менее двух лет при температуре хранения 4-6є и минус 20є С.

6. Рекомендуется использовать штамм ВН-96 вируса ТГЭС в качестве производственного аттенуированного штамма для изготовления диагностических и иммунобиологических препаратов против трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дьяконов Л.П. Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов и производства иммунобиологических препаратов ветеринарного назначения/ Л.П. Дьяконов, В.П. Уласов, Б.В. Соловьев, Н.В. Симоненко // Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины. - Москва, 2006. - Ч. IV. - С. 422-439.