Размещено на http://www.Allbest.ru/

03.00.13 - Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тема:

Роль нейроглиальных взаимодействий и кальциевой сигнальной системы в реакциях нейронов и глиальных клеток речного рака на фотодинамическое воздействие

Лобанов Андрей Владимирович

Ростов-на-Дону - 2007

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте нейрокибернетики им. А.Б. Когана государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ростовский государственный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Узденский Анатолий Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Менджерицкий Александр Маркович

доктор биологических наук, профессор Зинченко Валерий Петрович

Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г. Пущино-на-Оке)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ЮФУ (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148)

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Бабенко В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Одна из актуальных проблем современной нейрофизиологии - изучение функций глиальных клеток (ГК) в их взаимодействии с нейронами. ГК обеспечивают нейроны энергией, поддерживают концентрацию ионов и рН в межклеточной среде, регулируют развитие синаптических связей и проведение нервных импульсов, защищают нейроны от окислительного стресса и т.д. Однако полностью функции глии, а также нейроглиальные взаимодействия еще недостаточно изучены (Laming et al, 2000, Никколс и соавт., 2003). Между тем, нейроглиальные взаимодействия особенно важны в критические периоды развития и при повреждении нервной системы. Исследования последних лет показывают, что нейроны и ГК взаимно поддерживают функционирование и выживание друг друга с помощью межклеточных адгезионных контактов и различных молекулярных сигналов. Такими сигнальными молекулами служат нейротрофические факторы и нейромедиаторы (Barres and Barde, 2000; Thippeswamy et al., 2005; Manesh et al., 2006).

Важнейшим повреждающим фактором для клеток нервной системы является окислительный стресс. Он лежит в основе действия ишемии/гипоксии, нейродегенеративных заболеваний, различных физико-химических воздействий и травм (Storz et al., 1999; Chong et al., 2005). Эффективным индуктором окислительного стресса является фотодинамическое (ФД) воздействие. В его основе лежит образование активных форм кислорода (в частности, весьма токсичного синглетного кислорода) при освещении окрашенных клеток в присутствии кислорода. Это вызывает окислительный стресс и клеточную гибель (Dougherty et al., 1998). ФД эффект лежит в основе фотодинамической терапии (ФДТ), применяемой в онкологии, в частности, для разрушения опухолей мозга. При этом могут повреждаться здоровые нейроны и ГК, окружающие опухоль. Но если влияние ФД-воздействия на опухолевую ткань подробно изучено (Dougherty et al., 1998; Dolmans et al., 2003; Oleinik et al., 2002), то реакции неповрежденной нервной ткани на ФД-повреждение и роль в них нейроглиальных взаимодействий практически не исследованы. Между тем, выяснение механизмов устойчивости здоровой нервной ткани к ФД-воздействию помогло бы оптимизировать его режимы при клиническом применении и разработать способы как усиления ФД-повреждения опухолевых клеток, так и защиты здоровых.

В устойчивости нейронов и ГК к фотоокислительному стрессу особую роль играют процессы меж- и внутриклеточной сигнальной трансдукции, которые регулируют процессы функциональной инактивации и смерти нейронов и ГК (Barres and Barde, 2000; Oleinik et al., 2002; Bragin et al., 2003; Uzdensky et al., 2005,). Поэтому изучение клеточно-молекулярных механизмов повреждения и устойчивости нейронов и ГК к фотоокислительному стрессу является важной физиологической задачей.

Цель работы: Изучить реакции нейронов и глиальных клеток на фотоокислительный стресс, генерируемый фотодинамическим воздействием и выяснить роль происходящих при этом нейроглиальных взаимодействий, обеспечиваемых нейротрофическими факторами и поверхностными и межклеточными белками, а также изучить роль Ca²⁺-зависимых сигнальных белков и влияния импульсной гиперактивности нейронов на процессы фотодинамического повреждения нейронов и глиальных клеток.

Задачи исследования:

1. Изучить изменения функциональной активности механорецепторных нейронов речного рака, а также процессы смерти нейронов и окружающих глиальных клеток под влиянием фотодинамического воздействия.

2. Изучить роль межклеточных и поверхностных белков-мишеней протеолитических ферментов, обеспечивающих нейроглиальные взаимодействия, нейротрофических факторов (NGF, GDNF и HRG1-в1), а также Ca²⁺-зависимых сигнальных белков (кальмодулина и кальмодулин-зависимой киназы II, фосфатидилинозитол- и фосфатидитхолин-специфических изоформ фосфолипазы С, Са²⁺-АТФаз ЭПР) в регуляции устойчивости нейронов и глиальных клеток к фотоиндуцированному некрозу.

3. Изучить участие данных сигнальных путей в регуляции устойчивости глиальных клеток к фотоиндуцированному апоптозу.

4. Изучить влияние этих межклеточных и внутриклеточных сигнальных механизмов на фотоиндуцированное прекращения импульсной активности механорецепторного нейрона.

Научная новизна результатов исследования

1. Впервые установлена важная роль процессов меж- и внутриклеточной сигнализации в выживаемости нейронов и глии рецептора растяжения рака при фотоокислительном стрессе. Показано, что эти сигнальные механизмы различаются в нейронах и глиальных клетках, а также неодинаковы при фотоокислительном стрессе и смерти клеток при аксотомии и изоляции.

2. Впервые обнаружено влияние нейротрофических факторов на нейроны и ГК ракообразных как в темноте, так и при ФД-воздействии. Продемонстрирована модуляция импульсной активности нейронов нейрегулином HRG1-в1 и влияние GDNF и NGF на устойчивость ГК к апоптозу, вызванному аксотомией или фотоокислительным стрессом.

3. Выявлено участие фосфолипазы С и внеклеточных белков-мишеней протеиназ в фотоиндуцированном апоптозе глиальных клеток. Обнаружено, что уровень импульсной активности нейронов влияет на устойчивость сателлитных ГК к проапоптозному действию фотоокислительного стресса.

4. Впервые показано, что фосфолипаза С, кальмодулин и кальмодулин-зависимая киназа II участвуют в ФД-индуцированном некрозе нейронов и глиальных клеток.

5. Показано влияние нейротрофического фактора NGF на фотоиндуцированный некроз глиальных клеток. Таким образом, продемонстрировано, что в процессах фотоиндуцированного некроза клеток механорецептора рака участвуют Са²⁺-зависимые сигнальные белки. Установлено, что в ФД-индуцированном торможении импульсной активности механорецепторного нейрона участвуют белки межклеточного матрикса и фосфолипаза С.

Научно-практическая значимость работы

Полученные данные о фотодинамическом повреждении нейронов и глиальных клеток могут быть использованы при разработке и оптимизации способов фотодинамической терапии опухолей мозга. Данные о фармакологической модуляции сигнальных процессов могут применяться для разработки методов повышения селективности ФД-воздействия в нейроонкологии и экспериментальной нейробиологии, позволяющих усилить фотоиндуцированную смерть перерожденных клеток и защитить нормальные нейроны и ГК. Результаты работы использованы при выполнении исследований по грантам РФФИ №02-04-48027 и 05-04-48440, а также в учебном процессе в спецкурсах по фотобиологии и фотомедицине, читаемых на кафедре биофизики и биокибернетики ЮФУ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Реакция нейронов и ГК механорецептора рака на фотодинамическое воздействие регулируется процессами меж- и внутриклеточной сигнализации, различающимися в нейронах и глиальных клетках. Фармакологическая модуляция сигнальных процессов может усиливать повреждение клеток или защищать их от фотоокислительного стресса.

2. В обеспечении устойчивости глиальных клеток рецептора растяжения рака к проапоптозному действию фотоокислительного стресса участвуют межклеточные и поверхностные белки-мишени протеиназ, нейротрофические факторы, фосфолипаза С и импульсная активность нейрона.

3. Фосфолипаза С, кальмодулин и кальмодулин-зависимая киназа II снижают устойчивость нейронов и глиальных клеток к некрозу, вызванному фотоокислительным стрессом, а NGF ее повышает.

4. В процессе функциональной инактивации механорецепторного нейрона при фотодинамическом воздействии участвуют белки внеклеточного матрикса и фосфолипаза С, а также нейрегулин HRG1-в1.

Апробация диссертационной работы. Материалы диссертации представлены на всероссийских и международных конференциях: «IV съезд фотобиологов России» (Саратов, 2005), «Биология - наука XXI века». 9-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 2005), «11^th Congress of the European Society for Photobiology» (Aix-Les-Bains, France 2005), «I съезд Физиологов СНГ» (Сочи, 2005), Колосовские чтения, (СпБ, 2006); 2-й Международный Междисциплинарный Конгресс, (Судак, Украина, 2006), «Glia in health and disease» (Cold Spring Harbor Laboratory, USA, 2006), «Simpler Nervous Systems» (Казань, 2006), «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), «Saratov Fall Meeting» (Саратов, 2007), «12th Congress European Society for photobiology» (London, England, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ. Личный вклад автора в опубликованном материале в среднем 50%, объем 2,5 п.л.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 192 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, методика, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 272 отечественных и зарубежных источника. Работа иллюстрирована 51 рисунком и 11 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводилось на рецепторе растяжения рака (РРР) Astacus leptodactilus (Рис. 1, А2) , состоящем из рецепторной мышцы (Рис. 1, Б1), на которой находятся механорецепторный нейрон (МРН) (Рис. 1, Б2) с отходящим от него аксоном (Рис.1, Б3), и сателлитной глиальной оболочкой вокруг него (Рис. 1, Б4). Общая схема опытов изображена на Рис. 1

Изолированный МРН генерирует потенциалы действия (ПД) (Рис. 1, Г4) 10-12 часов, частота ПД напрямую зависит от степени растяжения рецепторной мышцы. После изоляции РРР закрепляли в кювете с физиологическим раствором Ван-Харревельда (Рис. 1, В1).

ПД отводили внеклеточно с помощью присасывающегося к аксону стеклянного электрода (Рис. 1, В5), усиливали усилителем УУ-90 (Рис. 1, Г1) и непрерывно регистрировали их частоту. По частотограмме (Рис. 1, Г3) определяли время жизни МРН от начала облучения до прекращения ПД.

Рис. 1. Схема эксперимента по изучению ФД-воздействия на МРН и ГК

Рак: А1 - брюшная нервная цепочка, А2 - РРР, А3 - вырезаемые кусочки панциря, на которых крепится РРР.

Препарат: Б1 - механорецепторная мышца, Б2 - МРН, Б3 - аксон, Б4 - оболочка из сателлитных ГК

Установка: В1 - кювета, В2 - опытный РРР, В3 - контрольный РРР, В4 - регулятор растяжения рецепторной мышцы, В5 - присасывающиеся электроды, В6 - добавление фотосенсибилизатора или модификатора, В7 - лазер

Биопотенциалы: Г1 - усилитель, Г2 - импульсная активность опытного МРН, Г3 - частотограмма опытного МРН, Г4 - импульсная активность контрольного МРН, Г5 - частотограмма контрольного МРН.

Частота генерации импульсов контролировалась адекватно путем растяжения рецепторной мышцы (Рис. 1, В4). Для исследования влияния гиперактивности МРН на реакцию клеток на ФД-воздействие стимуляция осуществлялась путем неоднократного (до 10 раз) растяжения рецепторной мышцы, не допуская уменьшения частоты ПД ниже 10-15 Гц. После 1 часа активного функционирования МРН подвергали ФД-воздействию.

В каждую серию опытов входили: контроль, воздействие исследуемого модификатора, ФД-воздействие, сочетанное действие ФД-воздействия и модификатора. При ФД-воздействии после 20-30 минутной регистрации ПД в ванночку добавляли сенсибилизатор Фотосенс (Рис. 1, В6) (смесь ди-, три- и тетра-алюмофталоцианинов, НИОПИК, Москва) в концентрации 10^-7 М, инкубировали 30 мин и облучали 30 мин He-Ne лазером (ЛГН-111, 632,8 нм; 0,3 Вт/см²) (Рис. 1, В7).

Во всех сериях препараты инкубировались 7-8 часов (Uzdensky et al., 2005). После инкубации препараты флуорохромировались пропидиум иодидом и Hoechst-33342, промывались, фиксировались глутаральдегидом, заключались в глицерин и изучались на флюоресцентном микроскопе ЛЮМАМ И-3 (ЛОМО, Ленинград) с цифровой камерой Nikon Coolpix 995.

Пропидиум йодид, проникая в клетки с поврежденной плазматической мембраной, окрашивает ядра в красный цвет. Т.к. повреждение мембраны характерны для некроза, по красной окраске определялся этот тип смерти клеток. Hoechst-33342 придает хроматину сине-зеленую флуоресценцию, позволяя определить общее число клеток. На микрофотографиях определялось число ГК на единицу площади, процент некротических МРН и ГК, а также количество апоптозных ГК с фрагментированными ядрами, окружающих аксон (на протяжении 2 мм его длины).

Для исследования роли нейроглиальных взаимодействий в реакциях нейронов и ГК на ФД-воздействие в одной серии опытов РРР обрабатывали в течение 1 часа протеолитическими ферментами проназой (0,01%) и коллагеназой (0,02%), после чего препарат промывался и подвергался ФД-воздействие. В другой серии опытов в кювету с РРР за полчаса до облучения добавлялись нейротрофические факторы (НТФ) NGF (100 нг/мл), GDNF (10 нг/мл) и нейрегулин HRG1-в1 (10 нг/мл).

Для исследования роли фосфатидилхолин-специфичной фосфолипазы С (ФХ-ФЛС) использовался ингибитор D609 (7,5 мкМ), фосфатидилинозитол- специфичной фосфолипазы С (ФИ-ФЛС) - ЕТ-18 (20 мкМ), кальциевых АТФ-аз эндоплазматического ретикулума (ЭПР) - тапсигаргин (1 мкМ), кальмодулина (КМ) - флюфеназин (1 мкМ), кальмодулин-зависимой киназы II (КМК II) - KN-93 (2 мкМ). Эти вещества добавлялись за 15-30 мин до ФД-воздействия. Концентрации модификаторов были подобраны так, чтобы не вызывать инактивацию нейронов в темноте в течение нескольких часов. Контролем служили препараты, подвергшиеся только ФД-воздействию.

Статистический анализ результатов экспериментов проводился по t-критерию Стьюдента (Владимирский, 1983). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка.

Результаты исследования

Глиальные клетки. Сигнальные механизмы, регулирующие устойчивость ГК к апоптозу

Аксотомия и изоляция (АИ) после вырезания РРР способствовали апоптозу некоторых глиальных клеток. ФД-воздействие значительно усиливало этот процесс. В то же время, апоптоз МРН не наблюдался ни при ФД, ни при фармакологических воздействиях. На устойчивость ГК к апоптозу, вызванному изоляцией или фотосенсибилизацией, могут влиять нейроглиальные взаимодействия (Barres and Barde, 2000; Laming et al, 2000; Никколс и др., 2003). Они реализуются, в частности, с помощью поверхностных и межклеточных белков, сигнальных нейротрофических факторов и биоэнергетических процессов. Для изучения роли нейроглиальных взаимодействий в реакциях нейронов и глии на фотоповреждение в настоящей работе использовались протеолитические ферменты, нарушающие связи между этими клетками, НТФ, предположительно осуществляющие нейроглиальные взаимодействия, а также изучалось влияние интенсивного функционирования МРН, при котором быстро расходуются энергетические ресурсы.

В первой серии опытов расщепление межклеточных и поверхностных белков проназой увеличивало число апоптозных ГК в темновых условиях (Рис. 2). Однако обработка РРР проназой или коллагеназой повышала устойчивость ГК к проапоптическому эффекту последующего ФД-воздействия. Это указывает на участие внеклеточных белков-мишеней протеиназ в ФД-апоптозе.

Добавление GDNF и нейрегулина HRG1-в1, но не NGF, в темноте достоверно повышали уровень апоптоза ГК (Рис. 2). В препаратах РРР, подвергнутых ФД-воздействию, GDNF и NGF, но не HRG1-в1, защищали ГК от фотоиндуцированного апоптоза (Рис. 2).

Межклеточные сигнальные молекулы, такие как НТФ, запускают различные внутриклеточные сигнальные пути. В частности, их связывание с рецепторными тирозинкиназами активирует фосфолипазу С и стимулирует высвобождение Са²⁺ из ЭПР.

протеолитический белок фотодинамический устойчивость нейрон



Рис. 2. Воздействие факторов, модулирующих нейроглиальные взаимодействия, на устойчивость ГК к апоптозу, вызванному изоляцией и фотоокислительным стрессом; * p<0,05, ** p<0.01, **p<0,001

В проведенных опытах D609, ингибитор ФХ-ФЛС, не изменял устойчивость ГК к апоптозу при аксотомии и изоляции (АИ) или при ФД-воздействии. Но ЕТ-18, ингибитор ФИ-ФЛС, снижающий производство инозитол-3-фосфата (ИФ₃) и этим препятствующий выходу Са²⁺ из ЭПР, ослаблял апоптоз ГК после АИ или фотоокислительного стресса (рис. 3). Ингибитор Са²⁺-АТФазы ЭПР тапсигаргин, который также повышает [Са²⁺]_i, напротив, снижал устойчивость ГК к апоптозу после АИ, но не ФД-воздействия (рис. 3). Это указывает на участие Са²⁺-зависимой сигнальной системы в апоптозе ГК.

Рис. 3. Роль белков Са^2+-сигнальной системы в устойчивости ГК к апоптозу; * p<0,05, ** p<0.01, **p<0,001

Ингибирование КМ флюфеназином увеличивало апоптоз ГК после АИ, но не ФД-воздействия. KN-93, ингибитор КМК II, не влиял на апоптоз ГК, вызванный этими воздействиями (Рис. 3). Следовательно, апоптоз, индуцированный аксотомией и изоляцией, но не фотоокислительным стрессом, реализуется с участием КМ, но независимо от КМК II.

Важную роль в жизнедеятельности нейронов и глии играют энергетические процессы. В отличие от нейронов, ГК не реагируют на растяжение рецепторной мышцы. Но в проведенных опытах гиперактивация нейронов, вызванная серией повторных растяжений рецепторной мышцы, снижала ФД-индуцированный апоптоз ГК (Рис.2). Следовательно, импульсная активность МРН влияла на нейроглиальные взаимодействия в РРР и тем самым модулировала устойчивость ГК к фотоиндуцированному апоптозу.

Сигнальные механизмы, регулирующие устойчивость ГК к некрозу

ФД-воздействие, повреждающее мембранные структуры, приводило к некрозу примерно 60-70 % нейронов и глиальных клеток. Подобный эффект наблюдался при действии проназы, которая увеличивала некроз ГК в темноте и после ФД-воздействия (Рис. 4). Это говорит об участии внеклеточных белков-мишеней проназы в некротических процессах

Ингибирование ФИ-ФЛС с помощью ЕТ-18 снижало ФД-индуцированный некроз ГК (Рис. 4), но не влияло на некротические процессы, вызванные изоляцией. То есть, ИФ₃ способствует некрозу ГК, вызванному ФД-воздействием, но не АИ. D609, ингибитор другой изоформы ФЛС, не образующей ИФ₃, усиливал АИ-, но не ФД-индуцированный некроз ГК.

Ингибитор КМ флюфеназин не влиял на устойчивость ГК к некрозу в темноте, но повышал ее при ФД-воздействии (Рис. 4). KN-93, ингибитор КМК II, снижал некроз ГК при ФД-воздействии, но не в темноте, что свидетельствовало об участии КМК II в ФД-индуцированном некрозе ГК (Рис. 4). Вероятно, КМ и КМК II последовательно участвуют в процессах некроза ГК при фотоокислительном стрессе, но не после АИ.

Рис. 4. Влияние различных сигнальных путей на устойчивость ГК к некрозу; * p<0,05, ** p<0.01, ***p<0,001

Сигнальные механизмы, регулирующие численность ГК

ФД-воздействие повышало число ГК на единицу площади препарата (Табл.1.). Проназа (но не коллагеназа) снижала число ГК в темноте, предотвращая ФД-индуцированный глиоз, что указывает на участие межклеточных и поверхностных белков в этих процессах. Ингибирование КМ флюфеназином повышало число ГК в темноте, а ингибитор КМК II KN-93 предотвращал фотоиндуцированный глиоз. Следовательно, различные Са²⁺-зависимые белки участвовали в регуляции распределения ГК (Табл. 1).

Таблица 1

Влияние различных меж- и внутриклеточных сигнальных путей на плотность распределения ГК на 10000 мкм²

Воздействие	Контроль	Модулятор	ФД воздействие	ФД-воздействие + модулятор
	1	2	3	4
GDNF	35±2	36±2	37±2	36±2
NGF	38±4	37±2	46±3	40±3
HRG1-в1	35±2	32±2	35±2	42±4
Проназа	45±5	29±4 *1	47±4	31±2 **3
Коллагеназа	37±2	34±3	48±5	47±6
Гиперактивность	-	-	37±3	37±3
D609	38±4	35±1	44±3	39±3
ЕТ-18	44±3	42±2	48±4	48±4
Тапсигаргин	37±3	30±3	44±5	43±6
Флюфеназин	38±4	44±3 *1	45±3	44±3
KN-93	35±2	35±3	44±2	36±3 *3
*p<0,05, ** p<0.01, ***p<0,001

Нейроны

Сигнальные механизмы, регулирующие устойчивость МРН к некрозу

ФД-воздействие вызывало некроз МРН (Рис.5). ET-18, ингибитор ФИ-ФЛС, не действовал на фотоиндуцированный некроз МРН, в отличие от ГК. Это говорит о том, что фотоиндуцированный некроз нейронов, в отличие от глии, является ИФ₃-независимым. ФХ-ФЛС способствовал защите МНР от АИ-индуцированного некроза, как и в случае ГК (Рис. 5).

Рис. 5. Влияние различных сигнальных путей на устойчивость МРН к некрозу; * p<0,05, ** p<0.01, ***p<0,001

Ферменты Са²⁺-зависимого сигнального пути КМ и КМК II регулировали некроз МРН также, как ГК. Их ингибиторы флюфеназин и KN-93 не изменяли уровень некроза нейронов после АИ, но снижали его после ФД-воздействия (Рис.5). Вероятно, как и в глии, эти белки, последовательно участвовали в некрозе нейронов при ФД-воздействии.

Таблица 2

Влияние различных меж- и внутриклеточных сигнальных путей на продолжительность импульсации нейрона, мин.

Воздействие	Интактные	Модификатор	ФД воздействие	ФД-воздействие + модификатор
	1	2	3	4
HRG1-в1	290±40	320±10	20±5***1	11±2 *3
Коллагеназа	>400	>400	26±3 **1	18±2 *3
D609	390±30	36±12 ***1	17±2 ***1	15,5±2
ET-18	390±40	160±20 ***1	16±3 ***1	33±8 *3
* p<0,05, ** p<0.01, ***p<0,001

Сигнальные пути, регулирующие импульсную активность МРН

Изолированные МРН длительно (до 7-8 ч) генерировали ПД в темноте. ФХ- и ФИ-ФЛС участвовали в этом процессе, о чем говорит сокращение времени жизни МРН при их ингибировании (Табл. 2).

ФД-воздействие вызывало необратимое прекращение импульсации МНР за 15-20 мин (Рис. 1, Г2, Г3). Это время сокращалось под влиянием HRG1-в1 и коллагеназы, а ингибирование ФИ-ФЛС увеличивало его (Табл. 2). Возможно, длительность импульсации при ФД-воздействии регулируется различными межклеточными и/или поверхностными белками, ИФ₃ и НТФ

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенные опыты показали, что:

1) аксотомия с последующей изоляцией вызывает инактивацию нейронов, некроз МРН и ГК, а также апоптоз (но не глиоз) ГК, развивающиеся через 7-8 часов;

2) ФД-воздействие резко усиливает данные процессы и также вызывает увеличение плотности распределения ГК вокруг тела нейрона; 3) на эти процессы влияли гидролиз внеклеточных и поверхностных белков, НТФ, импульсная гиперактивность нейрона, а также разные изоформы фосфолипазы С и белки кальциевого сигнального каскада КМ и КМК II. Общая схема функционирования этих сигнальных путей изображена на Рис. 6.

При ФД-воздействии, гибель клеток происходит, в основном, из-за фотоокислительного стресса, вызванного интенсивной генерацией синглетного кислорода молекулами фотосенсибилизатора (Dougherty et al., 1998). Кроме того, одни и те же процессы в нейронах и глии могут опосредоваться разными сигнальными путями. Поэтому участие различных молекулярных механизмов было неодинаковым при темноте и при ФД-воздействии, а также могло различаться в нейронах и ГК.

Сигнальные пути, регулирующие устойчивость глии к апоптозу

Обработкой РРР проназой и коллагеназой защищала ГК от ФД-индуцированного апоптоза (Lobanov, Uzdensky, 2006). Вероятными мишенями этих протеиназ являются межклеточные и поверхностные белки (элементы межклеточного матрикса, адгезионные и сигнальные белки, а также ионные каналы, насосы и мембранные рецепторы). С их участием реализуются нейроглиальные взаимодействия, а их повреждение может изменить реакцию нейронов и глии на ФД-воздействие (Lobanov, Uzdensky, 2006). Снижение уровня апоптоза ГК могло быть связано с нарушением передачи молекулярных сигналов от нейронов к ГК, модулирующих выживание при ФД-воздействии (Kolosov, Uzdensky, 2006). Конкретные механизмы защиты ГК пока не известны. Не исключено, что протеолизу подверглись про-апоптические белки, аналогичные НТФ рецептору p75 (Kaplan et al., 1997). Также возможно протеолитическое разрушение глутаматдекарбоксилазы, участвующей в образовании глутамата из N-ацетиласпартилглутамата (NAAG) в межклеточной жидкости нервов рака, что предотвращает токсичность возбуждающих аминокислот (Urazaev et al., 2001; Gafurov et al., 2002) (Рис. 6).

Рис. 6. Схема различных меж и внутриклеточных сигнальных путей в системе «нейрон-глия», изучаемых в настоящей работе

Протеиназы - коллагеназа и проназа, ЕСМ - межклеточный матрикс, GDC - глутаматдекарбоксилаза, NAAG -N-ацетиласпартилглутамат HRG1-в1 и GDNF снижали устойчивость ГК к апоптозу в темноте, но только GDNF и NGF защищали ГК от фотоиндуцированного апоптоза. Возможно, у ГК речного рака есть рецепторы, способные активировать защитные пути при распознавании GDNF/NGF и HRG1-в1. Разнонаправленное влияние GDNF в темноте и при ФД-воздействии может быть связанно с тем, что в темноте активен один тип рецепторов, а при фотосенсибилизации - другой, либо происходит их инактивация. Такими рецепторами НТФ могут быть аналоги проапоптического рецептора p75, индуцирующего апоптоз в клетках млекопитающих (Kaplan et al., 1997) и тирозинкиназных рецепторов (Uzdensky et al., 2005). Тирозинкиназные рецепторы, как известно, могут реализовывать антиапоптозный эффект через TrkA-активируемую PI3/Akt-киназу, фосфорилирующие проапотический белок Bad, тем самым инактивируя его (Krauss, 2001).

НТФ, модулирующие выживание нейронов и ГК, хорошо изучены у млекопитающих, но пока мало исследованы у беспозвоночных животных. Аналоги НТФ обнаружены у некоторых червей и моллюсков, но не найдены у D. melanogaster и C. elegans. С появлением НТФ связывают возникновение сложной нервной системы позвоночных животных (MacKay et al.,1999). Данные об их присутствии в нервной системе ракообразных отсутствуют. Полученные результаты показывают влияние NGF, HRG1-в1 и GDNF на выживание ГК и МРН речного рака после АИ и ФД-воздействии. Возможно, у ракообразных есть рецепторы, распознающие НТФ или их аналоги.

В настоящей работе показана важная роль Са²⁺-зависимого сигнального пути, в котором участвует ФИ-ФЛС, генерирующая ИФ₃, который стимулирует высвобождение Са²⁺ из ЭПР (Крутецкая и др., 2003). Ингибирование ФИ-ФЛС значительно снижало уровень апоптоза ГК и в темноте, и при ФД-воздействии, что свидетельствует об участии ИФ₃ в процессах апоптоза ГК. Напротив, ингибирование ФХ-ФЛС, которая не образует ИФ₃ и не приводит к высвобождению Ca²⁺, не влияло на апоптоз ГК.

Ингибитор Ca²⁺-АТФазы ЭПР тапсигаргин, известный индуктор апоптоза (Treiman et al., 1998), индуцировал апоптоз ГК в темноте, что, вероятно было связанно с повышением [Ca²⁺]_i. Это подтверждает участие высвобождающегося из ЭПР Са²⁺ в апоптозе ГК, что согласуется с литературными данными об участии Са²⁺ в клеточной гибели (Verkhratsky et al., 1998; Sola et al, 1999). Отсутствие влияние тапсигаргина при ФД-воздействии может быть связано с тем, что фотоокислительный стресс и так приводит к повышению [Ca²⁺]_i (Oleinik et al., 2002), поэтому дополнительное ингибирование кальциевых насосов не может существенно увеличить уже существующую высокую [Ca²⁺] _i. Возможно также, Са²⁺-АТФ-азы могли быть повреждены ФД-воздействием или ФД-активированными каспазами (Granville et al., 2001).

Ионы Ca²⁺ могут влиять на клетку, активируя такие белки, как КМ. Его ингибирование флюфеназином в темноте, но не при ФД-воздействии, снижало устойчивость ГК к апоптозу. Это говорит о разных механизмах клеточной смерти в этих условиях. Т.к. ингибирование КМК II не изменяло устойчивость ГК к апоптозу после АИ, можно предположить участие пока не идентифицированного пути, опосредованного КМ, но не зависимого от КМК II (Bialik et al, 2004).

Энергетические взаимодействия между глией и нейронами является одним из компонентов нейроглиальных отношений (Laming et al., 2000). Интенсивное функционирование МРН приводило к снижению числа апоптозных, но не некротических сателлитных ГК, что свидетельствует о влиянии импульсной активности МРН на нейроглиальные взаимодействия. Это могло быть связано с перераспределением энергетических субстратов в системе «нейрон-глия». Недавно показано, что при повышении активации нейронов ГК транспортируют к ним лактат (Vega et al., 2003; Pellerin et al., 2003). Т.к. апоптоз весьма энергозависим (Sastry et al, 2000), то перераспределение энергетических субстратов от ГК к интенсивно функционирующему МРН могло привести к снижению энергетического статуса ГК и тем самым ослабить их апоптоз.

Молекулярные механизмы, регулирующие устойчивость ГК к некрозу

ФД-воздействие вызывает некроз и ГК, и МРН. Некроз - более неспецифичный и «хаотичный» вариант смерти клеток, чем апоптоз. В настоящей работе проназа, но не более специфичная коллагеназа, усиливала некроз ГК в темноте и при ФД-воздействии, что могло быть вызвано протеолитическим повреждением плазмалеммы. Некроз МРН при этом не наблюдался, возможно, из-за «экранирования» его глиальной оболочкой.

Нейротрофин NGF, но не GDNF и HRG1-в1, снижал фотоиндуцированный некроз ГК. Это также может быть связано с наличием в ГК разных типов рецепторов к НТФ. Отсутствие эффекта на МРН может быть связанно с тем, что рецепторы к NGF в нейроне отсутствуют, либо с тем, что глиальная оболочка «экранирует» нейрон от крупных молекул NGF.

Ингибирование ФИ-ФЛС, снижало некроз ГК при ФД-воздействии. Это указывает на участие в фотоиндуцированном некрозе глии ИФ₃-зависимого высвобождения Са²⁺ из ЭПР. Но этот эффект не проявлялся в МРН, что может говорить о том, что ФД-индуцированный некроз МРН, в отличие от ГК, является ИФ₃-независимым.

Ингибировании КМ флюфеназином при ФД-воздействие снижало некроз МРН и ГК, что указывает на участие КМ в некротических (но не апоптических) процессах при фотоокислительном стрессе. Ингибирование КМК II с помощью KN-93 действует на МРН и ГК аналогичным образом, снижая ФД-индуцированный (но не АИ-индуцированный) некроз. Можно предположить, что участие КМ в процессах фотоиндуцированного некроза было опосредовано КМК II (Uzdensky et al., 2007). Это согласуется с литературными данными, по которым Са²⁺/КМ/КМК II снижают активность лактатдегидрогеназы в деполяризованных нейронах млекопитающих, что характерно для некроза (Takano et al., 2003).

Возможный механизм пронекротического действия КМ/КМК II при ФД-воздействии может быть связан с токсичностью возбуждающих аминокислот. При КМК II-зависимом фосфорилировании NMDA-рецепторы сенсибилизируются к глутамату, что приводит к гиперповышению [Ca²⁺]_i и некрозу (Colbran, 2004).

Таким образом, полученные данные подтверждают накапливающиеся сведения о том, что некроз нейронов и ГК не является пассивным неуправляемым процессом, а может модулироваться различными сигнальными механизмами (Sintichaki et al., 2003).

Регуляция числа глиальных клеток на единицу площади

Увеличение числа ГК на единицу площади может быть результатом их усиленного деления в области ФД-повреждения или их миграции в район сомы. Проведенные эксперименты свидетельствуют об участии в этих процессах межклеточных и поверхностных белков, а также КМ и КМК II.

Сигнальные процессы, участвующие в генерации ПД

При ФД-воздействии коллагеназа достоверно сокращала время импульсной реакции нейрона на облучение, проназа также проявляла подобную тенденцию. Как предполагалось ранее, ФД-индуцированное торможение импульсации нейрона связано с повышением [Ca²⁺]_i (Uzdensky et al., 2000, 2003). Протеолитическое воздействие на белки метаботропных и ионотропных рецепторов, молекул адгезии и т.д. могло изменять концентрацию внутриклеточного кальция, а также нарушать работу систем поддержания ионных градиентов. (Lobanov, Uzdensky, 2006).

Ингибирование обоих типов ФЛС в темноте вело к сокращению продолжительности генерации ПД, что свидетельствует о важности и диацилглицерола и ИФ₃ в механизмах импульсной активности. Ингибирование ФЛС, генерирующей ИФ₃, вело к увеличению времени импульсации нейрона при ФД-воздействии. Таким образом, ФИ-ФЛС способствует увеличению времени жизни нейрона в темноте, но сокращает ее при фотоокислительном стрессе. Так как ионы Са²⁺, высвобождающиеся из ЭПР при функционировании ФИ-ФЛС, могут как защищать клетку, так и способствовать клеточной гибели, можно предположить, что в темноте и при фотоокислительном стрессе система кальциевой сигнальной трансдукции в нейронах выполняет различные функции, защищая МНР в темноте, но способствуя сокращению времени жизни при ФД-воздействии.

Сокращение времени импульсации при воздействии HRG1-в1 может объясняться наличием в МРН рецепторов, специфических к этому НТФ.

Таким образом, реакция МРН и ГК на фотодинамическое воздействие и изоляцию регулируется процессами меж- и внутриклеточной сигнализации, различающихся в МРН и ГК, а также отличающихся при фотоокислительном стрессе и гибели клеток при изоляции и аксотомии. Фармакологическая модуляция этих молекулярно-клеточных механизмов может модулировать действие фотоокислительного стресса на МРН и ГК. Общая схема участия этих процессов в гибели разных клеток РРР при различных условиях эксперимента изображена на рис. 7

Рис. 7. Участие меж- и внутриклеточных сигнальных путей в процессах гибели МРН и ГК

ВЫВОДЫ

1. Фотодинамическое воздействие вызывает некроз, апоптоз и увеличение плотности распределения глиальных клеток в изолированном рецепторе растяжения речного рака, а также некроз нейронов и сокращение продолжительности его импульсации.

2. Процессы фотоиндуцированной инактивации и смерти нейронов и глиальных клеток регулируются процессами меж- и внутриклеточной сигнализации. В нейронах и глиальных клетках сигнальные пути, регулирующие фотодинамическое повреждение, различаются. Фармакологическая модуляция сигнальных путей может усиливать повреждение клеток или защищать их от фотоокислительного стресса.

3. В ФД-индуцированном некрозе нейронов и глиальных клеток участвуют кальмодулин и кальмодулин-зависимая протеинкиназа II. Фосфотидилинозитол-специфичная фосфолипаза С, а также проназа способствуют фотоиндуцированному некрозу глии, но не нейронов. NGF обеспечивает защиту глиальных клеток, но не нейронов от фотоиндуцированного некроза.

4. Устойчивость глиальных клеток к ФД-индуцированному апоптозу повышается при разрушении межклеточных и поверхностных белков протеиназами, действии нейротрофических факторов NGF и GDNF, а также при ингибировании фосфотидилинозитол-специфичной фосфолипазы С или при напряженном функционировании нейронов.

5. В процессе ФД-индуцированного прекращения импульсации нейронов участвует фосфотидилинозитол-специфичная фосфолипаза С. Время фотоиндуцированной инактивации нейронов сокращается при действии нейрегулина HRG1-в1 и разрушении межклеточных и поверхностных белков коллагеназой.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В журналах, рекомендованных ВАК РФ

Lobanov A.V., Uzdensky A.B. PDT-induced death of sensory neurons and glial cells in the isolated crayfish stretch receptor after proteolytic treatment // J. Neurosci. Res. 2005. - V. 82. P.866-874. 0,33 п.л., личн. вк. 50%.

Uzdensky A, Lobanov A, Bibov M, Petin Y. Involvement of Ca(2+)- and cyclic adenosine monophosphate-mediated signaling pathways in photodynamic injury of isolated crayfish neuron and satellite glial cells // J. Neurosci Res. -2007. V. 85. P.860-870. 0,42 п.л., личн. вк. 45%.

Узденский А.Б., Колосов М.С., Лобанов А.В. Смерть нейронов и глиальных клеток, вызванная фотодинамическим воздействием: сигнальные процессы и нейроглиальные взаимодействия // Морфология, - 2007., т 132, №4, - С. 7-15, 0,4 п.л., личн. вк. 30%

Лобанов А.В. Узденский А.Б. Нейротрофин NGF защищает глиальные клетки, но не нейроны рецептора растяжения рака Astacus Astacus от фотоокислительного стресса // Журнал эволюционной биохимии и физиологии, -2007., т 43., №5, - С. 448-449. 0,05 п.л., личн. вк. 50%

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Лобанов А.В., Узденский А.Б. Кальмодулин защищает нейроны и глиальные клетки речного рака от смерти, вызванной аксотомией и изоляцией// Известия вузов. Сев.-Кав. Регион. -2007, №3. С. 65-68. 0,12 п.л, личн. вк. 50%

Колосов М.С., Лобанов А.В., Аулова С.А., Узденский А.Б. О роли межклеточных нейроглиальных взаимодействий в фотодинамическом повреждении рецептора растяжения рака// IV съезд фотобиологов России. Мат. Съезда. Саратов.- 2005. - P.81-83. 0,12 п.л., личн. вк. 30%.

Лобанов А.В., Брагин Д.Е., Узденский А.Б. Нейроглиальные взаимодействия при фотодинамическом повреждении рецептора растяжения рака// Мат. конф. «Биология - наука XXI века. 9-я Междунар. Пущинская школа-конференция молодых ученых».- 2005.- С. 84. 0,04 п.л., личн. вк. 40%.

Uzdensky A.B., Kolosov M.S., Bragin D.E., Lobanov A.V. Photodynamic injury of isolated crayfish stretch receptor: death of glial cells and neuroglial interactions// 11th Congress of the Eur. Soc. for Photobiology. Aix-Les-Bains, France, 2005, Р.62. 0,04 п.л., личн. вк. 25%.

Lobanov A.V., Petin Y.O., Uzdensky A.B. The role of Ca2+-related signaling in photodynamic injury of nerve and glial cells// Proc. SPIE, -2007. -V.6535. -P. 131-138. 0,3 п.л., личн. вк. 25%.

Лобанов А.В., Узденский А.Б. Реакция механорецепторных нейронов и сателлитных глиальных клеток рака на фотодинамическое воздействие при протеолитическом нарушении нейроглиальных взаимодействий // I съезд Физиологов СНГ, Сочи.-2005.-Т.2.-С.43. 0,04 п.л. личный вклад 50%.

Колосов М.С., Лобанов А.В., Аулова С.А., Узденский А.Б. Нейроглиальные взаимодействия при фотодинамическом повреждении рецептора растяжения рака // Проблемы нейрокибернетики. Ростов-на-Дону, Изд. ООО ЦВВР.- 2005.- Т.2. -С. 247-250. 0,12 п.л., личн. вк. 50%.

Uzdensky A., Kolosov, M., Bragin, D., Lobanov A.V. Neuroglial interactions and intercellular signaling during Photodynamic injury of isolated crayfish stretch receptor // FEBS J., 2005.- 272.- N3-082.-Р.47. 0,04 п.л., личн. вк. 25%.

Узденский А.Б., Лобанов А.В., Бибов М.Ю, Петин Я.О., Колосов М.С. Фотодинамическое повреждение нейронов и сателлитных глиальных клеток: нейроглиальные взаимодействия и сигнальные процессы // Второй Международный Междисциплинарный Конгресс, Судак, Украина. - 2005. - С.172. 0,04 п.л., личн. вк. 40%.

Uzdensky A., Kolosov M., Lobanov A.V., Bibov M.Y., Petin Y.O. Neuroglial interactions in isolated crayfish stretch receptor under photooxidative stress // Glia in health & disease. - Cold Spring Harbor Laboratory, USA. - 2006. - Р. 149. 0,04 п.л., личн. вк. 40%.

Lobanov A.V., Petin Ya.O., Bibov M.Yu., Uzdensky A.B. The involvement of calcium-, cAMP- and MAPK-dependent signaling pathways in response of isolated crayfish stretch receptor neuron and satellite glia to photodynamic impact// Simpler Nervous Systems. Kazan.-2006.- Р.47. 0,04 п.л., личн. вк. 35%.

Лобанов А.В. Узденский А.Б. Участие кальмодулина и кальмодулин-зависимой киназы II в реакциях нейронов и глии на фотодинамическое воздействие. // Мат. ХХ съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва, 2007, - С.310. 0,04 п.л. личн. вк 50%.

Лобанов А.В. Петин Я.О. Узденский А.Б. Роль Са2+-зависимых сигнальных путей в фотодинамическом повреждении нейронов и глиальных клеток // «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино. 2007- С. 88-90. 0,125 п.л., личн. вк. 50%.

Лобанов А.В. Петин Я.О. Узденский А.Б. Участие нейротрофических факторов в реакции нейронов и глиальных клеток рецептора растяжения речного рака на фотодинамическое воздействие// «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино. 2007- С. 88-90. 0,125 п.л., личн. вк. 50%.

Lobanov A., Uzdensky A. Modulation of photodynamic injury of crayfish neuronal and glial cells by neurotrophic factors// 12th Congress European Society for photobiology. Program and Book of abstracts. 2007 -P.155. 0,04 п.л., личн. вк 50%.

Lobanov A.V., Petin Y.O., Uzdensky A.B. Тhе effect of some mammalian neurotrophic factors on photodynamic damage to crayfish neurons and glial cells// Saratov Fall Meeting

Список научных сокращений

[Ca²⁺]_i - концентрация ионов Ca²⁺ в цитоплазме;

АИ - аксотомия и изоляция;

ИФ₃ - инозитол-3-фосфат;

ГК - глиальные клетки;

КМ - кальмодулин;

КМК II - кальмодулин-зависимая киназа II;

МРН - механорецепторный нейрон;

НТФ - нейротрофические факторы;

РРР - рецептор растяжения рака;

ПД - потенциалы действия;

ФД - фотодинамический;

ФИ-ФЛС - фосфатидилинозитол-зависимая фосфолипаза С,

ФХ-ФЛС - фосфатидилхолин-зависимая фосфолипаза С;

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

Размещено на Allbest.ru