Особенности морфофизиологических показателей эритроцитов белых крыс на этапах онтогенеза в норме и при оксидативном стрессе

Размещено на http://www.allbest.ru/

18

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Особенности морфофизиологических показателей эритроцитов белых крыс на этапах онтогенеза в норме и при оксидативном стрессе

Специальность 03.03.01 - Физиология (Биологические науки)

Теплый Дмитрий Давидович

Астрахань - 2011

Работа выполнена на кафедре физиологии и морфологии человека

и животных Астраханского государственного университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Нестеров Юрий Викторович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Киричук Вячеслав Федорович

доктор биологических наук, профессор

Горст Виктор Рудольфович

Ведущая организация: Ставропольский государственный университет

Защита диссертации состоится «28» «мая» 2011 года в 13.30 часов на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу: 414000, Астрахань, пл. Шаумяна, д.1

Автореферат разослан __________ 2011 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Ю.В. Алтуфьев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Одна из центральных проблем современной биологии - проблема дифференцировки, старения, гибели и замены клеток. Эта проблема непосредственно связана с изучением онтогенеза целого организма и является важнейшим направлением современной биологии старения (Голубев А.Г., 1997; Никитин В.М., 1983; Тодоров И.Н., Тодоров Г.И., 2003; Гончарова Н.Д., Маренин В.Ю. и др., 2008; Teply D.L., 2010).

Среди многочисленных теорий старения одной из ведущих считается свободнорадикальная теория (Emanuel N.V.; Harman D., 1994). В настоящее время она развивается особенно плодотворно и является ведущей фундаментальной теорией в геронтологии (Гусев В.А., 2000; Анисимов В.Н., 2003). Согласно положениям свободнорадикальной теории старения, активные формы кислорода индуцируют цепную реакцию повреждения биополимеров и служат основным фактором инволюции организма (Зенков Н.К., Кандалинцева Н.В., Ланкин В.З и др. 2003; Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З. и др., Субинина Е.Е., 2006).

В соответствии с принятой многими учеными точкой зрения, возрастные особенности окислительного стресса при старении являются следствием ослабления эффективности системы антиоксидантной защиты (Абрамченко В.В., 2001; Хавинсон и др., 2003; и др.). Однако, несмотря на несомненные успехи в изучении эффектов и механизмов действия антиоксидантов, их использование в медицинской и ветеринарной практике носит нередко эмпирический характер, а многие вопросы изучения стресс- и геропротекторного действия антиоксидантов требуют дальнейшего изучения. Недостаточно изучены нарушения конечного звена эритрона - эритроцитов при интенсификации окислительного стресса разного генеза, особенно на позднем этапе онтогенеза.

В последние десятилетия появились исследования, указывающие на особенности морфофизиологических показателей эритроцитов периферической крови на ранних критических этапах постнатального онтогенеза, указывающие на возможность суждения о стадиях онтогенеза по показателям структуры и функции эритроцитов (Войнов В.П., Полюхов А.М., 1986; Леонова В.Г., 1987; Новожилов А.В., Катюхин Л.Н., 2008). Между тем, состояние эритроцитов - чувствительных индикаторов изменений нормального хода физиологических, биохимических и биофизических процессов в онтогенезе, особенно позднем, изучены недостаточно.

Взаимосвязь возрастной активации свободнорадикальных процессов с действием экстремальных факторов может оказать существенное влияние на эритроциты, онтогенетические изменения которых представлены в литературе крайне фрагментарно. Между тем, исследование возрастных особенностей структурно-функциональной организации эритроцитов при хроническом действии экстремальных, особенно токсических, факторов, может иметь, помимо теоретического, диагностическое и прогностическое значение для оценки биологической зрелости и способности организма к адаптации.

В связи с этим представляется актуальным изучение особенностей морфофизиологического состояния эритроцитов на критических этапах онтогенеза, особенно на этапе инволюции, а также при действии экстремальных факторов на примере серосодержащих газовых поллютантов, образующихся при добыче и промышленной переработке газа Астраханского газоконденсатного месторождения. Актуальным представляется и поиск средств эффективной коррекции как инволюционных нарушений структуры и функций эритроцитов, так и нарушений, вызванных хроническим действием сероводородсодержащего газа.

Цель исследования: экспериментальное изучение возрастных особенностей морфофизиологической организации эритроцитов периферической крови белых крыс в норме и при окислительном стрессе, вызванном хроническим действием сероводородсодержащих газовых поллютантов.

Основные задачи исследования:

1. изучить морфофизиологические параметры эритроцитов молодых и старых интактных крыс;

2. исследовать влияние биологического и синтетического антиоксидантов на морфофизиологические параметры эритроцитов интактных молодых и старых крыс;

3. изучить возрастную динамику свободнорадикального окисления и активности каталазы плазмы крови крыс и ее изменение при экстримальных воздействиях;

4. изучить изменения морфофизиологических параметров эритроцитов молодых и старых крыс, вызванных хроническим воздействием сероводородсодержащего газа;

5. исследовать сравнительные стресс-протекторные эффекты биологического и синтетического антиоксидантов на морфофизиологические показатели эритроцитов молодых и старых крыс, вызванные хроническим действием сероводородсодержащего газа.

Научная новизна

Впервые с применением компьютерной цитофотометрии проведено исследование морфофизиологических показателей функционального состояния эритроцитов периферической крови нелинейных белых крыс на раннем и позднем этапах постнатального онтогенеза. Установлены основные закономерности онтогенетических изменений структуры и функции эритроцитов, имеющие принципиальные различия у молодых и старых животных.

Впервые проведена комплексная оценка морфофункционального состояния эритроцитов у молодых и старых лабораторных животных, подвергнутых хроническому влиянию малых доз промышленных серосодержащих поллютантов, и определены существенные различия в характере и степени реакции эритроцитов на действие экотоксинов у молодых и старых животных.

Показано, что изменения морфофизиологических показателей эритроцитов, вызванные токсическим действием серосодержащего газа, не являются строго специфичными: подобное действие на эритроциты (по данным литературы) оказывают другие факторы токсической природы , в частности, пероксинитрит и акрилат.

Получены новые данные о принципиальных возрастных различиях действия супрафизиологических доз биоантиоксидантиа D,L,a-токоферолацетата на морфофизиологические показатели эритроцитов и свободнорадикальные процессы крови на молодых и старых животных, менее выраженные у синтетического антиоксиданта эмоксипина.

Теоретическая и практическая значимость

Комплексный подход к анализу возрастной динамики морфофизиологических показателей периферического звена эритрона - эритроцитов с использованием компьютерной цитофотометрии позволяют существенно углубить современные представления о возрастных изменениях эритроцитов на позднем этапе постнатального онтогенеза.

Экспериментальные данные об особенностях возрастной динамики физиологических и морфометрических показателях эритроцитов могут служить объективными показателями старения организма и маркером уровня его адаптивных возможностей.

Результаты исследований указывают на характерную для этапа инволюции развития значительную дестабилизацию мембран эритроцитов, связанную с возрастзависимым увеличением уровня ПОЛ и метаболитов оксида азота.

Ослабление свободнорадикальных процессов антиоксидантами (б-токоферолом и в меньшей мере - эмоксипином) указывает на возможность снижения скорости и степени дестабилизации эритроцитарных мембран и улучшения показателей, характеризующих функциональное состояние эритроцитов на этапе инволюции онтогенеза.

Теоретическое и практическое значение представляют также результаты исследований морфофизиологических показателей эритроцитов при воздействии серосодержащих газовых поллютантов, образующихся при добыче и промышленной переработке Астраханского газоконденсатного месторождения. Особенность этих результатов состоит в обнаружении возрастных особенностей нарушения структуры и функции эритроцитов при хроническом действии малых доз газовых поллютантов и вытекающей отсюда необходимости коррекции этих нарушений.

Выявленные экспериментально способности б-токоферола в дозах, соизмеримых с терапевтическими, (в меньшей степени - эмоксипина) нормализовать морфофизиологические параметры функционального состояния эритроцитов в позднем онтогенезе позволяют предположить возможность их использования в качестве геропротекторов, а также у лиц преклонного возраста, находящихся под воздействием неблагоприятных производственных условий газоперерабатывающего производства.

Результаты исследований используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторных занятий по физиологии человека и животных, гистологии и биохимии в Астраханском государственном университете и Астраханской государственной медицинской академии, а также в исследованиях Лаборатории экспериментальной физиологии Астраханского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту

Возрастзависимые отклонения от физиологического уровня преобладающего числа параметров эритроцитов свидетельствуют об отсутствии стабильности морфофизиологических показателей эритроцитов в позднем онтогенезе, указывая на значительные нарушения газотранспортной функции, особенно выраженной у старых животных при ингаляции серосодержащим газом.

Различия в направленности и степени действия биологического

(б-токоферол) и синтетического (эмоксипин) антиоксидантов на периферическое звено эритрона при старении организма определяются особенностями химической природы , соответственно, свойствами фенольного и водорастворимого антиоксидантов, и возрастными отличиями системы «про- и антиоксиданты» микроокружения эритроцитов.

Одним из основных механизмов повреждающего действия сероводородсодержащего газа на эритроциты периферической крови является развитие эндогенной интоксикации, детерминированной совместным действием эндо- и экзогенных прооксидантов, способных экспрессировать синтез оксида азота, особенно на позднем этапе онтогенеза.

Апробация работы: основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научных конференциях Пущинского государственного университета на VI-ой научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Москва, 2008); на Международной конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 2008).

Структура диссертации: диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографии. Общий объем диссертации (.....с.) с 20 таблицами и 16 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты поставлены на 96 беспородных белых крысах- самцах: молодых (возраст - 180 дней) и старых (820 дней) в соответствии с возрастной классификацией лабораторных крыс (Душкина В.А., 1980; Западнюк И.П., 1983). Животные были разделены на 6 групп соответственно для каждой возрастной группы: 1 - интактные крысы (контроль), 2 - б-ТФ -_ D,L,a- токоферолацетат - 5% масляный раствор per os в дозе 1 мг /100 г массы тела в течение 14 дней до окончания опытов; 3 - эмоксипин - 1% водный раствор эмоксипина гидрохлорида внутрибрюшинно в дозе 5 мг/100 г массы тела в течение 14 дней до окончания опытов; 4 - СВСГ - сероводородсодержащий газ ингаляционно в дозе 150 мг/м³ (по H₂S); экспозиция 240 мин. в течение 6 недель по 5 дней в неделю; 5- СВСГ + б-ТФ (добавление б-ТФ в течение 14 дней до завершения опытов); 6 - СВСГ + эмоксипин - добавление эмоксипина в течении 14 дней до окончания опытов).

Ингаляционные затравки животных осуществлялись в специальных камерах производства Московского института профзаболеваний им. Эрисмана объемом 200 л на базе кафедры патофизиологии Астраханской государственной медицинской академии. Микроклимат в камере в течение экспериментов поддерживался при температуре 27°С - и влажности в начале эксперимента 64%, в конце - 72-74%.

Изучались следующие гематологические показатели: величина гематокрита - методом центрифугирования в микрокапиллярах, обработанных антикоагулянтом, на специальной микроцентрифуге; определение количества эритроцитов периферической крови - с применением камеры Горяева (Башкиров А.А. и сотр., 2004); определение содержания гемоглобина с применением гемоглобинцианидного спектрофотометрического метода (Drabкin); вычисление цветового показателя традиционным клиническим методом (Полунин И.Н., Яхьяева Г.З., 1996).

Определяли следующие индексы эритроцитов с помощью методик, применяемых в лабораторной практике (Бондарь Т.П. и сотр., 2007): средний объем эритроцитов (MCV в фл); среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН в пг); среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците (МСНС в г/дл); показатель анизоцитоза эритроцитов (RDW в %).

Определение морфологических и геометрических показателей эритроцитов производили с помощью аппаратно-программного комплекса «МЕКОС-Ц» в программе «Эритроцитометрия» в монослое мазков периферической крови, окрашенных по Гимза-Романовскому, в составе комплекса - тринокулярный микроскоп «NIKON», цифровая фотокамера «Delta-Pix-300» , персональный компьютер.

При анализе геометрических показателей оценивали: средний диаметр эритроцита по формуле S = N/K-1, где N - сумма всех пикселей, составляющих объект, К-1 - коэффициент линейного разрешения (число пикселей на 1 мкм); фактор формы эритроцитов как отношение квадрата диаметра к площади поперечного сечения эритроцита - F = L2/S - характеристика изрезанности контура клетки; поляризацию эритроцита (характеристика степени эллиптичности) по формуле - Р*2х (а-в)(а+в), где а - набольшая, в - наименьшая величина диаметра эритроцита, распластанного по стенке; формулу эритроцита (распределение на основные типы: нормальные, обратимо измененные, необратимо измененные, патологические (в у.е.).

Для оценки свободнорадикального окисления и, в связи с этим, степени выраженности липолитических процессов плазмы крови, а также изменения проницаемости мембраны эритроцитов определяли перекисный гемолиз эритроцитов (ПГЭ), используя методику А.А.Покровского и А.А. Абрарова (1964) в модификации А.Е. Лазько и сотр. (1993); перекисное окисление липидов плазмы крови по методу И.Д.Стальной и Т.Г. Гаришвили (1977) в модификации Е.А.Строевой и В.Г.Макаровой (1986); определение уровня оксида азота по методу В.А. Метельской и Н.Г.Гумановой (2005). С целью оценки стресс-реактивности использовалась эозинопеническая проба Торна (Ронин В.С., Старобинец Г.М., 19889). Активность каталазы плазмы крови определяли по методу М.А. Королюк и сотр.,(1998).

Для анализа экспериментального материала использовали методы статистической оценки данных с применением пакета статистических программ Microsoft Exel, BIOSTAT 5.1, предназначенного для медико-биологических исследований с использованием критериев t/P Стьюдента (Рафализ-Ламарка Э.Э., 1971; Лакин Г.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При сравнении возрастной динамики количества эритроцитов периферической крови крыс найдено их увеличение у старых животных на 37% в сравнении с молодыми (Р<0,001, табл. 1). Эритроцитоз, характерный для позднего онтогенеза, может быть следствием компенсаторного усиления эритропоэза и выходом в периферическое русло крови клеток со значительно меньшим индивидуальным объемом (Р<0,001), что и наблюдалось в наших опытах, а также повышенным гемолизом эритроцитов при старении (Р<0,01 в сравнении с молодыми), индуцированным усилением свободнорадикальных процессов, характерных для этапа инволюции. Значительное уменьшение объема эритроцитов при старении компенсируется ростом их концентрации в крови, что, в какой-то мере, способствует поддержанию общей дыхательной поверхности циркулирующей крови. Как известно (Кhausari N. et al.,1983), удаление неполноценных клеток из крови - генетически контролируемая программа. В связи с этим при старении, возможно, имеет место не только выраженное старение эритроцитов, но и недостаточно эффективное удаление дефектных клеток из периферического русла крови (Войтенко В.П., 1984).

Изучение степени анизоцитоза показало несколько большую гетерогенность размеров эритроцитов у старых крыс в сравнении с молодыми и значительное (втрое) увеличение аномальных форм эритроцитов у старых животных.

Старение организма не сказалось на общем уровне гемоглобина крови, однако у старых крыс среднее содержание гемоглобина (MCH) и средняя концентрация гемоглобина в клетке (МСНС) значительно уменьшились в сравнении с молодыми животными (Р<0,001), что свидетельствует о развитии гипохромии, вызванной нарушением синтеза гемоглобина (Бондарь Т.П. и сотр., 2007). Это подтвердилось и данными о некотором снижении у старых крыс величины гематокрита (на 15-20% в сравнении с молодыми животными).

Гематологические показатели при действии СВСГ и антиоксидантов у молодых и старых крыс. Таблица 1

Метод

Характер воздействия

Молодые

Старые

Контроль

СВСГ

б-ТФ

б-ТФ + СВСГ

ЭМ

ЭМ + СВСГ

Контроль

СВСГ

б-ТФ

б-ТФ + СВСГ

ЭМ

ЭМ + СВСГ

HCT (%)

37,81 ± 0,395

39,80*** ± 1,933

35,06** ± 0,601

37,63** ± 0,906

37,38 ± 0,327

****** 41,40 ± 0,466

43,13^^^ ± 0,641

37,25** ± 0,707

7,23*** ± 0,548

*** 39,38 ± 0,756

23,18*** ± 1,626

****** 38,75 ± 0,567

RBC (1012/л)

6,42 ± 0,065

7,05* ± 0,223

5,48** ± 0,226

6,65* ± 0,095

6,27 ± 0,440

7,3 ± 0,546

8,8^^^ ± 0,014

4,98*** ± 0,132

8,70* ± 0,038

7,21** ± 0,189

8,60*** ± 0,015

****** 6,97 ± 0,104

HGB (г/л)

14,34 ± 0,533

15,42* ± 0,094

15,55* ± 0,327

16,45*** ± 0,340

15,27 ± 1,226

14,81 ± 0,525

14,78 ± 0,164

10,95*** ± 0,314

13,73 ± 0,553

12,94****** ± 0,112

11,59 ± 1,529

*** 11,60 ± 0,145

ЦП

1,19

1,12

1,51

1,32

1,3

1,05

0,89

1,17

0,84

0,96

0,72

0,88

RDW(%)

12,65

6,20

8,34

9,93

15,53

17,38

14,25

9,34

5,95

10,25

8,57

6,96

MCV (фл)

58,8 ± 1,50

56,38 ± 1,061

64,45* ± 1,901

56,72 ± 1,992

61,23 ± 3,365

58,02 ± 4,501

49,02^^ ± 2,472

75,22*** ± 2,507

48,86 ± 1,028

54,91****** ± 1,966

41,95* ± 1,292

**** 55,72 ± 1,199

MCHC (г/дл)

38,08 ± 1,267

39,41 ± 1,635

44,41** ± 1,119

43,82**** ± 0,866

40,86 ± 0,542

35,91* ± 1,008

34,34^ ± 0,669

29,45*** ± 0,945

32,42 ± 1,316

32,95** ± 0,743

32,50 ± 2,909

***30,11 ± 0,668

MCH (пг)

22,36 ± 0,808

22,11 ± 1,272

28,56*** ± 0,847

24,32 ± 0,824

26,26* ± 0,989

21,05 ± 2,612

16,86^^^ ± 0,264

22,03*** ± 0,583

15,77* ± 0,470

***18,05 ± 0,436

13,55* ± 1,087

*** 16,96 ± 0,437

ПГЭ (%)

3,97 ± 0,130

4,96*** ± 0,061

4,31* ± 0,030

4,23**** ± 0,040

4,15 ± 0,036

4,12 ± 0,086

4,6^^ ± 0,155

7,23*** ± 0,548

2,44*** ± 0,211

***5,59 ± 0,268

5,31** ± 0,162

6,2* ± 0,595

P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001-в сравнении с контролем; ^-P<0,05, ^^P<0,01, ^^^P<0,001; *-возрастные различия в сравнении с СВСГ

Результаты экспериментов показали наличие слабой корреляции между количеством эритроцитов (RBC) и их индивидуальным объемом (МСV): у молодых крыс r = +0,21, у старых - r = -0,10, что соответствует корреляции между RBC и MCV у взрослого человека (Шмаров Д.А. и сотр., 2002).

Изучение возрастной динамики адаптивных возможностей выявило эозинофилию у старых крыс (Р<0,05 - на 25% выше в сравнении с молодыми животными), что свидетельствует о возрастном снижении стресс-реактивности, связанном с возможным возрастзависимым ослаблением секреторной активности надпочечников (Агаджанян Н.А. и сотр., 1998; Телль Л.З и сотр., 2007).

Известно, что основной мишенью активных кислородных метаболитов, уровень которых возрастает при старении, является мембрана эритроцитов (Краснов А.Ф. и сотр., 1978, Войтенко В.П., 1984). В наших экспериментах уровень перекисного гемолиза эритроцитов у старых крыс оказался значительно большим, чем у молодых (Р<0,01), что указывало на возрастное истощение антиоксидантной системы эритроцитов и их микроокружения. При определении активности каталазы плазмы крови обнаружили понижение активности ферментного антиоксиданта в плазме крови у старых животных (Р<0,05).

Найденные изменения активности каталазы сочетались с возрастной динамикой показателей ПОЛ и метаболитов оксида азота. У молодых крыс исходный уровень МДА плазмы крови был вдвое ниже уровня МДА старых крыс (Р<0,01) (рис. 1). Те же изменения характерны и для скорости аскорбатзависимого и спонтанного ПОЛ (Р<0,001 в обоих случаях). Полученные данные свидетельствуют также о повышении концентрации и суммарных метаболитов NO (Р<0,001). Сходные данные были получены ранее другими авторами (Янькова В.И., Иванова И.Л., 2003).

При характеристике онтогенетических особенностей морфометрических показателей эритроцитов были найдены существенные возрастные различия

количества аномальных форм эритроцитов: у молодых крыс - 2.44%, у старых - 8.40%. Такая ситуация характерна для условий напряжения эритропоэза, формирующегося при усилении гемолиза эритроцитов (Новицкий В.В. и сотр., 2004) и усиления свободнорадикальных процессов в позднем онтогенезе. По мнению других авторов (Черницкий Е.А., Воробей А.И., 1981) в механизме увеличения аномальных форм эритроцитов участвует снижение внутриклеточной АТФ (АТФ-зависимые системы). Характерно, что заметно больший процент аномальных клеток у старых крыс представляли сфероциты, появление которых в крови связано с изменением содержания спектрина, приводящего к нарушению устойчивости эритроцитарных мембран (Зинчук В.В., 2001).

Результаты морфометрических исследований не выявили существенных отклонений от нормы ни одного из геометрических показателей. Однако у старых крыс существенно увеличилась площадь эритроцитов (Р<0,001), средний диаметр (Р<0,001), отмечены некоторые изменения уровня поляризации.

Молодые

Старые

Рис.1 Возрастные особенности уровня свободнорадикальных процессов плазмы крови интактных крыс получавших антиоксиданты.

Увеличение среднего диаметра эритроцитов определило обратную корреляцию между этим показателем и средним объемом эритроцитов при старении (r = -0.71). Старение способствовало некоторому уменьшению эластичности эритроцитов ( у молодых крыс -0.091+0.015 у.е.; у старых - 0.072 + 0.017 у.е.).

Анализ эффектов антиоксидантов обнаружил возрастные различия ряда морфофизиологических показателей эритроцитов и уровня свооднорадикальных процессов их микроокружения (табл.1). У молодых крыс б-токоферол способствовал развитию эритропении (Р<0,01), не оказав значимого влияния на число эритроцитов у старых крыс. При действии на организм эмоксипина число эритроцитов не отличалось от контрольных показателей вне зависимости от возраста животных.

Эритропенический эффект б-токоферола у молодых крыс сопровождался достоверным ослаблением перекисной резистентности эритроцитарных мембран (Р<0,05), а у старых - оставался на уровне контроля. При анализе этих результатов было учтено то обстоятельство, что подвижное равновесие ПОЛ и активности антиоксидантов в состоянии физиологического покоя смещено вправо - состояние, характерное для ранних этапов постнатального онтогенеза. При этом с неизбежностью образуется феноксильный радикал б-токоферола, не оказывающий существенного прооксидантного эффекта, однако накопление этих радикалов при значительном превышении физиологического уровня антиоксиданта способствует проявлению его выраженного прооксидантного действия (Ланкин В.З и сотр., 2001, Барабой В.А., 2001, Зенков Н.К и сотр., 2003). Следствием такого превышения концентраций б-токоферола у молодых крыс стало развитие перекисного гемолиза эритроцитов.

Под влиянием б-токоферола вариабельность размеров эритроцитов уменьшилась у молодых крыс (RDW = 8,34% ) и в большей степени у старых (RDW = 5,05%). Тот же эффект у старых животных оказал эмоксипин.

Воздействие антиоксидантами привело к увеличению общего уровня гемоглобина у молодых крыс и его уменьшению у старых животных (Р<0,01 в обоих случаях). В этих условиях добавочные дозы б-токоферола способствовали увеличению среднего содержания и средней концентрации гемоглобина в эритроците (Р<0,001 и Р<0,01соответственно), а у старых животных те же показатели уменьшились (МСН - Р<0,05, а МСНС - незначительно). Аналогичные по направленности, но менее выраженные по степени изменения МСН и МСНС произошли под влиянием эмоксипина.

Под влиянием как биологического, так и синтетического антиоксидантов сформировалась не характерная для интактных молодых и старых животных сильная отрицательная корреляция между количеством эритроцитов и их индивидуальным объемом (RBC - МCV).

Среди физико-химических факторов старения немалое значение придается свободнорадикальному окислению (Noguchi N. Niri E.,2000; Хавинсон В.А. и сотр., 2003; Анисимов В.Н., 2008). С учетом этого обстоятельства было исследовано влияние антиоксидантов на активность каталазы и свободнорадикальных процессов плазмы крови молодых и старых животных. Под влиянием антиоксидантов активность каталазы не претерпела существенных изменений у молодых крыс, а у старых - значительно уменьшилась (Р<0,001). Изменения каталазы в определенной степени сочетались с возрастной динамикой свободнорадикальных процессов крови. Так, добавление б-токоферола не изменило уровня ПОЛ плазмы крови молодых животных. эритроцит каталаза кровь крыса

В отличие от б-токоферола, эмоксипин достоверно увеличил скорость кинетических показателей ПОЛ. Вероятно, антиоксидантные возможности эмоксипина оказались сильнее, чем у б-токоферола, и эмоксипин при достаточном физиологическом уровне антиоксидантной защиты у молодых животных проявил гиперантиоксидантное действие.

В тех же условиях б-токоферол при действии на старых крыс резко уменьшил уровень МДА и величину кинетических показателей ПОЛ (Р<0,001) и значительно уменьшил уровень метаболитов оксида азота (Р<0,05), что свидетельствует о формировании при старении дефицита антиоксидантной защиты (Воскресенский О.Н. и сотр., 1962; Янькова В.И., Иванова И.Л., 2003).

Значительное уменьшение числа сфероцитов у старых животных под влиянием б-токоферола служит доказательством стабилизации эритроцитарной мембраны с учетом возрастного дефицита антиоксидантов.

Выраженные возрастные изменения под влиянием эмоксипина проявились в прооксидантном характере действия синтетического антиоксиданта на молодых животных. Так, число деформированных клеток возросло в 1,5 раза, эхиноцитов - в 5 раз, сфероцитов и каплевидных форм - в 2 раза в сравнении с контрольными значениями. Однако, при действии на старых крыс эмоксипин проявил четкий антиоксидантный эффект - вдвое уменьшилось число предгемолитических форм и полностью отсутствовали деформированные эритроциты.

Различия в действии антиоксидантов разной природы определяются, очевидно, различием химической структуры и, соответственно, свойств обоих антиоксидантов. Литературные данные не содержат сведений об эффектах эмоксипина на лабораторных животных, что осложняет интерпретацию его эффектов на живые системы, в том числе на эритроциты.

Воздействие антиоксидантами способствовало существенному приближению величины всех изучаемых геометрических показателей старых животных к величине аналогичных показателей у молодых крыс, что указывает на участие интенсификации процессов свободнорадикального окисления при старении как одной из основных причин формирования патологических форм эритроцитов.

Далее полученные результаты отличались рядом возрастных особенностей как в отношении концентрации эритроцитов (RBC), так и гематокрита (HCT) и объема клеток (MCV): у молодых животных СВСГ привел к эритроцитозу (Р<0,001) и увеличению HCT, некоторому уменьшению MCV, увеличению общего содержания гемоглобина (HGB) и изменению других показателей. В популяции эритроцитов старых животных общее количество эритроцитов, напротив, существенно уменьшилось (Р<0,001), как и среднее содержание гемоглобина в одном эритроците (МСН) (Р<0,001), а индивидуальный объем эритроцитов (MCV) резко возрос (на 53% в сравнении с контролем - Р<0,001). Эти данные свидетельствуют о значительном нарушении газотранспортной функции эритроцитов и гемоглобинсинтезирующих процессов эритроидных элементов костного мозга (Степовая Е.А. и сотр., 1994; Осипенко М.Д., 2009).

Коррекция антиоксидантами эффектов СВСГ вне зависимости от возраста способствовала значительному приближению показателей RBC, HCT и HGB крови к аналогичным контрольным значениями. Менее выраженный эффект оказал эмоксипин.

Результаты анализа корреляционных отношений между MCV и RBC

у молодых крыс при действии СВСГ демонстрируют формирование слабой положительной корреляции (r=0,33). В тех же условиях у старых крыс обозначилась высокая отрицательная взаимосвязь (r= -0,82). Действие антиоксидантов сформировало высокую отрицательную корреляцию у молодых и сохранило ее значение у старых животных. Изучение степени анизоцитоза (RDW) у крыс, подвергшихся действию СВСГ, показало на уменьшение этого показателя, особенно у молодых крыс - на 51%, у старых - на 45%. Воздействие б-токоферолом приблизило уровень RDW к величине контрольных показателей. У старых животных эмоксипин не оказал защитного действия.

Под влиянием СВСГ у молодых крыс общий уровень гемоглобина увеличился (Р<0,01). Показатели МСН и МСНС изменились незначительно. В тех же условиях у старых крыс СВСГ резко уменьшил содержание HGB (Р<0,001) и способствовал увеличению МСН и МСНС (Р<0,001) в обоих случаях).

При действии на молодых крыс б-токоферол оказал выраженное протекторное действие: уровень HGB увеличился в сравнении с аналогичным показателем у крыс группы СВСГ (Р<0,05). Столь же направленно б-токоферол проявил себя в отношении показателей МСН и МСНС (Р<0,01 и Р<0,001 соответственно). Менее выраженное защитное действие оказал эмоксипин.

Морфофизиологические изменения эритроцитов у старых крыс

и их особенности в условиях эндотоксикоза, вызванного ингаляцией СВСГ, в значительной мере определяются нарушением фосфолипидного состава эритроцитарных мембран, вызванного интенсификацией свободнорадикальных процессов.

Полученные данные свидетельствуют об усилении под действием газа перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ) у молодых (на 15%) и особенно у старых животных (на 57%) в сравнении с контрольными показателями (Р<0,01). Четкий защитный эффект антиоксиданты проявили только у старых крыс, приблизив уровень ПГЭ к контрольному. В исследованиях, проведенных ранее Р.И. Асфандияровым и сотр. (1995), у рабочих разных возрастных групп (не старых) авторы пришли к заключению, что по мере увеличения возраста и особенно длительности контакта с СВСГ, происходит постепенное истощение эритрона, сопровождающееся ухудшением морфофункциональных показателей мембран эритроцитов. Постепенное истощение эритрона при контакте с газом у людей трех возрастных групп, вызванное, в частности существенным ослаблением резистентности эритроцитарных мембран к гемолитикам, наблюдали ранее А.Е. Лазко и сотр. (2003) и В.И.Бойко с сотр., (2001), а также, в опытах на половозрелых крысах (Тризно Н.Н. и сотр., 2005)

Одним из существенных повреждающих механизмов действия серосодержащего газа является усиление цепного свободнорадикального окисления различных структур клеточных образований (Горбатенко Е.А., 1991; Тризно Н.Н. и сотр., 2005).

Сравнение действия СВСГ на показатели свободнорадикального окисления крови молодых и старых животных показало на явные возрастные различия: так, у молодых крыс все изучаемые показатели СРО увеличились вдвое в сравнении с контролем, в то время как у старых животных аналогичный эффект проявился только в отношении уровня МДА и скорости спонтанного ПОЛ. Полученные результаты подтверждают данные о большей экосенситивности эритрона в неполовозрелом возрасте, его относительной устойчивости в зрелом и разбалансированности процессов саморегуляции эритропоэза в старческом возрасте (Тупикова З.А., 1997).

б-Токоферол и эмоксипин оказали выраженное протекторное действие, достоверно снизив уровень ПОЛ крови вне зависимости от возраста животных, но более выражено у молодых крыс.

Полученные данные свидетельствуют о повышении концентрации суммарных метаболитов NO в крови животных, подвергнутых действию СВСГ (Р<0,001) и защитном действии антиоксидантов, более выраженном у старых животных.

Действие СВСГ значительно уменьшило активность каталазы крови

вне зависимости от возраста животных: (Р<0,01 - молодые; Р<0,001 - старые). Применение антиоксидантов ослабило действие газа на синтез каталазы крови вне зависимости от возраста животных (Р<0,01).

Оценка морфологии эритроцитов играет важную роль в анализе изменений функционального состояния эритроцитов и распознавании патогенетического варианта, в том числе в анализе гипоксического состояния, вызванного воздействием СВСГ. Такое воздействие в наших опытах вызвало уменьшение уровня дискоцитов вне зависимости от возраста (у молодых - на 22%, у старых крыс - на 18% в сравнении с контролем). В 4,7 раза возросло количество обратимо- и необратимо измененных форм эритроцитов у молодых крыс и в 4 раза - у старых. При этом в 12 раз (в сравнении с контролем) возросло количество эхиноцитов у молодых и появились эхиноциты в крови старых крыс. Таким образом, при действии индукторов окислительного стресса - газовых поллютантов АГКМ в плазме крови(особенно молодых животных) происходят существенные биохимические изменения, сопровождающиеся усилением свободнорадикальных процессов, что, по-видимому, приводит к нарушению процессов энергоснабжения эритроцитов. В результате образуются кренированные формы - эхиноциты, обладающие выраженной деформируемостью (Козинец Г.И., 1998).

Следует особо подчеркнуть большую, чем у старых животных реактивность крови молодых крыс к действию СВСГ, что, вероятно, связано с менее зрелыми механизмами адаптации к действию неблагоприятных факторов и менее выраженными компенсаторными возможностями эритропоэза на ранних этапах постнатального онтогенеза. Это нашло подтверждение в развитии более выраженной у молодых крыс эозинопении под влиянием СВСГ (у молодых - 262.4+10,11, в контроле - 395,0+15,64, Р<0,01; у старых - 415+21,06, в контроле -495,1+30,62, Р<0,05).

В формуле эритроцитов у старых животных при сочетанном действии СВСГ и антиоксидантов обнаружилось увеличение числа дискоцитов на 18,7% под влиянием б-токоферола и на 34,4% - эмоксипина. Эффективность действия антиоксидантов проявилась и по отношению к необратимо измененным формам эритроцитов: под влиянием б-токоферола их число уменьшилось на 47,4%, а эмоксипина - на 54,6%. Кроме того, обнаружилась тенденция к уменьшению обратимо измененных форм эритроцитов под влиянием б-токоферола на 30%, а эмоксипина - на 85%.

Экспериментально при остром и хроническом действии СВСГ убедительно доказан мембраностабилизирующий эффект б-токоферола и ионола, но преимущественно на показатели эритропоэза (Сетко Н.П., 1986; Полунина О.С., 2000; Осипенко М.Д. 2009; и др.). Наши исследования подтвердили результативность применения антиоксидантов в качестве протекторов нарушения баланса про- и антиоксидантов (как одного из важных механизмов токсического действия СВСГ на эритрон), но выявили также возрастные особенности нормализации формы эритроцитов и особенности стресспротекторного действия биологического и синтетического антиоксидантов.

Анализ изменений геометрических показателей функционального состояния эритроцитов и их изменений под влиянием серосодержащего газа проведенный с помощью аппаратно-программного комплекса МЕКОС-Ц, показал значительное увеличение площади эритроцитов (Р<0,01) без существенных изменений других геометрических показателей у молодых животных. В тех же условиях у старых крыс под действием СВСГ значительно уменьшились площадь эритроцитов (Р<0,001), средний диаметр (Р<0,01) и поляризация клеток (Р<0,01). При этом фактор формы значительно превзошел тот же показатель у молодых крыс (Р<0,01) (рис. 2)

б-Токоферол не оказал корригирующего действия на величину площади эритроцитов у молодых крыс, измененную под действием СВСГ, а у старых крыс достоверно уменьшил уровень изрезанности контура эритроцитов в сравнении с теми же показателями у животных, подвергшихся действию СВСГ (Р<0,01).

Рис 2. Влияние антиоксидантов, СВСГ и их сочетаний на средние геометрические показатели эритроцитов молодых крыс.

Более результативно проявилось действие эмоксипина: у молодых животных эмоксипин способствовал нормализации эллиптичности клеток (Р<0,05), а у старых - значительно ослабил негативные последствия от действия СВСГ на геометрические показатели эритроцитов.

Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о возрастзависимых отклонениях от физиологического уровня преобладающего числа исследованных морфофизиологических параметров функционального состояния эритроцитов периферической крови, указывая на отсутствие стабильности этих показателей в позднем онтогенезе, на значительные нарушения газотранспортной функции эритроцитов и гемоглобинсинтезирующих процессов, особенно четко выраженных при ингаляции животных сероводородсодержащим газом.

Результаты свидетельствуют о возрастзависимой степени коррекции антиоксидантами старческих изменений периферического звена эритрона и нарушений, вызванных газовыми поллютантами особенно у старых животных и большей стабильности антиоксидантного действия б-токоферола в сравнении с эмоксипином.

ВЫВОДЫ

1. При старении обнаружены изменения морфофизиологических показателей эритроцитов, характерные для микроцитарной анемии: увеличение гематокрита, числа эритроцитов, уменьшение индивидуального объема клеток, среднего содержания и средней концентрации эритроцитов при сохранении общего уровня гемоглобина, увеличение количества аномальных форм и геометрических показателей эритроцитов, рост анизоцитоза.

2. У молодых животных б-токоферол понижает гематокрит, уменьшает число и увеличивает индивидуальный объем эритроцитов, способствует увеличению патологических форм и степени перекисного гемолиза эритроцитов, проявляя тем самым гиперантиоксидантное действие.

3. У старых крыс б-токоферол оказывает характерное антиоксидантное действие, приближая величину исследованных морфофизиологических показателей к уровню интактных молодых животных.

4. Синтетический антиоксидант - эмоксипин - существенно не изменяет большую часть исследованных показателей эритроцитов молодых крыс, а у старых оказывает прооксидантное действие, проявляющегося в формировании анемии и повышении проницаемости эритроцитарных мембран.

5. Снижение стабильности эритроцитарных мембран у старых животных связано с возрастной интенсификацией свободнорадикальных процессов в плазме крови (показателей ПОЛ и метаболитов оксида азота). б-Токоферол снижает уровень свободнорадикальных процессов. Менее выраженное, но аналогичное действие оказывает эмоксипин.

6. Вне зависимости от возраста серосодержащие газовые поллютанты проявляют токсическое действие, повышая активность каталазы и свободнорадикальные процессы в крови.

7. Хроническое воздействие малыми дозами серосодержащего газа формирует возрастзависимые изменения эритроцитов: у молодых животных - эритроцитоз, рост гематокрита и общего содержания гемоглобина, значительное уменьшение площади и поляризации эритроцитов; у старых - эритропению, микроцитоз с уменьшением степени насыщения клеток гемоглобином, нарушение геометрических показателей и увеличение патологических форм эритроцитов.

8. Антиоксиданты (значительнее б-токоферол) оказывают стресс-протекторное действие на эритроциты животных, подвергшихся интоксикации, существенно приближая величину морфофизиологических показателей эритроцитов к контрольному уровню вне зависимости от возраста животных, но стабилизируя мембрану эритроцитов только у старых крыс.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мажитова М.В., Теплый Д.Д. Возрастные и половые особенности свободнорадикальных процессов и антиоксидантной защиты плазмы крови белых крыс // Журнал естественные науки.-2010.- №193.- с.79-85

2. Мажитова М.В., Теплый Д.Д., Тризно Н.Н. / Влияние сероводородсодержащего газа Астраханского месторождения на содержание конечных метаболитов NO и уровня малонового диальдегида в плазме крови белых крыс // Материалы 6-ой научно-практической конференции «Достижения фундаментальной науки в решении актуальных проблем медицины». -Астрахань - Москва. - 2008.-Т.3, №3.- с. 261-263.

3. Мажитова М.В., Теплый Д.Д., Теплый Д.Л., Тризно Н.Н., Карнеева Д.В., Ходарина О.А. / Модуляция перекисного окисления липидов в разных отделах ЦНС под воздействием сероводородсодержащего газа // - Материалы 15-ой Международной конференции «Экология и жизнь». - Пенза. 2008.- с. 32-34.

4. Теплый Д.Д. / Возрастные особенности эритроцитов периферической крови белых крыс и реакции на действие биологических и синтетических антиоксидантов // Журнал «Естественные науки».-2009.- №3(28). - с. 143-152.

5. Теплый Д.Д. / особенности морфологических показателей эритроцитов белых крыс на раннем и позднем этапах онтогенеза // Журнал «Естественные науки»- 2011, №1.(34) с. 139-143.

6. Теплый Д.Д. Влияние природного газа сероводорода на эритроцитарные показатели самцов половозрелых белых крыс при коррекции витамином Е / Д.Д. Теплый, О.Н. Позднякова // 12-ая Пущинская научная школа-конференция молодых ученых, (Пущино, 10-14 ноября 2008 года). Сборник тезисов. - Пущино, 2008. - С. 153-154.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

RBC - эритроциты

HGB - гемоглобин

HCT - гематокрит

MCV - средний объем эритроцита

MCH - среднее содержание гемоглобина в эритроците

MCHC - средняя концентрация гемоглобина в эритроците

EOS - эозинофилы

RDW - анизоцитоз

ЦП - цветной показатель

ЦНС - центральная нервная система

ПОЛ - перекисное окисление липидов

МДА - малоновый диальдегид

ПГЭ - перекисный гемолиз эритроцитов

б-ТФ - б-Токоферол

ЭМ - эмоксипин

СВСГ - сероводородсодержащий газ

СРО - свободнорадикальное окисление

NO - оксид азота

Размещено на Allbest.ru