Сравнительная характеристика структурных компонентов и метаболических процессов в легочной ткани в норме и на фоне хронического воздействия сероводородсодержащего газа (экспериментальное исследование)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Сравнительная характеристика структурных компонентов и метаболических процессов в легочной ткани в норме и на фоне хронического воздействия сероводородсодержащего газа (экспериментальное исследование)

03.03.04 - клеточная биология, цитология и гистология

Чекунова Ирина Юрьевна

Астрахань - 2010

Работа выполнена на кафедре гистологии и эмбриологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Наумова Любовь Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Смирнов Алексей Владимирович

доктор биологических наук Родзаевская Елена Борисовна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Ставропольский государственный университет

Защита состоится «26» марта 2010 года в 15-00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

Автореферат разослан 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Ю.В. Нестеров.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Нарастающие темпы научно-технического прогресса вызывают массу проблем в вопросах охраны окружающей среды, в профилактике и лечении экологически обусловленных заболеваний. Безотходные технологии химической, нефтеперерабатывающей и газовой промышленностей являются реальностью далекого будущего, а в настоящее время именно они возглавляют список самых вредных производств (Резаев А.А. с соавт., 1998, Агаджанян Н.А. с соавт., 2000, Трубников Г.А. с соавт., 2000, 2002, Кузьмина Л.П., 2008, Мадаева И.М. с соавт., 2009).

Активно функционирующий в Астраханской области газоперерабатывающий комплекс стал основным источником загрязнения атмосферы за счет регулярного выброса продуктов переработки газа и его конденсата. Большое количество людей, прежде всего рабочие и жители прилежащих населенных территорий, оказываются в зоне продолжительного воздействия сероводородсодержащего газа, концентрация которого в окружающем воздухе чаще всего не превышает предельно допустимой (ПДК). Распространенность бронхолегочной патологии среди людей перечисленных категорий, многими исследователями рассматривается как результат негативного влияния природного газа (Великанов Э.Б., 1994, Орлов М.А., 1996, Воробьева Т.Б. с соавт, 2000, Бучин В.Н. с соавт., 2000, Ломтева Т.Ф., 2002, Бучина А.В., 2004, Наумова Л.И., 2008, Шишкина Т.А., 2008, 2009).

Длительное воздействие сероводородсодержащего газа вследствие прямого раздражающего эффекта формирует воспалительный процесс в легких с активацией целого комплекса стандартных защитных механизмов. Декомпенсация систем антирадикальной, антипротеазной, специфической и неспецифической иммунной защиты приводит к стойким нарушениям структурной организации компонентов легочной ткани и формированию хронического патологического процесса (Прокофьев В.Н. с соавт., 1995, Резаев А.А. с соавт., 1998, Кочеткова Е.А. с соавт., 2004, Постникова Л.Б. с соавт., 2004, Тризно Н.Н. с соавт., 2005, Жестков А.В. с соавт., 2008). Длительное течение с неяркой клинической симптоматикой создает массу проблем в своевременной диагностике и предупреждении серьезных осложнений хронического бронхита, что объясняет широкую распространенность этого заболевания среди рабочих и высокий процент потери трудоспособности (Гамбарян М.Г. с соавт, 2006, Вермель А.Е., 2007, Величковский Б.Т., 2008).

Необходимость понимания процессов на уровне доклинических проявлений заболевания, связанных со снижением функциональных резервов, обеспечивающих резистентность организма к влиянию вредных факторов внешней среды, подтверждает важность изучения в пульмонологии нереспираторных функций легких. Идентификация признаков нарушения метаболического равновесия позволяет определить выраженность течения воспаления и репарации в легких.

Несмотря на большое количество исследований, проводимых в этой области, работ с морфологическим обоснованием патогенетических механизмов развития бронхолегочной патологии не достаточно. Необходимость изучения метаболической функции во взаимной связи со структурными преобразованиями легочной ткани является весьма актуальной и перспективной в плане возможного использования результатов исследования при разработке комплекса профилактических мероприятий на экологически вредных производствах.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Выявить динамику и взаимосвязь морфологических показателей структурных компонентов и метаболических процессов в легочной ткани в условиях хронического воздействия сероводородсодержащим газом в концентрации 3 мг/м³.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Дать характеристику структурной организации легочной ткани и микроциркуляторного русла лабораторных животных в норме и в разные сроки хронического воздействия сероводородсодержащего газа.

2. Оценить гистохимическую картину (метаболизм липидов, белков и углеводов) в структурах легочной ткани лабораторных животных в норме и в разные сроки хронического воздействия сероводородсодержащего газа.

3. Провести метаболический анализ следующих биохимических показателей крови: общего белка, альбуминов, глобулинов, молочной и пировиноградной кислоты, липопротеидов низкой плотности, липопротеидов очень низкой плотности, липопротеидов высокой плотности, общего холестерина, триглицеридов в норме и в разные сроки хронического воздействия сероводородсодержащего газа.

4. Определить зависимость между морфофункциональными изменениями и активностью метаболических процессов в структурах легочной ткани лабораторных животных в норме и в разные сроки хронического воздействия сероводородсодержащего газа.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. Впервые исследована морфология структурных и метаболических изменений легочной ткани в динамике на фоне хронического воздействия сероводородсодержащим газом в концентрации, не превышающей ПДК.

Впервые дано морфологическое обоснование преобразованиям микроциркуляторного русла в зависимости от длительности воздействия сероводородсодержащего газа.

Дана характеристика тканевому обмену в легких в зависимости от срока ингаляции природным газом низкой концентрации.

По результатам исследования проведена оценка структурных и метаболических показателей в зависимости от состояния микроциркуляторного русла на разных сроках воздействия природным газом в концентрации по сероводороду 3 мг/м³.

Выявлена взаимосвязь и проведена корреляция между данными морфологических, гистохимических и биохимических показателей в динамике хронического эксперимента.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Работа носит фундаментальный характер и представляет динамическую морфофункциональную характеристику структурных элементов легочной ткани крыс в норме и на фоне длительного воздействия сероводородсодержащего газа. Полученные данные позволяют выявить особенности структурных и метаболических преобразований в зависимости от срока хронического эксперимента и продемонстрировать негативное влияние длительно действующего природного газа с допустимой концентрацией сероводорода на состояние дыхательной системы. Практическая значимость работы заключается в том, что она позволяет значительно расширить существующие представления о механизмах развития экологически обусловленной патологии бронхолегочной системы и подвести морфологическую базу для объяснения некоторых клинических и диагностических проявлений заболеваний органов дыхания. Разработанный комплексный подход дает возможность не только в деталях охарактеризовать гистологические и гистохимические изменения в тканях легких, но и представить общую картину взаимодействующих процессов.

Полученные данные внедрены для преподавания соответствующих разделах гистологии, патологической и нормальной физиологии, патологической анатомии, биохимии. Результаты исследования могут быть использованы в написании монографий, руководств по пульмонологии, токсикологии и патологической анатомии и служить в качестве методической основы для последующих исследований в этой области.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Степень структурных и метаболических изменений в легких зависит от длительности воздействия природным газом в предельно допустимой концентрации.

2. Длительное воздействие сероводородсодержащего газа в предельно допустимых концентрациях вызывает изменение биохимических показателей крови (общего белка, количества альбуминов, общего холестерина, липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП), триглицеридов, молочной и пировиноградной кислоты) сопоставимых с динамикой метаболических процессов в структурах легких.

3. Длительное влияние природного газа в концентрации по сероводороду 3мг/м³ вызывает стойкие структурные изменения в легких, сохраняющиеся в течение месяца после прекращения его воздействия.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Результаты работы доложены и обсуждены:

на конференции «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в вузе», посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина, Москва, 2007; на международной научной конференции, посвященной 450-летию города Астрахани, Астрахань, 2007; на ХІІ Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Паттайя, Таиланд, 5 - 9 декабря 2007 г; на IX Конгрессе Международной Ассоциации Морфологов, г. Бухара, респ. Узбекистан, 14 - 17 мая, 2008г.; на коференции, посвященной 90-летию АГМА, 2008г.; на IV Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов, Саратов, 23 - 25 сентября 2009.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Дисертация изложена на 141 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Указатель литературы включает в себя 145 отечественных и 40 иностранных источников. Работа содержит 9 таблиц, 94 рисунков из которых, 88 фотографий и 6 графиков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Работа представляет собой экспериментальное комплексное исследование, выполненое на 320 беспородных крысах, самцах массой 180 - 220 г., прошедших карантин в течение месяца в специальном помещении вивария и в дальнейшем находящихся на стандартном лабораторном содержании. Протокол экспериментов в разделах выбора, содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта был составлен в соответствии с принцами биоэтики, правилами лабораторной практики (GLP); он соответствует этическим нормам, изложенным Женевской конвенции (1971), «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и в соответствии с приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003, «Об утверждении правил лабораторной практики», (Минздрав ССР № 755 от 12.08. 1977), а также положениями «Хельсинской Декларации по вопросам медицинской этики» и «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1989). Проведение экспериментальных исследований было оценено этической комиссией (заключение №3 от 25.09.2009)

Моделирование воздействия сероводородсодержащего газа проводилось путем помещения животных на 4 часа в специальные затравочные камеры производства Московского института профзаболеваний и гигиены труда им. Эрисмана объемом 200 литров. Все животные были распределены на 6 групп. Экспериментальные группы подвергались воздействию природного газа в концентрации 3мг/м³ по сероводороду на протяжении 5 дней в неделю в течение 1, 2, 3 и 4 месяцев. В пятую группу были включены животные для изучения восстановительных возможностей бронхолегочной системы через месяц после окончания воздействия. Контролем служили крысы того же возраста, находившиеся в стандартных условиях вивария.

По истечении каждого срока эксперимента животным вводили внутрибрюшинно этаминал натрия в концентрации 40 мг/кг массы. После фиксации извлеченных органов 10% нейтральным формалином приготавливались парафиновые блоки. Обзорные гистологические препараты получали путем окраски срезов толщиной 5-10 мкм гематоксилином и эозином. Коллагеновые волокна выявляли окраской по Ван Гизон, состояние гладкой мышечной ткани сосудистой стенки окраской ГОФП. Анализ тканевого обмена в легких проводился путем полуколичественного метода гистохимических реакций на белок прочным зеленым методом Шаффера (1957), углеводы ШИК-реакцией по Мс Manus (1946) в модификации Hotchkiss (1948), липиды Суданом ІІІ (по Лилли Р., 1969).

Для выявления изменения сосудистой проницаемости в сосудистое русло вводился 0,3%-ый раствор акридинового оранжевого с последующей люминесцентной микроскопией легочных микрососудов.

Использование количественных морфологических методов в данном исследовании было продиктовано, прежде всего, необходимостью сравнения динамики качественных и количественных изменений в структурах легочной ткани в ответ на хроническое воздействие сероводородсодержащим газом. В соответствии с принципами системного количественного анализа (Автандилов Г.Г., 1996, 2002) исследовались толщина сосудистой стенки, альвеолярной перегородки, бронхиальной стенки, воздушность легочной ткани, интенсивность клеточной интоксикации.

Для оценки интенсивности гистохимических реакций применяли условные обозначения: (0) -- отсутствие окрашивания; (±) -- сомнительный результат; (+) -- слабое окрашивание; (++) -- среднее окрашивание; (+++) -- интенсивное окрашивание (К. Великан и Д. Великан, 1963; С.С.Касабьян,1961).

Для оценки метаболических изменений были выбраны следующие биохимические показатели крови: содержание общего белка и его основных фракций определялись методом электрофоретического разделения на бумаге, общего холестерина, липопротеидов низкой плотности, липопротеиды очень низкой плотности, липопротеидов высокой плотности и триглицеридов на автоматическом анализаторе «Union Carbaite» (Швеция), концентрация молочной кислоты с помощью колориметрирования методом Л.Г. Смирновой (1960) и пировиноградной кислоты методом Ю.Б. Филипповича (1982).

Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента - (t). Вычисляли среднее арифметическое выборочной совокупности (М), ошибку среднего арифметического (m), среднее квадратичное отклонение (у). Достоверность различия определяли в каждой серии по отношению к исходному значению (р). Результаты опытов статистически обработаны с помощью Microsoft Exсel «Биометр».

Результаты исследования и их обсуждение.

Результаты, полученные в процессе хронического эксперимента, свидетельствуют о явном негативном влиянии предельно допустимых концентраций сероводородсодержащего газа на респираторную систему животных. Сравнительный анализ морфологических показателей легких был проведен путем детального изучения серии гистологических препаратов, соответствующих каждому этапу эксперимента. Последовательность изменений, отражающих динамику процесса, сравнивалась по ряду параметров с каждым предыдущим сроком. За основу были приняты следующие показатели: воздушность легочной ткани, толщина сосудистой стенки, диаметр сосуда, форма и размеры бронхов, толщина альвеолярной стенки. Метаболическая функция оценивалась по результатам гистохимических исследований и биохимических показателей крови. Анализ гистохимических показателей проводился путем сравнения интенсивности цветовых реакций, отражающих количество содержащегося вещества. В биохимических исследованиях оценивалось содержание ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП, общего ХС, ТГ, общего белка, альбуминов, молочной и пировиноградной кислот в каждом сроке хронического эксперимента.

В обзорном исследовании гистологических препаратов, окрашенных гематоксилин-эозином, в контрольной группе животных видны типичного строения бронхи с хорошо выраженной складчатостью слизистой оболочки. Высокий призматический эпителий четко отделен от подлежащей собственной пластинки непрерывной границей. Проходимость бронхов не нарушена. В гомогенно окрашенной мышечной оболочке продолговатые ядра гладких миоцитов занимают строго циркулярное расположение. В пределах одного поля зрения воздушность легочной ткани и распределение клеток межальвеолярного матрикса имеют равномерный характер. В просвете кровеносных сосудов кровь, контуры стенок четкие, мышечная оболочка проявляет гомогенную эозинофилию, ядра миоцитов продолговатой формы, циркулярно ориентированые, лежат в 1-2 ряда.

В легочной ткани, окрашенной методом Ван Гизон, наличие коллагеновых волокон в собственной пластинке слизистой бронхов и наружной оболочке сосудов проявляется умеренной фуксинофилией. На фоне слабо окрашенного межальвеолярного матрикса заметна сеть тонких эластических волокон. Гомогенную пикринофилию демонстрирует мышечная оболочка кровеносных сосудов и бронхов.

Умеренную положительную ШИК- реакцию в норме дают основное вещество, коллагеновые волокна и мышечная ткань за счет содержания в них мукополисахаридов, что отражается на тинкториальных свойствах стенок сосудов и бронхов. В паренхиме интенсивность окраски менее однородная из-за неодинаковой способности клеток накапливать гликоген. Волокнистое строение стромы проявляется в виде нежной сеточки, хорошо заметной во всех структурах легких. Цитоплазма клеток бронхиального эпителия проявляет различную чувствительность к ШИК-реакции. Небольшая группа клеток имеет слабо окрашенную цитоплазму, другая, большая часть клеток, дает умеренную или интенсивную ШИК-положительную реакцию. Краситель в цитоплазме этих клеток располагается диффузно или глыбками в апикальной части.

Окрашивание легких прочным зеленым показало значительное содержание белка во всех структурах, включая эпителий бронхов, где гомогенность окраски нарушается только присутствием бокаловидных клеток со светлой цитоплазмой. В собственной пластинке хорошо контрастируют с общим фоном пучки волокон, повторяющие ход складок. Часть из них уходят в ниже лежащие слои, сливаясь с волокнами экстрацеллюлярного матрикса, где и участвуют в образовании общего волокнистого каркаса. Наибольшую интенсивность окраски проявляют мышечные оболочки сосудов и бронхов. Клетки паренхимы легких демонстрируют разную степень тинкториальности, что придает ей пеструю картину. легочный микроциркуляторный сероводородсодержащий

Состояние микроциркуляторного русла оценивалось с помощью люминесцентной микроскопией после внутривенного введения раствора акридинового оранжевого. Сосуды капиллярного русла легких контрольной группы животных демонстрировали четкое окрашивание стенок с выходом малой части красителя в периваскулярное пространство в результате транскапиллярного обмена.

В течение первого месяца хронической ингаляции наблюдаются незначительные изменения в структурах легочной ткани. Эпителий бронхов увеличивает секрецию слизи, что проявляется гиперплазией бокаловидных клеток и накоплением ШИК - позитивных гранул в их цитоплазме. Усиление секреторной активности в совокупности с работой реснитчатого аппарата обеспечивает защиту и очищение бронхов. Однако длительная обструкция воздухоносных путей при гиперпродукции слизи создает благоприятные условия для персистенции инфекции, повреждения эпителия бронхов и развития воспалительного процесса (Карпина В.А., 2005, Чучалин А.Г.,2007). Отмечается усиление клеточной инфильтрации периваскулярного и перибронхиального пространства. Активированные альвеолярные макрофаги и нейтрофилы вырабатывают ферменты с мощным деструктивным действием, нарушающие нормальную архитектонику легких. В первую очередь, разрушаются тонкие эластические волокна альвеолярных перегородок, что ведет к появлению раздутых альвеол с истонченными стенками (Величковский Б.Т., 2008, Лощилов Ю.А., 2008г., Черняев А.Л. с соавт., 2008г., Черняев А.В. с соавт., 2009, Katunyma N. Et al, 1994, Liska D. G., 1998, Nakachi K. Et al, 1993). Нарушение вентиляции легких и неравномерное утолщение межальвеолярных перегородок за счет очаговой клеточной инфильтрации и набухания эпителия приводят к уменьшению воздушности легочной ткани относительно контрольных показателей (табл. 1).

Результатом действия протеолитических ферментов можно объяснить увеличение интенсивности ШИК-реакции волокнистых структур в стенках бронхов и оболочек сосудов. Отщепляющиеся от белков стромы в процессе протеолиза гликозаминогликаны увеличивают свое содержание в соединительнотканных структурах и усиливают её тинкториальные свойства.

Увеличение интенсивности ШИК-позитивной реакции цитоплазмы клеток периваскулярного пространства свидетельствует о накоплении гликозаминогликанов, что можно было бы расценить как подготовку клеток к синтезу компонентов межклеточного вещества. К морфологическим признакам реакции сосудов на воздействие природного газа на этом этапе эксперимента относится гипертрофия их оболочек, связанная в основном с отеком и клеточной инфильтрацией. Мышечные клетки сосудистой стенки находятся в состоянии сокращения, что проявляется округлением и сближением их ядер с образованием непрерывной цепочки. Ядра эпителиальных клеток при этом выбухают в просвет сосуда.

Люминесцентная микроскопия свидетельствует о повышении сосудистой проницаемости, так как свечение контрастного вещества хорошо определяется в стенках сосудов и паравазальной области.

К концу первого месяца происходит резкое повышение содержания общего холестерина, в основном, за счет холестерина ЛПНП, основного поставщика холестерина в клетку (Климов А.Н. с соавт., 1999, Горбанев Е.А., 2004, Решетова Т.Г с соавт., 2005). Холестерин является важной составляющей клеточных мембран, способствующей их устойчивости к внешним воздействиям. Процессы повреждения и регенерации усиливают потребность клеток в холестерине, а медиаторы воспаления увеличивают его синтез в печени и выделение в кровь в составе ЛПНП. Отмечается повышение содержания триглицеридов и ЛПОНП, что свидетельствует о переключении энергетического обмена с углеводного на липидный тип (Котенко Т.В. с соавт., 1985, Атаджанов М.А. с соавт., 1995, Лизенко М.В. с соавт., 2004, Братусь В.В. с соавт , 2007). В связи с увеличением потребности в холестерине и снижением акцепторных свойств ЛПВП из-за изменения белкового компонента, количество его в крови снижается (Рис. 3, 4).

Влияние низких концентраций сероводородсодержащего газа в течение первого месяц эксперимента сопровождается, в первую очередь, патохимическими изменениями, заключающимися в мобилизации транспортных форм липидов и белков для компенсации нарушений метаболического равновесия, наблюдаемых в легочной ткани.

Морфологические показатели второго месяца эксперимента демонстрируют продолжающееся уменьшение воздушности легочной ткани за счет усиления клеточной инфильтрации межальвеолярных перегородок. Зоны ателектазов чередуются с эмфизематозно расширенными участками. Процесс разрушения эластического каркаса распространяется уже на более толстые пучки эластических волокон бронхиальной стенки, что приводит к деформации стенок некоторых бронхов (Черняев А.Л. с соавт., 2008, Кузьмина Л.П., 2008).

Нарушается складчатость слизистой за счет несостоятельности соединительнотканного каркаса. Увеличение клеточной инфильтрации приводит к гипертрофии стенок бронхов, нарушению целостности базальной мембраны. Мышечная оболочка теряет гомогенность окраски и циркулярное расположение ядер миоцитов. В просвете бронхов, вдоль эпителия, формируются отложения гомогенного вещества, инфильтрированного клетками. В интерстиции вблизи некоторых бронхов диффузные клеточные инфильтраты организуются в четкие скопления, напоминающие лимфоидные фолликулы. Нарушение кровообращения проявляется запустеванием некоторых сосудов, что объясняется перераспределением крови из менее в более вентилируемые участки легких, нарушением эластического каркаса и вазоконстрикторным эффектом (Смирнова Т.И. с соавт., 2008). В других сосудах отмечается эритроцитарный стаз. Стенки их, относительно предыдущего срока, утолщаются, просвет уменьшается за счет клеточной инфильтрации и расслоения мышечных клеток в результате отека. В периваскулярной области некоторых сосудов отмечается наличие плотных клеточных инфильтратов, по окраске гематоксилином напоминающих лимфоцитарные (табл. 1).

Явных признаков коллагенообразования в этом месяце не наблюдается. Деструктивные процессы, клеточная инфильтрация и отек уменьшают содержание белка в структурах легочной ткани, что отражается на их тинкториальных свойствах. Усиление интенсивности окраски прочным зеленым демонстрирует только периваскулярная область. Сосуды усиливают проницаемость для компонентов крови, что повышает содержание белков в периваскулярном интерстиции. Повышенную эксудацию контрастного вещества в паравазальную область регистрирует люминесцентная микроскопия.

В условиях развивающейся гипоксии в результате воздействия сероводородсодержащего газа происходят изменения в углеводном обмене. В течение второго месяца эксперимента отмечается значительное повышение количества молочной кислоты и незначительное пировиноградной, что отражает нарастание степени гипоксии в тканях легких и усиление анаэробного гликолиза (рис. 2). С увеличением проницаемости сосудистой стенки и ростом потребности в транспортных формах белков, к концу второго месяца эксперимента заметно снижается содержание общего белка в крови, в основном за счет концентрации альбуминов (Anderson N.L. et al , 2002, Diamandis E.P., 2003) (рис. 1). Сохраняется тенденция к повышению общего холестерина и холестерина ЛПНП, триглицеридов и ЛПОНП. Количество ЛПВП в крови уменьшается, что предотвращает отток холестерина из тканей (рис.3, 4).

Усиленное поглощение макрофагами и другими клетками ретикулоэндотелиальной системы липидов наблюдается при окрашивании тканей легких Суданом ІІІ. Отмечается появление в периваскулярном интерстиции клеток, содержащих липидные включения. Липидсодержащая выстилка альвеол деформируется за счет клеточной инфильтрации и отека. Количество её уменьшается в участках ателектаза, что объясняется нарушением кровоснабжения и секреторной активности альвеолоцитов ІІ типа.

В течение третьего месяца от начала эксперимента происходят значительные структурные изменения в легочной ткани. Воздушность легочной ткани увеличивается по мере нарастания эмфизематозных участков. В пределах одного поля зрения соседствуют рядом альвеолы с растянутыми, истонченными стенками и толстыми межальвеолярными перегородками, инфильтрированными клетками, в несколько раз превышающими размеры самой альвеолы.

Многие бронхи деформированы, на разрезе имеют звездчатую форму и содержат скопления слизи, инфильтрированной клетками. Толщина бронхиальной стенки уменьшается относительно предыдущего месяца. Слоистая структура стенок нарушается. Встречаются полипообразные выпячивания слизистой в просвет бронха. Эпителий слизистой уплощается, его базальная граница становится неровной, прерывистой или исчезает совсем в области массивной клеточной инфильтрации.

Часть кровеносных сосудов запустевает. Усиление сосудистой проницаемости сопровождается появлением в периваскулярной области участков, богатых белками плазмы, проявляющих интенсивную эозинофилию. Толщина стенок заметно не изменяется, но увеличивается диаметр сосудов. Сократительная контрактура мышечных и эндотелиальных клеток сохраняется. Прогрессируют процессы атрофии мышечной оболочки бронхов, что выражается в уменьшении её объема и увеличении межмышечной соединительной ткани (табл.1).

Активные процессы коллагенизации проявляются к концу третьего месяца хронического эксперимента интенсивной фуксинофилией перибронхиальной области. Неоднородность окраски мышечной оболочки объясняется появлением участков фуксинофилии. Места отложения коллагена носят гомогенный характер, что характерно для молодых его образований. Наиболее яркую реакцию дают кровеносные сосуды (Разумов В.В. с соавт., 2008). Интенсивной окраске подвергаются наружная оболочка сосуда и периваскулярное пространство. Отложение коллагена здесь носит как гомогенный, так и пучковый характер. Степень фуксинофилии уменьшается в сторону паренхимы легких и выражается в виде слабого окрашивания межклеточного вещества.

При окраске прочным зеленым стенки сосудов визуально нарушают свою целостность, в них формируются «пустоты», соответствующие межмышечным расслоениям и клеточным инфильтратам. Контуры и толщина стенок становятся неровными. Волокна, определяемые раньше в оболочках и межклеточном веществе паренхимы, истончаются и плохо контурируют на общем фоне. Периваскулярное пространство бледнеет и приобретает ячеистый характер из-за неоднородного окрашивания. Стенки бронхов проявляют неравномерные тинкториальные свойства, местами истончаются и теряют четкость контуров.

При окраске Суданом ІІІ увеличивается количество липидных включений в клетках и между ними. Липидсодержащая выстилка деформируется и местами отслаивается за счет отека и клеточной инфильтрации.

Биохимические показатели крови демонстрируют рост уровня общего холестерина, триглицеридов, ЛПОНП и ЛПНП, хотя темпы роста концентрации холестерина в крови в силу интенсивной утилизации его тканями падает (рис. 2, 3, 4). Количество общего белка снижается за счет уменьшения содержания альбуминов. По мере нарастания степени гипоксии в легких отмечается значительный рост концентрации молочной кислоты в крови.

Четвертый месяц эксперимента характеризуется грубыми деструктивными изменениями. Нарастает количество деформированных бронхов с мешковидными выпячиваниями стенок, характерных для бронхоэктазов. Сужение просвета бронхов и обтурация их слизью, инфильтрированной клеточными массами, приводят к ухудшению вентиляции. Атрофические процессы в бронхиальной стенке обусловлены разрастанием и отеком межмышечной соединительной ткани. Собственная пластинка практически не определяется. Мышечная оболочка плохо окрашивается эозином, ядра гладких миоцитов дезориентированы. Воздушность легких увеличивается с нарастанием объема эмфизематозно измененной паренхимы (табл. 1).

Метод Ван Гизон демонстрирует прогрессию процессов коллагенообразования. Мышечная оболочка бронхов усиливает свою фуксинофилию, причем отложения коллагена в ней носят очаговый характер. В стенке бронхов по-прежнему интенсивно окрашенными остаются собственная пластинка и перибронхиальное пространство. В сосудистой стенке мышечная оболочка подвергается процессам активной коллагенизации. Интенсивное диффузное окрашивание фуксином периваскулярного пространства показывает увеличение отложения коллагена с распространением процесса в окружающую паренхиму.

Увеличение объема соединительной ткани в стенках бронхов и перибронхиальном пространстве проявляется слабой ШИК-реакцией. В процессе протеолиза образуются коллагеновые волокна, в основном, ІІІ типа, дающих интенсивное окрашивание, что делает их хорошо заметными на общем фоне (Кругликов Г.Г. с соавт., 2008). Отмечается прерывистость и дезориентация волокнистых структур, особенно в области массивных клеточных инфильтраций.

Гистохимические показатели липидного обмена в легких, в основном, касаются липидсодержащей выстилки альвеол. По мере нарастания процессов пероксидации в цитоплазме макрофагов увеличивается количество липидных включений, что сопровождается повышением их функциональной активности.

В окрашенных Суданом препаратах отмечается увеличение липидных включений в цитоплазме клеток и межклеточном пространстве, деформация и уменьшение липидсодержащей выстилки альвеол.

В биохимических показателях крови продолжается увеличение содержания холестерина ЛПНП в составе общего холестерина. Появляется тенденция к снижению триглицеридов и ЛПОНП. Концентрация ЛПВП снижаться. По мере неравномерного снижения содержания глобулинов и альбуминов в составе общего белка, происходит изменение их соотношения в сторону увеличения глобулинов. Во всех сроках эксперимента происходит стабильное увеличение содержания молочной кислоты (Рис. 1-4).

Таким образом, наиболее значимым проявлением третьего и четвертого месяца эксперимента является нарушение структурной организации легких. Процессы коллагенизации становятся очевидными в течение третьего месяца хронической ингаляции с последующим нарастанием интенсивности по мере увеличения срока воздействия.

Исследование восстановительных возможностей респираторной системы испытуемых животных через месяц после окончания воздействия природным газом в концентрации по сероводороду 3мг/м³ демонстрируют результаты пятого месяца эксперимента. На препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, происходят незначительные изменения относительно предыдущего месяца эксперимента. Положительным моментом можно отметить лишь восстановление границ эпителия с собственной пластинкой. Она стала более четкой, ровной и непрерывной. Остальные параметры гистологических и гистохимических методов исследования свидетельствуют о продолжении процессов коллагенообразования в структурах легочной ткани.

Рис. 1. Изменение содержания альбуминов и глобулинов в сыворотке крови при хроническом воздействии сероводородсодержащего газа в концентрации 3 мг/м³ по сероводороду (ммоль/л).

Рис.2. Изменение содержания молочной и пировиноградной кислот при хроническом воздействии сероводородсодержащего газа в концентрации 3 мг/м³ по сероводороду (ммоль/л).

Начальные проявления, характеризующие восстановительные процессы в метаболической функции легких после прекращения воздействия сероводородсодержащего газа, отражаются, в первую очередь, в результатах биохимических показателей крови животных. В течение месяца отмечается повышение концентрации общего белка и альбуминов в сыворотке крови, относительная стабилизация показателей ЛПВП, ЛПНП, триглицеридов, уменьшение количества молочной кислоты. Несмотря на положительную динамику результатов исследования последнего месяца эксперимента, мы можем говорить лишь о тенденции к восстановлению метаболического равновесия, так как полной нормализации биохимических показателей не происходит. Структурные изменения демонстрируют более стойкий характер (рис. 1-4).

Рис. 3. Содержание липопротеидов высокой, низкой и очень низкой плотности в крови при хроническом воздействии сероводородсодержащего газа в концентрации 3 мг/м³ на концентрацию (ммоль/л).

Рис. 4. Содержание общего холестерина и триглицеридов в крови при хроническом воздействии сероводородсодержащего газа в концентрации 3 мг/м³ на концентрацию (ммоль/л).

Таблица 1. Морфометрические показатели в легких на разных сроках хронического воздейстия сероводородсодержащим газом в концентрации 3 мг/м³, M ± m

Примечание: * - разница с контролем достоверна при р<0,05

Выводы

1.Морфологические проявления начального этапа хронического воздействия природного газа в структурах легочной ткани отражают функциональный характер изменений, выражающихся усилением клеточной инфильтрации, повышением проницаемости сосудистого русла, бокалоклеточной гиперплазией. Возникающее нарушение метаболического равновесия ослабляет резистентность организма к повреждающему действию сероводородсодержащего газа и приводит к разрушению эластического каркаса легких, деформации бронхов, изменению воздушности легочной ткани, прогрессирующей пролиферации соединительной ткани, перестройке микроциркуляторного русла.

2. Хроническое воздействие природного газа вызывает изменения в сосудах микроциркуляторного русла, характеризующиеся прогрессирующей гипертрофией сосудистой стенки, обусловленной усилением клеточной инфильтрации, отеком, разрастанием межмышечной соединительной ткани в средней оболочке и гиперплазией интимы, что приводит к усилению проницаемости и интенсивному коллагенообразованию в периваскулярной области.

3. На фоне хронической ингаляции природным газом происходит изменение гистохимической картины адекватно последовательности метаболических процессов в легочной ткани. С нарастанием активности протеолитических ферментов, снижается содержание белков и увеличивается количество углеводов в структурах легких. С пролиферацией соединительной ткани уменьшается содержание углеводов в легочной ткани. В цитоплазме клеток паренхимы постепенно увеличивается содержание липидов, уменьшается и деформируется липидсодержащая выстилка альвеол.

4. По мере увеличения срока эксперимента уменьшается концентрация общего белка и альбуминов крови, увеличивается содержание молочной кислоты, холестерина и триглицеридов, ЛПНП и ЛПОНП, уменьшается количество ЛПВП.

5. Хроническая ингаляция природного газа в концентрации, не превышающей ПДК, вызывает стойкие структурные изменения в легочной ткани, сохраняющие свои параметры через месяц после окончания его воздействия. Положительную динамику восстановительного периода в первую очередь демонстрируют биохимические показатели крови, выражающиеся в тенденциях к уменьшению содержания в крови ЛПНП, ЛПОНП, общего холестерина, триглицеридов, молочной кислоты и увеличения ЛПВП, общего белка и альбуминов.

Практические рекомендации

1. Рекомендуется включить в комплекс мероприятий профилактических медицинских осмотров биохимические исследования крови для определения степени метаболических и структурных изменений бронхолегочной системы.

2. Результаты, отражающие динамику морфологических и функциональных процессов в легочных тканях могут быть использованы в учебном процессе в медицинских ВУЗах при преподавании соответствующих курсов гистологии, патологической анатомии, нормальной и патологической физиологии.

3. Продемонстрированный в настоящем исследовании неблагоприятных эффект хронического воздействия малых доз сероводородсодержащего газа на структуры и метаболическую функцию легких необходимо принимать во внимание при разработке нормативов предельно допустимых концентраций газа в производственных помещениях и в санитарно-защитной зоне, прилегающей к газодобывающим и газоперерабатывающим предприятиям.

Список принятых сокращений

ЛПНП - липопротеиды низкой плотности

ЛПОНП - липопротеиды очень низкой плотности

ЛПВП - липопротеиды высокой плотности

ПДК - предельно допустимая концентрация

ХС - холестерин

ТГ - триглицериды

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Чекунова, И.Ю. Реакция дыхательной системы на действие неблагоприятных факторов среды / Т.А. Шишкина, И.Ю. Чекунова, Л.И. Наумова, И.С. Фисенко // «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвященная 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина. - Морфология. - 2007 - №3, - Стр.102.

2. Чекунова, И.Ю. Анализ микроциркуляторных изменений в организме лабораторных животных при воздействии неблагоприятных факторов среды / Т.А.Шишкина, И.С. Фисенко, И.Ю. Чекунова // XЙЙ Международный конгресс по реабилитации в медицине и иммунореабилитации 5-9 декабря 2007 г. - Иммунология. - 2007. - №12. - Стр.89.

3. Чекунова И.Ю. Особенности морфологических изменений микроциркуляторного русла легких при адаптации к хроническому воздействию сероводородсодержащего газа / Л.И. Наумова, Н.В. Милехина, А.А, Осипов, Т.А. Шишкина, И.Ю. Чекукнова // Морфология. - 2008. - №2. - Стр.94.

4. Чекунова, И.Ю. Структурные и функциональные изменения микроциркуляторного русла легких и тонкого кишечника при воздействии токсических веществ /Л.И. Наумова, Т.А. Шишкина, Н.В. Милехина, О.А. Доброславская, И.Ю. Чекунова // Труды Астраханской Государственной Медицинской Академии «Актуальные вопросы современной медицины» (посвященные 90-летию АГМА) - 2008 - Т. 37, - С.52-53.

5. Чекунова, И.Ю. Использование препаратов системной энзимопатии в условиях хронической ингаляции природного газа / Т.А. Шишкина, Л.И., Наумова, Н.В. Милехина, А.А. Осипов, О.А. Доброславская, И.Ю. Чекунова // Материалы конференции «Актуальные проблемы клинической иммунологии и аллергологии» 23-24 октября 2008 года. - Цитокины и воспаление. - 2008. - № 3 - Стр.74.

6. Чекунова, И.Ю. Морфологические изменения микроциркуляторного русла респираторной системы и желудочно-кишечного тракта при воздействии токсических веществ / Т.А. Шишкина, Л.И. Наумова, И.Ю. Чекунова, Е.Ю. Панкрашова // Материалы конференции молодых ученых «Микроциркуляция человека в норме и патологии (экспериментальные и клинические аспекты) 26-27 февраля 2009 г. - 2009. - С. 92-95.

7. Чекунова, И.Ю. Оценка функциональной активности микроциркуляторного русла на фоне хронического действия сероводородсодержащего газа / Шишкина Т.А., Наумова Л.И., Панкрашова Е.Ю. // Материалы конференции молодых ученых «Микроциркуляция человека в норме и патологии (экспериментальные и клинические аспекты) 26-27 февраля 2009 г. - 2009. - С.95-97.

8. Чекунова, И.Ю. Состояние соединительнотканных элементов в легких лабораторных животных при хроническом воздействии природного газа / Т.А. Шишкина, Л.И. Наумова, А.А. Осипов, И.Ю. Чекунова // Морфология - 2009 - №4 - С. 157.

9. Чекунова, И.Ю. Морфологические особенности микроциркуляторного русла легких на фоне хронического действия токсических веществ // Л.И. Наумова, Т.А. Шишкина, А.А. Осипов, И.Ю. Чекунова // Морфология - 2009 - №4 - С. 105.

10. Чекунова, И.Ю. Структурные изменения и медиаторы при эндотелиальной дисфункции, вызванной воздействием токсических веществ / И.Ю. Чекунова, Л.И. Наумова, Т.А. Шишкина // Морфологические ведомости - 2009 - №1-2- С.60-63.

11. Чекунова, И.Ю. Особенности реакции микроциркуляторного русла легких на действие неблагоприятных факторов среды / Т.А. Шишкина, Л.И. Наумова, И.Ю. Чекунова // Морфологические ведомости - 2009 - № 1-2 - С.156-158.

Подписано к печати 12.02.2010

Заказ № . Тираж 100 экз.

Уч.-изд. л. 1,4. Усл. печ. л. 1,3

Оттиражировано в Издательстве «»

Размещено на Allbest.ru