Метод сверхраспластывания ядер в профазе I мейоза и исследование сателлитной ДНК Musmusculus

Размещено на http://www.allbest.ru/

Курсовая работа

по дисциплине «Биология»

на тему: Метод сверхраспластывания ядер в профазе I мейоза и исследование сателлитной ДНК Musmusculus



Введение

Сателлитная ДНК - характерный компонент геномов всех эукариот. Современные методы секвенирования имеют ряд ограничений при сборке и анализе больших массивов тандемно расположенных повторяющихся элементов ДНК. Таким образом, важная информация о размере и структуре огромных массивов ДНК в составе хромосом остается неизученной у многих объектов.

Для исследования сателлитной ДНК обычно используют цитогенетические методы на препаратах митотических метафазных хромосом. Для более детального исследования применимы препараты распластанных хромосом на стадии профазы I мейоза, а точнее пахитенных бивалентов (синаптированных гомологичных хромосом). Линейные размеры хромосом в пахитене мейоза больше чем в метафазе митоза. Такие препараты активно используются для изучения структуры отдельных хромосом с помощью оптической флуоресцентной микроскопии. Но световые микроскопы имеют известные ограничения, связанные с физическими свойствами видимой части спектра. Поэтому исследования ультраструктуры клеток часто проводят с помощью электронной микроскопии. Однако приготовление препаратов для электронной микроскопии сопряжено с необратимыми изменениями белков и ДНК, часть методов иммуноокрашивания значительно усложняется или невозможна. Структура хромосом в мейозе отличается удивительной пластичностью. Оси хромосом в течение профазы I деления способны изменять длину более чем в два раза. Именно этот факт послужил идеей для разработки нашего метода сверхраспластывания. В нашей работе мы решили модифицировать метод распластывания ядер сперматоцитов мыши. Таким образом, используя сильные стороны световой флуоресцентной микроскопии, в сочетании с новым методом приготовления препаратов, мы предприняли попытку увеличить детализацию в цитогенетических исследованиях.

Цели и задачи.

Цель:

Разработать метод сверхраспластывания хромосом и исследовать белковые маркеры мейоза и ДНК сателлиты Mus musculus Linnaeus, 1758.

Задачи:

1. Освоение метода распластывания ядер мейотических клеток.

2. Модификация метода для получения сверхраспластыванных хромосом.

3. Иммуноокрашивание мейоз-специфичных белков.

4. Проведение флуоресцентной in situ гибридизации с зондами к сателлитной ДНК.

5. Совмещение изображений иммуноокрашивания и FISH.

6. Анализ полученных результатов.



I. Мейоз

Мейоз - клеточное деление, лежащее в основе полового процесса у эукариот. Формирование гаплоидных гамет из диплоидных клеток зародышевого пути осуществляется посредством двух мейотических делений, следующих за одним раундом репликации ДНК. Во время первого мейотического деления к полюсам расходятся гомологичные хромосомы (гомологи). Первое мейотическое деление называется редукционным делением, так как в результате деления сперматоцитов I порядка осуществляется редукция числа хромосом - гомологи расходятся в разные ядра и число хромосом в сперматоцитах II порядка становится равным 1n. Во втором делении мейоза к полюсам расходятся сестринские хроматиды (рис.1).

Рисунок 1. Схема двух последовательных делений мейоза с указанием плоидности

иммуноокрашивание белковый маркер мейоз

Мейоз состоит из двух делений. Первое - редукционное, в нем расходятся гомологичные хромосомы. Профаза I состоит из 5 стадий:

1. Лептотена (лепнонема) - на этой стадии различимы хромосомы как очень тонкие нити за счет хромосомных осей, состоящих из белков когезинов . В следствие массивного насыщения белками, хромосомные оси в хромосомах становятся видны с помощью электронного микроскопа. Степень их компактизации меньше, чем в профазе митоза. В ранней лептотене, под действием специфических эндонуклеаз (в основном Spo11), возникают множественные двунитевые разрывы молекул ДНК (double-strand breaks, DSBs). В то же время происходит взаимное узнавание отдельных локусов гомологичных хромосом и их попарное соединение, необходимое для дальнейшего прохождения кроссинговера (рекомбинации). Так же в лептотене происходит изменение расположения хромосом, характерного для соматических клеток. Начиная с премейотической интерфазы наблюдается эффект (фигура) Рабля - кластрирование (объединение) центромерных районов хромосом вблизи полюса клеточного деления, которая начиная с премейотической интерфазы и на протяжении всей лептотены, меняется на кластрирование теломер хромосом на внутренней поверхности ядерной мембраны. Затем теломеры двигаются по мембране и к началу зиготены временно собираются на центросомном полюсе ядра, формируя структуру "букета". Внутри "букета" гомологичные хромосомы, фиксированные обоими концами на ядерной мембране, выстраиваются параллельно и выравниваются. Присоединение СК к мембране происходит с помощью пластинки прикрепления, состоящей из теломерный повторов, теломерных белков, субъединиц когезина и белков латеральных элементов. А передвижение теломер по мембране происходит за счет компонентов цитоскелета, которые связаны с теломерными концами хромосом с помощью трансмембранных белков. Между гомологичными хромосомами возникают контакты с помощью нитей хроматина, которые, вероятно, содержат сайты свежевозникших DSBs. Малая часть лептотенных контактов превращается в контакты, названные ассоциациями осевых элементов (АОЭ).

2. Зиготена (зигонема) - на этом этапе происходит конъюгация гомологичных хромосом, за счет того, что АОЭ превращаются в точки инициации формирования синаптонемных комплексов, осевые элементы гомологичных хромосом, соединившись попарно, превращаются в два латеральных элемента синаптонемного комплекса (СК), именно в это время в состав осевых элементов инкорпорируются мажорные белки латеральных элементов СК, в результате чего образуются т. н. биваленты. Хроматиды связываются друг с другом с помощью специальной белковой структуры - синаптонемного комплекса (рис. 2,3)

3. Пахитена (пахинема) - Пахитена начинается с того момента, как полностью достроится СК. На этом этапе происходит процесс кроссинговера (обмена гомологичными участками хромосом, образование кроссоверных продуктов), который контролируется специальной группой генов, а так же для его прохождения необходимы белки MLH1 и MLH3 (белки мисматч репарации), которые стабилизируют нестабильную D-петлю и в следствии этого происходит захват второго конца двунитевого разрыва с образованием двойного Холидеевского перекреста, который осуществляют RecA-подобные белки ферменты Rad51 и Dmc1. Продукты этих генов образуют комплекс белков, катализирующих заключительные этапы рекомбинации. Появляются хиазмы - перекресты между хроматидами гомологичных хромосом. Во время пахитены происходит репаративный синтез ДНК.

4. Диплотена (диплонема) - на этой стадии происходит частичное отделение гомологичных хромосом друг от друга, однако на этой стадии ещё имеются хиазмы. На стадии диплотены происходит частичная деконденсация хромосом.

5. Диакинез - в ходе диакинеза хиазмы постепенно исчезают, хромосомы окончательно конденсируются, исчезают ядрышки, центриоли расходятся к полюсам клетки, и, наконец, исчезает ядерная оболочка. Но в отличие от митоза гомологичные хромосомы остаются связанными между собой, а не расходятся произвольным образом.

Метафаза 1 - бивалентные хромосомы выстраиваются вдоль экватора клетки, происходит это за счет когезии, а также за счет хиазм и униполярности кинетохоров, обусловленной тем, что в мейозе 1 не происходит гидролиза когезинов соединяющих центромерные районы сестринских хроматид, так как от гидролиза они защищены специфическим для I деления мейоза белком шугошином.

Анафаза 1 - микротрубочки сокращаются, биваленты делятся, и хромосомы расходятся к полюсам (основное отличие редукционного деления от эквационного).

Телофаза 1 - хромосомы деспирализуются и появляется ядерная оболочка.

Цитокинез 1 - деление тела клетки, в результате образуются две 2n клетки.

Между делениями мейоза идет интеркинез, то есть упрощенная интерфаза (без S фазы). Во время нее хромосомы частично деконденсируются, а потом конденсируются вновь.

2. Второе деление - эквационное - подобно митотическому, в нем расходятся сестринские хроматиды, и оно тоже делится на 5 стадий:

Профаза 2 - происходит конденсация хромосом, клеточный центр делится и продукты его деления расходятся к полюсам ядра, разрушается ядерная оболочка, образуется веретено деления, перпендикулярное первому веретену.

Метафаза 2 - двухроматидные хромосомы располагаются на «экваторе» (на равном расстоянии от «полюсов» ядра) в одной плоскости, образуя так называемую метафазную пластинку.

Анафаза 2 - двухроматидные хромосомы делятся и хроматиды расходятся к полюсам.

Телофаза 2- хромосомы деспирализуются и образуется ядерная оболочка.

Цитокинез 2 - деление тела клетки, в результате из каждой 2n получается по 2 1n.

Интервал между первым и вторым делением мейоза иногда очень велик. Например, у яйцеклеток человека (точнее, у их предшественников) первое деление мейоза начинается ещё в ходе внутриутробного развития и останавливается на стадии зиготены. После наступления половой зрелости, в процессе овуляции, т. е. при выходе ооцита из яичника, оно заканчивается, и начинается второе деление мейоза, причем оно останавливается на метафазе II и заканчивается только после оплодотворения. В результате из одной диплоидной клетки образуется четыре гаплоидных клетки.

II. Синаптонемный комплекс

Синаптонемный комплекс был открыт в 1956 году одновременно и независимо друг от друга двумя американскими исследователями Монтрозе Мозесом и Дон Фасетом. Открытия СК стало революционным событием в исследовании мейоза, которое поставило десятки новых вопросов, которые решаются сегодня в лабораториях всего мира.

Рисунок 2. Строение синаптонемного комплекса ( по Page & Hawley, 2004)

Синаптонемный комплекс - субмикроскопическая нуклеопротеидная структура, образующаяся между гомологичными хромосомами в профазе I мейоза, и обеспечивающая кроссинговер. Образование синаптонемного комплекса начинается на стадии лептотены и полностью завершается на стадии пахитены. На стадиях диплотены и диакинеза белковые структуры разрушаются. В пахитене одновременно начинают идти два параллельных процесса: синапсис и рекомбинация.

Кариотипирование на основе СК имеет то преимущество перед кариотипированием метафазных хромосом, т.к. профазные мейотические хромосомы (и СК, соответственно) длиннее метафазных хромосом соматических клеток.

III. Сателлитная ДНК

Сателлитные ДНК - тандемно повторённые нуклеотидные последовательности. В геномах эукариот они занимают до 10% ДНК. Предположительно играют роль в пространственной организации хроматина: формирование теломер, центромер, организации хромосомных территорий. Всего на настоящий момент обнаружены десятки различных сателлитов ДНК Mus musculus. Два самых крупных сателлита, мажорный (Ма) и минорный (Ми), расположены в прицентромерном гетерохроматине и являются АТ-богатыми участками (Комиссаров, 2012). Наибольший размер мономера имеет мажорный сателлит - 234 п.н., а второй по величие - мономер минорного сателлита - 120 п.н.

Предыдущие исследования минорного сателлита мыши показали, что в пахитене обнаруживается четкие гибридизационные сигналы, локализованные в прицентромерных областях хромосом. Окрашивание распластанных мейотических и митотических ядер хорошо иллюстрирует, что минорный ДНК-сателлит располагается в хроматине компактно. На стадии пахитены на мейотических хромосомах гибридизационные сигналы выявляются на одном из концов всех аутосом и Х хромосомы. По величине этот сигнал может незначительно превышать ширину СК. При этом на СК-биваленте на одном из концов СК иногда видны сразу два расположенных рядом точечных сигнала. Это соответствует прицентромерным областям для каждой хромосомы в акроцентрическом биваленте мыши. Было установлено, что только прицентромерный район Y-хромосомы не гибридизуется с зондом к минорному ДНК-сателлиту. Псевдоаутосомный район располагается на противоположном от центромеры конце Х-хромосомы. Это район синапсиса Х- и У-хромосом. На короткой У-хромосоме сигнал минорногоДНК-сателлита не выявлен (Спангенберг 2013).

Материалы и методы

1. Получение суспензии сперматоцитов.

Семенники мыши помещали в чашку Петри со средой Игла без глутамина. Удаляли тунику, жировую ткань и крупные кровеносные сосуды. Семенные канальцы мыши переносили в стекло с лункой, в которую заранее вносили среду Игла. Ткань гомогенизировали с помощью автоматической пипетки (1000 мкл) в течение 15 минут. Под световым микроскопом оценивали степень гомогенизации суспензии. Полученную суспензию клеток переносили в центрифужную пробирку и доливали среду Игла до отметки 5 мл (на 1 семенник мыши), центрифугировали 10 минут при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспендировали в 0,5-1 мл свежей среды Игла. Пробирку с суспензией клеток держали на льду.

2. Получение тотальных препаратов стандартно-распластанных синаптонемных комплексов (СК) на тефлоне.

Поверхность тефлоновой пластинки обезжиривали 70% этанолом. На обезжиренную поверхность наносили 6-9 капель (по 6 мкл) 0,2 М раствор сахарозы, поверх которых наслаивали по одной капле (по 2 мкл) полученной суспензии. Через 2 минуты поверхности капель касались стеклом, покрытым поли-L-лизином. Капли равномерно распределяли наконечником пипетки на первой трети поверхности предметного стекла. Для максимального использования материала остатки капель с тефлона собирали и переносили на новое стекло, покрытое L-полилизином. Так же, как и в случае с первым стеклом, капли равномерно распределяли наконечником пипетки на первой трети поверхности предметного стекла. В течение 10 минут суспензию клеток на стекле высушивали в горизонтальном положении. Подсушенные препараты фиксировали охлажд?нным раствором 4% параформальдегида в 0,1 М растворе сахарозы в течение 10 минут. Фиксированные препараты отмывали в тр?х сменах 0,4% раствора Fotoflo (по 30 секунд в каждой смене) и сушили на воздухе. Готовые препараты хранили в холодильнике при -20°С.

3. Препараты метафазных митотических хромосом.

Препараты метафазных митотических хромосом получали стандартным методом с помощью метанол-уксусной фиксации (Рубцов, 2006).

4. Процедура иммуноокрашивания препаратов.

На препараты распластанных хромосом наносили первичные антитела (по 8 мкл каждого). Первыми наносили антитела, окрашивающие более мелкие структуры клеток. Стекла помещали во влажную камеру, переносили в холодильник, и инкубировали препараты с первичными антителами в течение ночи при -4°С. Перед нанесением вторичных антител стекла промывали в тр?х сменах PBS (0,01М, рН 7,3-7,5, 0,137 моль/л NaCl, 0,0027 моль/л KCl) (БиолоТ) по 5 минут. Далее на препараты наносили вторичные антитела (по 8 мкл каждого) и инкубировали препараты во влажной камере в течение двух часов при 37°С. После инкубации со вторичными антителами препараты промывали 3 раза по 5 минут в PBS. Далее наносили каплю среды для заключения препаратов Vectashield с красителем DAPI (Vector Laboratories), сверху препарат накрывали покровным стеклом.

5. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) с зондами к сателлитной ДНК мыши.

В качестве ДНК-зондов для семейств повторяющихся последовательностей использовали искусственно синтезированные олигонуклеотиды (длиной в 24 и 30 нуклеотида), меченные флюорохромом FAM или TAMRA на 5' конце, синтезированные фирмой «Синтол» (Россия). ДНК-зонды:

Мажорный сателлит мыши - 5' TTCACGTCCTAAAGTGTGTATTT

Минорный сателлит мыши - 5' GAACAGATTAGATGAGTGAGTTACACTGAA

Препарат с нанес?нной реакционной смесью накрывали покровным стеклом, края покровного стекла герметизировали с помощью резинового клея, чтобы избежать испарения и изменения концентрации компонентов реакционной смеси. Полученный препарат помещали в автоматичекий гибридайзер Thermo Brite Stat Spin S500. Денатурацию проводили при 73°С, в течение 3 минут. Отжиг проводили при 37°С в течение 12 часов. Препараты подвергались отмывке в 2Х SSC растворе в течение 5 минуты при температуре 50°С. Затем препарат промывали в дистиллированной воде в течение 20 секунд. На высохший препарат наносили каплю среды для заключения Vectashield с красителем DAPI (Vector laboratories) и накрывали покровным стеклом.

6. Флуоресцентная микроскопия.

Препараты анализировали с помощью универсального флуоресцентного микроскопа Axio Imager D1 (Carl Zeiss, Германия), оборудованного объективами PLAN-NEOFLUAR (при использовании 100?), ртутной лампой НВО, черно-белой CCD камерой накопления сигнала AxioCam HRm Rev.3 (Carl Zeiss, Германия), набором комбинированных фильтров для флуорохромов, имеющего выход на компьютер. Компьютер снабжен программным комплектом Axiovision Release 4.6.3 (Carl Zeiss, Германия) для получения видеоизображения.

Результаты

Стандатный метод распластывания ядер сперматоцитов I.

Нами был использован стандартный метод распластывания ядер сперматоцитов I, используемый в лаборатории цитогенетики ИОГен РАН. Полученные препараты подходят для иммуноокрашивания антителами к основным маркерам рекомбинации, репарации ДНК, белкам инактивации хроматина. Для получения классических изображений распластанных ядер мы провели иммуноокрашивание антителами SCP3 (осевые элементы хромосом в мейозе), Rad51 (маркер репарации двунитевых разрывов ДНК).

Рисунок 3. Распластанное ядро сперматоцита I на стадии пахитены. Иммуноокрашивание осевых элементов (SYCP3) и белка репарации DSBs (RAD51). Хроматин окрашен красителем DAPI

На Рисунке 3 отчетливо виден более интенсивно-окрашенный хроматин (светло-голубые пятна), составляющий прицентромерный гетерохроматин и хромоцентры. Аутосомные хромосомы синаптированы, образуют биваленты, осевые структуры которых представлены красным цветом. Половые хромосомы X и Y синаптированы только частично в небольшом участке (ПАР- псевдоаутосомный регион) и имеют на осях фокусы белка RAD51 - маркера незавершенной репарации двунитевых разрывов (DSBs). Репарация DSBs в половом биваленте затягивается, поскольку полный синапсис X и Y не происходит из-за неполной гомологии между этими хромосомами.

Таким образом, мы получили классический тотальный препарат синаптонемных комплексов (СК) с иммуноокрашиванием структурного белка (SYCP3) и маркера незавершенной репарации (RAD51). Степень распластывания достаточна для основных задач: СК-кариотипирование, исследования аномалий синапсиса хромосом. По границам хроматина, окрашенного красителем DAPI, диаметр распластанного ядра составляет 35-45 мкм.

Одной из основных задач нашей работы было получение сверхраспластанных хромосом. Поэтому после отработки базового метода мы провели ряд экспериментов по модификации условий распластывания ядер сперматоцитов.

Разработка метода сверхраспластывания ядер сперматоцитов I порядка.

В основе метода распластывания (приготовления спредов) ядер, находящихся на стадии профазы I мейоза, лежит сочетание воздействия на клетки гипотоничсеским раствором и сил поверхностного натяжения при слиянии капель.Мы провели сравнение нескольких типов воздействий на суспензию клеток при приготовлении препаратов. Условно, проверенные нами воздействия можно разделить на две группы:

1. Подбор раствора, с каплями которого сливаются капли суспензии клеток;

2. Манипуляции с процессом слияния капель раствора и суспензии.

Оценка результатов проводилась после имуноокрашивания препаратов антителами к белку осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3).

Для обобщения результатов проведенной работы была составлена Таблица 1, где первая группа воздействий выделена зеленым, вторая - голубым цветом.

Критериями оценки результата служили: степень распластывания, фрагментация осей хромосом, сохранность архитектуры ядра и чистота препарата (отсутствие фрагментов клеток).



Таблица 1

	Способ распластывания	Степень распластывания	Фрагментация осей хромосом	Сохранность архитектуры ядра	Чистота препарата
1	Наслаивание на капли 0.2М сахарозы	2	1	3	3
2	Наслаивание на капли 0.2М сахарозы с Tween 20	2	1	2	1
3	Наслаивание на дистиллированную воду	3	3	1	2
4	Слияние двух капель	2	1	3	3
5	Последовательное слияние капель	3	2	2	1
6	«Протягивание» суспензии между стеклами	3	2	2	3
7	Варианты 5 + 6	3	2	2	3

1- слабое 2 - среднее 3- сильное

Первый вариант распластывания клеток на каплях 0.2М сахарозы считается классическим методом Navarro с соавторами (Navarro et al., 1981). Поэтому результаты наших модификаций метода были сопоставлены с препаратами, полученными на 0.2М сахарозе (первая строка).

Для усиления действия сил поверхностного натяжения капли использовалась гидрофобная поверхность (тефлон или графитовая бумага), с которой капля суспензии переносилась на стекло. Были испробованы различные модификации: подвешенная капля, метод, когда капля с суспензией сливается с окружающими её каплями дистиллята, использование детергента (tween 20). Однако наибольшую эффективность показала группа методов, в которых капли последовательно сливали и затем. результирующая капля с помощью фильтровальной бумаги протягивалась между покровным и предметным стёклами.

В результате проведенной работы по сравнению изображений сверхраспластанных ядер сперматоцитов мы пришли к двум выводам:

1. Оптимальный гипотонический агент для сверхраспластывания - дистиллированная вода;

2. Оптимальный способ распластывания - сочетание слияния капель и «протягивание» суспензии между предметным и покровным стеклом.

С помощью модифицированного нами метода распластывания ядер сперматоцитов, мы получили препараты и подвергли их иммуноокрашиванию.

В 30% случаев на полученных нами препаратах обнаруживались ядра средней степени распластывания. Диаметр таких распластанных ядер составляет 45-80 мкм. На Рисунке 4 представлено такое ядро. Половой бивалент иммуноокрашен антителами к модифицированной форме гистона GammaH2AX - маркеру инактивированного хроматина. Детализация полученного изображения значительно лучше, чем при стандартном распластывании. Фрагментации осевых структур не наблюдается. Архитектура распластанного ядра, в целом сохранена.

Рисунок 4. Распластанное ядро сперматоцита I на стадии пахитены. Иммуноокрашивание осевых элементов (SYCP3) и маркера инактивированного хроматина(Gamma H2AX). Хроматин окрашен красителем DAPI

Большая часть (около 70%) ядер на полученных нами препаратах имели уже значительную степень распластанности хроматина. Такие распластанные ядра зачастую выходили за границы поля зрения 40х объектива (Carl Zeiss EC PLAN-Neophluar). Некоторые тотальные препараты СК требовали 3-4 снимка для покрытия всего ядра. Диаметр таких распластанных ядер составлял 80-250 мкм и более. На рисунке 3 представлен тотальный сверхраспластанный препарат синаптонемных комплексов мыши, диаметр распластаного хроматина около 200 мкм. Для сравнения в том же масштабе представлены: метафазная пластинка (метафаза митоза) и обычный распластанный препарат синаптонемных комплексов из Рисунка 3. Исходя из общей картины на рисунке 5 можно сделать вывод, что, не смотря на частичную фрагментированность осевых элементов, общая архитектура распластанного ядра сохраняется. Половой бивалент имеет характерную структуру и легко выявляется даже без иммуноокрашивания.

Рисунок 5. Сверхраспластанное ядро сперматоцита I на стадии ранней диплотены. Иммуноокрашивание осевых элементов (SYCP3). Хроматин окрашен красителем DAPI. Для сравнения представлены: метафазная пластинка и классический препарат СК в том же масштабе



Иммуноокрашивание белковых маркеров мейоза на сверхраспластанных препаратах СК.

В ходе иммуноокрашивания сверхраспластанных препаратов мы выяснили, что основные белковые маркеры: структурные белки осевых элементов хромосом, центромерные белки, белки репарации ДНК и маркеры инактивации хроматина успешно выявляются в структуре сверхраспластанных СК.

На рисунке 6 продемонстрированы фрагменты препаратов синаптонемных комплексов с детализацией синапсиса (или десинапсиса) аутосомных хромосом. Выявляется твистинг (перекручивание осевых элементов), прителомерный синапсис.

Рисунок 6. Сверхраспластанный препарат синаптонемных комплексов мыши. Особенности синапсиса и десинапсиса гомологичных хромосом мыши. Иммуноокрашивание осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3) Масштабный отрезок 10мкм

На рисунке 7 представлен сверхраспластанный половой бивалент мыши. Иммуноокрашивание белка GammaH2AX (зеленый сигнал) подтверждает, что данная пара хромосом - половой бивалент. Осевые элементы X- и Y-хромосом имеют в некоторых участках раздвоенную структуру, что является демонстрацией наличия двух сестринских хроматид в каждой из половых хромосом (Рис. 5). Такая детализация обычно недоступна на препаратах для световой микроскопии. Особенности синапсиса чаще исследуют с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Таким образом мы показали применимость иммуноокрашивания модифицированных гистонов (GammaH2AX) на сверхраспластанных препаратах хромосом.

Рисунок 7. Сверхраспластанный половой бивалент мыши. Иммуноокрашивание осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3), инактивированного хроматина (GammaH2AX)

На рисунке 8представлено иммуноокрашивание белков центромеры (антителами АСА) - слева и белка RAD51 - маркера незавершенной репарации двунитевых разрывов. Таким образом, при работе с препаратами сверхраспластанных СК методы иммуноокрашивания остаются применимы. Более того, благодаря большей детализации на полученных нами изображениях, в будущем возможно исследование структуры СК, которое ранее проводилось только с помощью электронной микроскопии на распластанных препаратах ядер.



Рисунок 8. Сверхраспластанный препарат синаптонемных комплексов мыши. Иммуноокрашивание осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3), центромерных белков (centromere) и маркера репарации DSBs (RAD51). Масштабные отрезки - 10мкм

Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) с зондами к минорному и мажорному ДНК-сателлитам мыши.

Для контрольных экспериментов, с целью проверки наших олигонуклеотидных ДНК-зондов, мы использовали препараты, приготовленные из следующих типов клеток:

1. интерфазных ядер клеток мыши (культура фибробластов)

2. метафазных ядер клеток мыши (культура фибробластов)

1. На стадии интерфазы мы регистрировали частичную кластеризацию сигналов мажорного и минорного сателлитов, что согласуется с данными о их взаиморасположении в перицентромерном и прицентромерном гетерохроматине хромосом мыши (Рис. 9).



Рисунок 9. Распределение минорного и мажорного сателлитов на препарате ядра клетки на стадии интерфазы. Фиолетовый сигнал - минорный сателлит, зеленый сигнал - мажорный сателлит. Масштабный отрезок - 10 мкм

2. Стадия метафазы митотического деления является наиболее часто используемой стадией жизненного цикла клетки для локализации последовательностей методом FISH. В нашей работе мы также сделали контрольные опыты по in situ гибридизации на метафазных пластинках мыши с ДНК-зондами к минорному (желтый сигнал) и мажорному (красный сигнал) сателлитным повторам (Рисунок 10)

Рисунок 10. Распределение минорного и мажорного сателлитов на препарате метафазной пластинки мыши, на стадии метафазы митотического деления клетки из культуры фибробластов. Фиолетовый сигнал - минорный сателлит, зеленый сигнал - мажорный сателлит. Масштабный отрезок - 10 мкм



5. Иммуно-FISH на стандартно-распластанных препаратах синаптонемных комплексов мыши.

В данном разделе представлены результаты FISH на препаратах, ранее исследованных методами иммуноокрашивания.

Для контрольных экспериментов мы использовали стандартный метод распластывания ядер сперматоцитов I порядка на гипотоническом растворе 0.2М сахарозе. Как и ожидалось, полученные спреды отличались стандартной степенью распластывания.

Осевые элементы хромосом и центромеры хорошо выявлялись в таких ядрах.

Оба ДНК-сателлита были обнаружены нами в околоцентромерных регионах хромосом. Причем, как и в случае препаратов метафазных хромосом, мажорный сателлит занимал значительно большую площадь, чем минорный, распространяясь практически на все зоны, которые соответствуют интенсивной окраске DAPI (Рисунок 11 слева и справа).

Рисунок 11. Иммуно-FISH на перпаратах стандартного распластывания синаптонемных комплексов мыши. Иммуноокрашивание осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3), центромерных белков (centromere). Фиолетовый сигнал - минорный сателлит, зеленый сигнал - мажорный сателлит. Масштабный отрезок - 10 мкм

Однако пересекающиеся осевые элементы хромосом и небольшие размеры стандартно-распластанных ядер не позволяли детально исследовать особенности структуры минорного и мажорного сателлитов для каждой хромосомы в отдельности. Поэтому мы исследовали тотальные препараты СК средней степени распластанности.

При проведении Иммуно-FISH с ДНК-зондами к сателлитной ДНК мыши на препаратах средней степени распластывания, мы получили изображения более вытянутых зон гетерохроматина (по DAPI-окраске), которые связывали некоторые негомологичные хромосомы (Рис. 12). Сигнал мажорного сателлита повторил контуры этих зон, соединяя центромерные зоны некоторых хромосом. Минорный сателлит, располагался более локально в околоцентромерной области, но также обнаружены «мостики» между центромерными регионами негомологичных хромосом (Рис. 12-13).

Рисунок 12. Иммуно-FISH на перпаратах стандартного распластывания синаптонемных комплексов мыши. Иммуноокрашивание осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3), центромерных белков (centromere). Фиолетовый сигнал - минорный сателлит, зеленый сигнал - мажорный сателлит. Масштабный отрезок - 10 мкм



Рисунок 13. Совмещение Иммуно-FISH для обоих сателлитных ДНК. Иммуноокрашивание осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3). Фиолетовый сигнал - минорный сателлит, зеленый сигнал - мажорный сателлит. Масштабный отрезок - 10 мкм

5. Иммуно-FISH на сверхраспластанных препаратах синаптонемных комплексов мыши

При проведении метода иммуно-FISH с ДНК-зондами на приготовленных нами сверхраспластанных препаратах синаптонемных комплексов мы решили важную проблему стандартной методики - избавились от пересекающихся и близкорасположенных хромосом (Рис. 14).



Рисунок 14. Иммуно-FISH для сателлитных ДНК мыши: мажорного и минорного. Иммуноокрашивание осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3), центромерных белков (центромера). Фиолетовый сигнал - минорный сателлит, зеленый сигнал - мажорный сателлит. Масштабный отрезок - 10 мкм

Исходя из полученных совмещенных изображений FISH-окрашивания обоих сателлитных ДНК и иммуноокрашивания на сверхраспластанных препаратах, мы можем сказать следующее:

1. Связующие «мостики» между негомологичными аутосомами, выявляемые с помощью интенсивной DAPI-окраски в значительной степени совпадают с сигналом мажорного ДНК-сателлита (Рис. 14).

2. Минорный сателлит занимает значительно меньшую площадь, но также локализуется в описанных выше «мостиках».

3. Количество «связанных мостиками» хромосом совпадает для всех типов приготовления препаратов.

4. Значительно более высокая компактность минорного сателлита выявляется для всех типов исследованных нами препаратов.



Заключение

Проведено сравнительное исследование воздействия различных гипотонических растворов при приготовлении препаратов распластанных ядер клеток, а также выбран оптимальный способ фиксации препаратов.

При помощи разработанного метода сверхраспластывания мейотических хромосом визуализирован СК-кариотип самца мыши Mus musculus с детализацией, ранее доступной только для метода электронной микроскопии.

Представлены детальные изображения тотальных препаратов синаптонемных комплексов и отдельных хромосом. Проведено иммуноокрашивание структурных белков осевых элементов хромосом, белков репарации двунитевых разрывов ДНК и маркера инактивированного хроматина на сверхраспластанных аутосомах и половых хромосомах. Исследована структура двух ДНК-сателлитов мыши на препаратах разной степени распластывания СК. Выявлена сеть тяжей хроматина, объединяющая негомологичные хромосомы в единую систему, по-видимому обеспечивающую динамичную стабильность хромосомных территорий.

Выводы

1. Разработан новый метод приготовления сверхраспластанных тотальных препаратов синаптонемных комплексов мыши.

2. Доказана возможность использования методов иммуноокрашивания на сверхраспластанных препаратах синаптонемных комплексов.

3. Использован метод иммуно-FISH для сверхраспластанных препаратов синаптонемных комплексов мыши.

4. Исследована структура двух ДНК-сателлитов мыши на препаратах разной степени распластывания СК. Выявлена сеть тяжей хроматина, объединяющая негомологичные хромосомы в единую систему, обеспечивающую динамичную стабильность хромосомных территорий.



Список литературы

1. Page, S. L., & Hawley, R. S. (2004). The genetics and molecular biology of the synaptonemal complex. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 20, 525-558.

2. Торгашева, А. А. (2014). Мейоз: что нужно пережить ради уменьшения числа хромосом вдвое. Вавиловский журнал генетики и селекции, 17(1), 17-28.[4]: Богданов Ю.Ф. “Белковые механизмы мейоза”. <<Природа>>№3, 2008.

3. Bogdanov Yu. F. Variation and evolution of meiosis. Russian Journal of Genetics, Vol. 39, No. 4, 2003, pp. 363-381.

4. Комиссаров А.С. “Организация больших тандемных повторов в геноме мыши”. Автореферат, 2003.

Размещено на Allbest.ur