Біологічна дія еритропоетину у різних концентраціях на культуру клітин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Біологічна дія еритропоетину у різних концентраціях на культуру клітин

Робота виконана в рамках науково-дослідної теми кафедри біології людини та імунології Херсонського державного університету «Дія гетероциклічних сполук на систему імунітету та морфологію внутрішніх органів лабораторних мишей», № держ. реєстрації 0111U007783.

Вступ. Культивування клітин в умовах in vitro з кожним роком все більше застосовується у найрізноманітніших галузях біології, сільського господарства та медицини. В останні роки культивування клітин in vitro набуло широкого поширення у швидко прогресуючих прикладних галузях біотехнології. Культуру тваринних тканин застосовують для вивчення механізмів гістогенезу, міжтканинних і міжклітинних контактів, метаболітичних процесів. Також цей метод використовують при вирішенні таких загально біологічних проблем, як з'ясування механізмів диференціювання і проліферації різних видів клітин [1].

Найбільш важливою характеристикою культури є її ріст, а саме дослідження кількості клітин на різних стадіях існування культури. Відповідно розробляються нові та удосконалюються вже відомі методи дослідження параметрів росту клітин [2]. Також актуальним є дослідження впливу біологічно активних речовин, зокрема еритропоетину, на ростові параметри культури клітин, що дозволяє визначати біологічну дію цих речовин в залежності від їх концентрації, та оцінити процеси життєдіяльності, які відбуваються у клітинах [3].

Еритропоетин - це гормон, який, за даними ряду досліджень, має плейотропний вплив на фізіологічні системи організму людини. Показано, що рецептори до еритропоетину є не лише на мембранах клітин червоного кісткового мозку, їх також виявлено в клітинах ендотелію, гладеньких і скелетних м'язів, міокарді [5].

Мета даного дослідження - виявити залежність тривалості окремих стадій розвитку культури клітин ендотеліосаркоми миші від концентрації еритропоетину.

Об'єкт і методи дослідження. Культуру клітин ендотелісаркоми миші отримували шляхом експлантації окремих частин пухлини та стандартних процедур культивування. Для з'ясування впливу еритропоетину на кінетику параметрів росту культури клітин було сформовано чотири досліджувані групи: перша інкубувалася з еритропоетином у концентрації 13 МЕ/мл, друга - 6,5 МЕ/мл, третя - 0,13 МЕ/мл і четверта - контрольна група. Інкубація тривала протягом 32 днів. Періодично робився підрахунок кількості клітин у камері Горяєва. На основі отриманих даних будувалася крива росту з подальшим аналізом її окремих ланок [4].

Результати досліджень та їх обговорення. Аналізуючи кінетику параметрів росту культури клітин усіх чотирьох досліджуваних груп ми виявили, що ріст культури клітин характеризувався наявністю чотирьох фаз: лаг-фази, фази експотенційно - го росту, стаціонарної фази та деградації культури (рис.).

Тривалість лаг-фази при інкубації з еритропое - тином у концентрації 13 МЕ/мл була 8 діб, причому на 4 добу спостерігалося зменшення кількості клітин. Експоненційна фаза тривала протягом 12 діб, концентрація клітин збільшилася трохи більше, ніж у 100 разів. Починаючи з 21-ї доби кількість клітин починає зменшуватися. Стаціонарна фаза не виявляється, а культура відразу переходить у фазу деградації.

Під час інкубації культури клітин з еритропоетином у концентрації 6,5 МЕ/мл лаг-фаза тривала також 8 діб, проте не спостерігалося падінняБіологічні науки концентрації клітин протягом цієї фази. Експонен - ційна фаза тривала також 8 діб, концентрація клітин збільшилася у 70 разів. З 17-ї по 24-ту добу триває стаціонарна фаза росту культури, починаючи з 25-ї доби культура клітин входить у фазу деградації.

Культура клітин, що інкубувалася з еритропоетином у концентрації 0,13 МЕ/мл, мала такі тривалості фаз росту: лаг-фаза тривала приблизно 8 діб, експотенційна фаза тривала 20 діб, причому концентрація клітин збільшилася практично у 250 разів порівняно з посівною концентрацією, стаціонарна фаза не виражена, починаючи з 29 доби відбувається деградація культури клітин.

Лаг-фаза контрольної культури клітин тривала майже 20 діб, при цьому перші 8 діб зростання кількості клітин було майже не помітним, а з 9-ї доби інтенсивність росту культури збільшилася. Починаючи з 21 доби спостерігається фаза експоненцій - ного росту, що триває приблизно 8 діб, концентрація клітин збільшується трохи більше, ніж у 250 разів. Починаючи з 28 доби культивування спостерігається деградація культури клітин. Стаціонарна фаза не виражена.

Відсутність стаціонарної фази під час інкубування з еритропоетином у концентрації 13 МЕ/мл, 0,13 МЕ/ мл та контрольній групі може пояснюватися суттєвим збільшенням кількості клітин у експо - ненційній фазі (у більше, ніж 100, 200 та 250 разів відповідно) та виснаженням поживного середовища. У групі клітин, що культивувалися з еритропоетином у концентрації 6,5 МЕ/мл збільшення кількості кілтин у експоненційній фазі було не таким інтенсивним (у 70 разів), це не призвело до швидкого виснаження поживного середовища та обумовило наявність стаціонарної фази.

Ми з'ясували, що еритропоетин як біологічно активна речовина має не однакову дію на культуру клітин у різних концентраціях. Так у високій концентрації (13 МЕ/мл) він мав помірну пригнічувальну дію на ріст культури клітин. Хоча він стимулював швидший перехід культури клітин з лаг-фази у фазу експоненційного росту порівняно з контрольною групою, проте максимальна концентрація клітин так і не досягла рівня контрольної групи. У середній концентрації (6,5 МЕ/мл) еритропоетин мав виражену пригнічувальну дію. Тривалість лаг-фази була меншою, ніж у контрольній, проте тривалість фази експоненційного росту була такою ж, як і у контрольній групі. Максимальна концентрація клітин була у 3,8 разів меншою за контрольну. У низькій концентрації (0,13 МЕ\мл) еритропоетин практично не виявляв пригнічувальної дії. Він сприяв швидшому переходу культури клітин у експоненційний ріст, порівняно з контрольною групою, а максимальна концентрація клітин майже досягла такого рівня, як і у контрольній групі.

Отже, еритропоетин у всіх концентраціях сприяв швидшій адаптації клітин до нового середовища (зменшення тривалості лаг-фази), проте не стимулював поділ клітин (збільшення концентрації клітин), а у середній та високій концентрації пригнічував його, причому під час інкубування з еритропое - тином у середніх концентраціях пригнічувальна дія на поділ клітин була більш вираженою, порівняно з іншими концентраціями.

Висновки

1. З'ясовано, що у високій концентрації (13 МЕ/мл) еритропоетин мав помірну пригнічувальну дію на ріст культури клітин.

2. Виявлено, що у середній концентрації (6,5 МЕ/мл) еритропоетин мав виражену пригнічувальну дію.

3. Встановлено, що у низькій концентрації (0,13 МЕ\мл) еритропоетин практично не виявляв пригнічувальної дії.

4. З'ясовано, що еритропоетин у всіх концентраціях сприяв швидшій адаптації клітин до нового середовища (зменшення тривалості лаг-фази), проте не стимулював поділ клітин (збільшення концентрації клітин).

Перспективи подальших досліджень. У подальшому планується оцінити біологічну дію ерит - ропоетину на культуру клітин у інших концентрацій та провести оцінку життєздатності клітин при інкубації з цими концентраціями.

Література

ендотеліосаркома еритропоетин біологічний

1. Vechkanov EM, Sorokina IA. Kletochnaya inzheneriya. Rostov-na-Donu: YuFU, 2012. 134s. [Russian].

2. Karen Kirkwood. CELL CULTURE BASICS. USA: Invitrogen Gibso, 2014. 62 p.

3. Garmanchuk LV. Metodichni rekomendatsiyi do spetspraktikumu « «Kultura klitin ta klonuvannya» u 2 chastinakh. Ch II. Kiyiv, 2013 40s. [Ukrainian].

4. Freshni RYa. Kultura zhivotnykh kletok. Prakticheskoe rukovodstvo. Moskva: BINOM Laboratoriya znaniy, 2010. 714 s. [Russian].

5. Grimm C, Wenzel A, Groszer M, Mayser H, Seeliger M, Samardzija M, Bauer C, Gassmann M, Reme C. HIF-1 - induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nat Med. 2002 Jun; 8: 718-24. PMID: 12068288. DOI: 10.1038/nm723.

Размещено на Allbest.ru