Актуальность темы. В Пермском крае интенсивно проводятся рубки основных лесообразующих пород, что ведет к освобождению огромных площадей, на которых требуется проведение лесовосстановительных работ. Для осуществления успешного лесовозобновления и проведения лесокультурных мероприятий требуется значительное количество посадочного материала хвойных пород. Известно, что лесообразующие породы успешно растут при наличии условий, обеспечивающих микоризообразование. Древесные растения с хорошо развитыми микоризами лучше растут и приживаются при пересадке, меньше страдают от неблагоприятных воздействий, в меньшей степени подвержены инфекционным болезням (Шемаханова, 1962; Лобанов, 1971; Шубин, 1973; Селиванов, 1981).

В лесных питомниках образование микориз в значительной мере определяются применяемой агротехникой и эдафическими условиями.

Необходимость изучения микоризообразования у сеянцев хвойных пород в лесных питомниках Пермского края вызвана снижением качества посадочного материала и потерями от грибных болезней.

Цели и задачи исследования. Цель работы - изучение особенностей микоризообразования у сеянцев хвойных пород в лесных питомниках Пермского края в связи с высокой заболеваемостью и снижением качества посадочного материала; - разработка и апробация способов оптимизации микоризообразования.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Провести комплексное обследование и составить характеристику лесных питомников, включающую агрохимический анализ почв, анализ фитопатологического состояния посевов, таксономический и эколого-трофический состав грибов.

микоризообразование сеянец хвойная порода

2. Изучить особенности роста и микоризообразования у сеянцев ели в лесных питомниках, оценить качество посадочного материала с учетом микоризности сеянцев, проследить взаимосвязи между интенсивностью микоризообразования и жизненным состоянием растений.

3. Осуществить работы по выделению культур из карпофоров микоризообразующих грибов, поддержанию в жизнеспособном состоянии коллекции изолятов и получению накопительных культур для их использования в экспериментальных исследованиях по активизации микоризообразования в лесных питомниках.

4. Провести серию экспериментальных исследований по предпосевной обработке семян сосны и ели, инокуляции семян и сеянцев фитопатогенными и микоризными грибами и оптимизации микоризообразовательного процесса.

Положения, выносимые на защиту:

1. Длительное и бессменное выращивание хвойных пород в постоянных лесных питомниках привело к обогащению почвы микроскопическими грибами, к обеднению состава и снижению активности микоризообразующих грибов, что негативно отразилось на состоянии и качестве посадочного материала.

2. Использование нескольких параметров позволяет получить интегрированную оценку микоризообразовательного процесса. Комплексный подход к анализу микоризообразования позволяет вскрыть причины его нарушения и определить пути оптимизации.

3. Разнокачественность микоризообразования в лесных питомниках обусловлена изначальными различиями физико-химических свойств почвы, которые впоследствии усугубились проводимым комплексом агротехнических мероприятий в каждом конкретном хозяйстве. Важным признаком нарушения микоризообразования является отсутствие в большинстве питомников баланса между показателями роста и микоризности сеянцев. Оптимизация микоризообразования должна занять одно из важнейших мест в системе агротехнических и защитных мероприятий в постоянных питомниках, где выращиваются хвойные породы.

4. Способность многих микоризных грибов к росту в условиях культуры открывает возможности для получения накопительных мицелиальных культур и их применения в лесном хозяйстве для активизации микоризообразования при его нарушении.

Научная новизна. Впервые в регионе проведено комплексное обследование постоянных лесных питомников, включающее характеристику физико-химических свойств почв, фитопатологического состояния посевов и состава возбудителей болезней. Изучены особенности микоризообразования сеянцев, выявлен таксономический и эколого-трофический состав грибов.

На большом фактическом материале проведена сравнительная характеристика здоровых и больных сеянцев ели, имевших признаки инфекционного усыхания хвои, подтверждена защитная роль микориз.

Проверена способность к выделению в культуру у 47 видов микоризообразующих грибов, в результате получен рост мицелия у 31 вида. Создана коллекция культур микоризных грибов, отработана технология получения накопительных культур мицелия микоризных грибов на жидких средах и твердых субстратах. Проведено исследование влияния микоризных грибов на всхожесть семян ели и сосны, приживаемость всходов, на особенности роста и микоризообразования.

Практическая значимость. Разработана методика интегрированной оценки микоризообразования, которая вошла в рекомендации по оценке качества посадочного материала и снижения потерь от болезней в лесных питомниках Пермского края.

Результаты экспериментальных исследований, полученные на основе лабораторных и мелкоделяночных опытов, после апробации в производственных условиях могут быть рекомендованы для широкого использования.

Из созданной в процессе исследований коллекции культур микоризных грибов, культуры 14 видов были приняты во Всесоюзную коллекцию микроорганизмов (BKMF) Института биохимии и физиологии микроорганизмов.

Апробация работы. Результаты исследований представлены на конференции "Отражение достижений ботанической науки в учебном процессе естественных факультетов педагогических институтов" (Пермь, 1983), межвузовских конференциях молодых ученых и специалистов (Пермь, 1983; 1988), IV Всесоюзной конференции "Изучение грибов в биогеоценозах" (Пермь, 1988); научно-технической конференции по программе "Лес и земля Западно-Уральского Нечерноземья" (Пермь, 1988); V международной научно-технической конференции "Лес - 2004" (Брянск, 2004); научно-технической конференции, посвященной 160-летию Ф.А. Теплоухова (Пермь, 23 - 24 сентября 2005 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 15 статей и 5 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и приложения. Текст, включая приложения, изложен на 169 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц и 35 рисунков. Библиографический список включает 238 источников, в том числе 67 на иностранных языках.

Благодарности. Работа была задумана основателем и руководителем Пермской школы микосимбиотрофизма И.А. Селивановым. В дальнейшеем, руководство исследованиями взяла на себя Е.М. Шкараба, которой приношу глубокую благодарность. Также благодарю за помощь в идентификации видов микоризообразующих грибов Л.Г. Переведенцеву. Выражаю признательность д. б. н. старшему научному сотруднику Института Леса Кар НЦ РАН В.И. Шубину, научным сотрудникам лаборатории биохимии грибов БИН РАН Н.П. Беловой и О.А. Сивочуб и С. М Озерской, сотруднику Всесоюзной коллекции микроорганизмов за консультации по выделению и поддержанию культур микоризообразующих грибов.

Содержание работы

Глава 1. Микоризообразование в лесной зоне и его использование при лесовосстановлении

В главе дан обзор литературы по вопросам изучения микориз и микосимбиотрофии, которым посвящено огромное количество отечественных и зарубежных публикаций.

Глава 2. Методика исследования

Основные исследования проводились в 8 постоянных лесных питомниках, расположенных в различных лесорастительных условиях. Почвенные образцы на агрохимический анализ отбирались по стандартной методике (Аринушкина, 1970). Фитопатологическое обследование посевов ели, и учет больных сеянцев осуществлялись в соответствии с рекомендациями ВНИИЛМа (1982). Использовались методы микроскопических исследований пораженных органов и спороношений грибов, влажной камеры, изоляции и выращивания грибов на питательных средах (Наумов, 1937; Чумаков, 1974; Хохряков, 1979; Билай, 1982).

Комплексное микологическое обследование почв проведено в Лысьвенском, Кишертском и Осинском питомниках. Изучение макромицетов, заселяющих почвы питомников, осуществлялось путем наблюдений и сбора плодовых тел, их описания, гербаризации и идентификации.

Отбор почвенных образцов на микологический анализ велся с посевных отделений и паровых полей по общепринятым методикам (Красильников, 1936; Литвинов, 1969). Оценка заселенности почв микроскопическими грибами осуществлялась тремя методами: учета грибных зачатков в навеске почвы под микроскопом, посева почвенной суспензии в различных разведениях на питательные среды и посева измельченной и просеянной почвы на голодный агар (Звягинцев, 1966; Мирчинк, 1976). Проверка правильности идентификации почвенных микромицетов осуществлена на кафедре микологии и альгологии МГУ при неоценимой помощи Л.Л. Великанова.

Для изучения особенностей роста и микоризообразования отбирали двулетние сеянцы ели в производственных посевах 8 лесных питомников. Для сравнения отбирали здоровые и больные растения, имевшие признаки инфекционного усыхания хвои. Объем выборки составил по 100 растений с каждого поля. При морфологическом анализе измеряли высоту стебля и длину корневой системы, подсчитывали количество сосущих корневых окончаний и образовавшихся микориз. Количественные параметры статистически обрабатывались. Особенности анатомического строения микориз и сосущих корешков, не преобразованных в микоризы, изучали на микропрепаратах поперечных срезов, изготовленных на микротоме с замораживающим устройством.

Экспериментальная работа осуществлялась по следующим направлениям:

1. Выявление источников инфекции в патогенезе усыхания хвои сеянцев ели, изучение вирулентности отдельных видов микромицетов, выделенных из тканей больных растений.

2. Выделение культур из плодовых тел микоризообразующих грибов, создание и поддержание коллекции мицелиальных культур, подбор питательных сред и получение мицелиальной массы на различных субстратах.

3. Постановка лабораторных и полевых опытов по оптимизации процессов роста и микоризообразования сеянцев ели и сосны с использованием микроэлементов, стимуляторов роста, биопрепаратов и культур микоризных грибов.

Глава 3. Характеристика лесных питомников Пермского края

По данным Федерального Агентства лесного хозяйства Пермской области и Коми-Пермяцкого автономного округа на 1.01.2003 в регионе действовало 74 питомника: 49 временных, 16 постоянных и 9 под пленкой. Основные площади заняты под елью, которая выращивается во всех постоянных и большинстве временных питомников. В подавляющем большинстве лесных питомников преобладают подзолистые и дерново-подзолистые почвы различного гранулометрического состава, лишь для Кишертского характерны оподзоленные черноземы. В большинстве питомников преобладают сильно кислые почвы с низким содержанием гумуса.

Из грибных болезней наиболее ощутимые потери вызывают фацидиоз, обыкновенное шютте сосны и усыхание хвои ели, вызываемое группой видов условно-патогенных несовершенных грибов, заселяющих растительные остатки и почву.

Инфекционный характер усыхания хвои у сеянцев ели был подтвержден экспериментально в серии опытов, поставленных на опытном участке, где ранее хвойные породы не выращивались. В качестве источников инфекции использовались почва и хвоя усохших сеянцев ели из посевных отделений Кишертского, Осинского и Лысьвенского питомников.

Во всех опытных вариантах отмечен высокий уровень заболеваемости, при этом больные растения имели сходные признаки заболевания - пожелтение хвои с последующим усыханием. Более высокая интенсивность поражения растений наблюдалась при инокуляции почвой. Из хвои больных и погибших растений регулярно выделялись Alternaria tenuis, Botrytis cinerea и Cladosporium herbarum. Способность этих грибов вызывать усыхание хвои ели была подтверждена в эксперименте. Заражение всходов суспензией спор указанных видов вызвало массовую гибель растений. Общая гибель сеянцев за год в этих вариантах превысила 80%.

Пределы колебаний численности грибных зачатков в почвах лесных питомников составили от 2,1 до 28,5 тысяч шт. в 1 г почвы. Наиболее высокая численность грибов отмечена в Кишертском (28,5), самые низкие показатели характерны для почв Осинского (5,8), а Лысьвенский питомник занимает промежуточное положение - количество грибных зачатков составляет 13,4. Прослеживается прямая зависимость численности грибных зачатков от содержания гумуса.

Из почв лесопитомников изолировано 116 видов микроскопических грибов из 30 родов. Всего удалось идентифицировать 64 вида. Самые многочисленные роды: Penicillium - 20 видов, Fusarium - 7, Trichoderma - 6, Acremonium - 6, Verticillium - 3, Gliocladium - 4, Mucor - 4, Mortierella - 3.

В отличие от состава микроскопических грибов, обильно заселяющих почву, состав напочвенных макромицетов сильно обеднен по сравнению с лесными сообществами. На территории питомников обнаружено 32 вида агарикоидных базидиомицетов, из них 15 - микоризообразователей. Столь бедный видовой состав микоризных грибов можно объяснить окультуриванием почвы, внесением высоких доз удобрений, применением пестицидов, удалением верхних горизонтов почвы.

Глава 4. Особенности роста и микоризообразования у сеянцев ели в лесных питомниках Пермского края.

В естественных условиях и в посевах на почвах, недавно вышедших из-под леса, где имеется большой набор эффективных микоризообразователей, параметры роста сеянцев и обилие на их корнях микориз положительно коррелируют между собой. Изменение этого баланса происходит при применения удобрений и пестицидов, а также других агротехнических мероприятий (Шубин, 1973). По результатам анализа сеянцев ели из лесных питомников Пермского края вырисовывается достаточно пестрая картина взаимосвязей между интенсивностью роста и обилием микориз (рис.1).

Рис.1. Отношение показателей роста и микоризообразования двулетних сеянцев ели (1 - Кудымкарский, 2 - Чайковский, 3 - Осинский, 4 - Кишертский, 5 - Соликамский, 6 - Красновишерский, 7 - Лысьвенский, 8 - Березниковский)

Положительная корреляция, проявляющаяся в средних показателях роста и плотности микориз, прослежена в Соликамском, Красновишерском, Лысьвенском питомниках. В Кудымкарском и Осинском питомниках низкие показатели роста стебля коррелировали с низкой интенсивностью микоризообразования. Сеянцы из Березниковского питомника отличались низкорослостью и высокой плотностью микориз. Обратная зависимость выявлена в Кишертском и Чайковском питомниках, где крупномерные сеянцы имели слабо развитые микоризы. Ни в одном питомнике не выявлена прямая зависимость между количеством микориз и мощностью корневой системы. Столь большой разброс вызван разнообразными причинами. Лесные питомники были заложены на почвах, различных по гранулометрическому составу и плодородию, поэтому на каждом из них изначально имелись неодинаковые условия для роста и образования микориз. Впоследствии эти различия усугубились проводимым комплексом агротехнических мероприятий в каждом конкретном хозяйстве.

Применение нескольких оценочных параметров позволяет дать интегрированную оценку микоризообразовательного процесса в лесных питомниках (рис.2). Отношение количества микориз к числу сосущих окончаний, отражает взаимосвязь между потенциальными и реальными возможностями микоризообразовательного процесса в лесных питомниках.

Рис.2. Микоризообразование двулетних сеянцев ели в лесных питомниках (1 - Чайковский, 2 - Кудымкарский, 3 - Красновишерский, 4 - Березниковский, 5 - Соликамский, 6 - Лысьвенский, 7 - Осинский, 8 - Кишертский).

Этот показатель вскрывает резервы микоризообразования и возможные направления оптимизации этого процесса. Если в Чайковском и Кудымкарском питомниках низкая интенсивность микоризообразования обусловлена угнетением развития потенциальных микориз в виде сосущих боковых окончаний, то в Кишертском и Осинском питомниках наиболее вероятной причиной является слабая активность микоризообразующих грибов. И в том и в другом случаях налицо нарушение микоризообразования и, как следствие, снижение его интенсивности, однако различие факторов, вызывающих это нарушение, предполагает использование различных приемов оптимизации. В питомниках, где в микоризы преобразовалось менее половины сосущих корешков, можно ожидать положительный эффект от применения дополнительной микоризации. Слабое развитие сосущих корешков указывает на необходимость активизации микосимбиотрофии за счет использования агротехнических приемов, усиливающих ветвление корней и образование сосущих корешков.

Сравнительный анализ здоровых и больных растений показал, что заболеваниям в большей степени подвержены сеянцы с ослабленным микоризообразованием. Здоровые сеянцы значительно превосходили больные растения по параметрам роста и количеству микориз. Различия между здоровыми и больными растениями проявились также в анатомической структуре микоризных окончаний. У больных растений мицелиальные чехлы развиты слабее, они тоньше, чем у здоровых сеянцев, что также свидетельствует об ослаблении микоризообразования.

Глава 5. Получение культур микоризообразующих грибов для их использования в интенсификации микоризообразовательного процесса

В экспериментальную группу вошли 47 видов потенциальных микоризообразователей. Первичный рост инокулюма удалось получить у 31 вида. За период с 1982 по 1987 годы, из 1219 повторностей было получено 114 изолятов, что составляет 64,6% от количества исследованных видов. При этом 86 изолятов принадлежат к 11 относительно постоянно выделяющимся видам, а 28 - к 20 видам с очень медленным ростом, которые при пересеве часто не возобновляли рост. Таким образом, по способности к образованию культурального мицелия выделилось три группы грибов: а) виды, у которых рост мицелия не наблюдался; б) виды с очень медленным ростом; в) виды, относительно легко выделяемые в культуру.

Следующим этапом работы явилось получение накопительных культур на жидких и твердых средах для постановки опытов по оптимизации микоризообразования у сеянцев хвойных пород.

На жидких средах Мелина и Мозера с использованием качалок для перемешивания и встряхивания жидкости испытывались культуры 10 видов грибов (табл.1). Более приемлемой оказалась среда Мелина, на которой хорошо росли культуры всех видов маслят, свинушки тонкой, мухомора красного и лаковицы. Остальные виды отличались более медленным ростом.

Таблица 1.

Интенсивность роста грибов на жидких средах

Твердыми субстратами для создания накопительных культур служили вермикулит, керамзит и торфяная крошка. На минеральных субстратах приживался и успешно рос лишь мицелий мухомора красного. На торфяной крошке росли культуры 5 видов: Мухомор красный, Лаковица лаковая, Масленок лиственничный, М. настоящий, Свинушка тонкая. Интенсивный рост наблюдался у лаковицы и свинушки. Мицелий этих грибов быстро осваивал среду, что позволило получать необходимое количество материала для постановки опытов.

Глава 6. Оптимизация процессов роста и образования микориз у сеянцев сосны и ели

В серии лабораторных и полевых опытов по влиянию предпосевной обработки на всхожесть семян и приживаемость всходов испытывались следующие препараты: растворы солей, содержащих микроэлементы; фунгициды, рекомендуемые для протравливания семян; водные вытяжки из плодовых тел трутовых и микоризных грибов; культуральная жидкость и мицелий микоризообразующих грибов. В опытах использовались семена сосны и ели из партий, предназначенных для посева в лесных питомниках.

Предпосевная обработка семян фунгицидами и вытяжками из плодовых тел трутовых и микоризных грибов не отразилась на энергии прорастания и всхожести семян. Положительный эффект от применения микроэлементов и стимуляторов роста проявился только в условиях оптимальной влагообеспеченности в период прорастания семян. В опытах с применением микоризных грибов прослежено их влияние на всхожесть семян и приживаемость сеянцев в условиях полевого опыта (табл.2)

Таблица 2

Влияние микоризных грибов на всхожесть семян и приживаемость сеянцев ели

Опыт показал, что существенное значение имеет не только вид используемого гриба, но и способ внесения микоризного инокулюма. Обработка семян мицелиальной суспензией лаковицы и мухомора, выращенных на агаризованном пивном сусле, привела к снижению всхожести до 73% по сравнению с контролем. В то же время инокуляция семян мицелиальными суспензиями с жидкой среды этих же видов положительно отразилась на показателях всхожести, которые превысили контроль соответственно на 137,5 и 114,8%. Повышение всхожести наблюдалось и при внесении в посевные строчки мицелия лаковицы и свинушки, выращенного на торфе. Во всех вариантах, исключая инокуляцию мицелием с агаризованной среды, в сравнении с контрольными делянками была значительно выше приживаемость сеянцев в течение первого года жизни. Положительный эффект от микоризации сохранялся длительное время. Пятилетние растения из опытных вариантов отличались более высоким количеством микоризных окончаний по сравнению с контролем.

В лабораторном опыте с соблюдением условий стерильности установлена симбиотическая связь с Лаковицей лаковой и прослежено образование микоризы у сосны и ели. Экспериментально подтверждена способность Лаковицы лаковой образовывать микоризы с хвойными породами.

В опытах по влиянию дополнительной микоризации на рост сеянцев и образование микориз испытывались лесная почва, мицелий лаковицы и свинушки, выращенных на торфе.

Внесение лесной почвы на опытные делянки в условиях Кишертского питомника не отразилось на высоте стебля у сеянцев сосны и ели, но усилило развитие сосущих окончаний и образование микориз. После трехлетнего выращивания у сеянцев ели сохранился положительный эффект от дополнительной микоризации, он составил 180% микоризных окончаний от контроля. В полевом опыте на экспериментальном участке биостанции В-Кважва проведено испытание результативности дополнительной микоризации внесением в почву мицелия лаковицы и свинушки, выращенного на торфяной крошке (табл.3).

Для оценки эффективности действия внесенных в почву микоризообразующих грибов использовались те же показатели, что и в опыте с дополнительной микоризацией лесной почвой.

Таблица 3.

Влияние дополнительной микоризации на рост и микоризообразование двулетних сеянцев сосны и ели (по данным полевых опытов)

Внесение мицелия лаковицы и свинушки заметно стимулировало развитие корневой системы в целом, и в особенности образование боковых сосущих окончаний у сосны и ели. Повышение потенциальных возможностей микоризообразования обеспечило рост количества образовавшихся микориз в сравнении с контрольными вариантами. При этом более отзывчивой на микоризацию лаковицей оказалась ель.

Выводы