Влияние вакцины Гриппол на радиорезистентность организма

Размещено на http://www.allbest.ru/

03.01.01 - Радиобиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Влияние вакцины Гриппол на радиорезистентность организма

Рогожин Дмитрий Владимирович

Москва - 2010

Работа выполнена на базе Федерального государственного учреждения "Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России"

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Иванов Александр Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Осипов Андреян Николаевич

доктор биологических наук, Штемберг Андрей Сергеевич

Ведущая организация: "Объединенный институт ядерных исследований", г. Дубна.

Защита состоится часов на заседании диссертационного совета Федерального государственного учреждения "Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России" по адресу: 123182, г. Москва, ул. Живописная, д.46

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор Н.К. Шандала

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Возможность повышения устойчивости организма к поражающему действию ионизирующего излучения с помощью вакцин известна давно (Клемпарская Н.Н., Раева Н.В. и Сосова В.Ф., 1963) . При этом установлено, что противолучевой эффект наблюдается при использовании бактериальных и вирусных вакцин как при профилактическом, так и при лечебном их применении. Возможность использования для этих целей гриппозной вакцины, применяемой для иммунизации населения, продемонстрирована на инактивированной хроматографически чистой (тип А 1 и А 2) вакцине производства Омутнинского химического завода Кировской области (Иванов А.А. и соавт.,1995) . Показано, что профилактическое введение этой вакцины повышало выживаемость облученных и защищенных животных по сравнению с незащищенными на 25-40 %. Однако, данная вакцина снята с производства в связи с ее слабыми специфическими иммуногенными свойствами. вакцина вирусный бактериальный

В настоящее время для иммунизации населения широко применяется вакцина Гриппол, разработанная сотрудниками Государственного научного центра - Института иммунологии ФМБА России. На данный момент вакциной иммунизировано уже более 40 млн. человек. Разработчики вакцины установили, что Гриппол не только формирует специфический противовирусный иммунитет, но и повышает устойчивость организма человека к другим острым респираторным заболеваниям (Хаитов Р.М. и соавт.,2001) Однако, механизмы этой устойчивости до конца не расшифрованы. В связи с этим, представлялось актуальным исследовать динамику интерферонового статуса организма под влиянием вакцины Гриппол, поскольку система ИФН является одной из важнейших систем, обеспечивающих неспецифическую противовирусную резистентность организма.

К моменту начала работы не было обнаружено каких-либо публикаций, посвященных влиянию вакцины Гриппол на интерфероновый статус организма. В рассмотренных нами публикациях остается не изучен вопрос о противолучевой эффективности Гриппола, как вакцины массового применения, и установлении механизма повышения радиорезистентности под влиянием вакцины, что, безусловно, является актуальным и имеет не только научный, но и практический интерес.

Цель работы

Определить способность вакцины Гриппол повышать радиорезистентность, а также роль иммунологических механизмов в противолучевом действии данной вакцины.

Основные задачи исследования:

· Исследовать противолучевое действие вакцины Гриппол.

· Исследовать влияние вакцины Гриппол на интерфероновый статус животных и человека.

· Исследовать влияние вакцины Гриппол на специфический иммунный ответ.

· Установить коррелятивные связи между уровнем интерферонов и радиорезистентностью организма.

· Обосновать возможность переноса данных о противолучевом действии вакцины Гриппол с животных на человека.

Научная новизна

Впервые изучено влияние вакцины Гриппол на радиорезистентность организма. Показано, что вакцина, введенная в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения (7,5 Гр), статистически достоверно повышает выживаемость мышей в опытной группе по сравнению с контрольной, на 25% и 60%, и положительно влияет на динамику массы тела, показатели периферической крови мышей при облучении в минимальной летальной дозе (6 Гр).

Введение Гриппола собакам в дозе 0,5 мл за 16 суток до облучения в дозе 2,5 Гр, оказывает положительное влияние на скорость восстановления показателей периферической крови.

Впервые выявлена взаимосвязь между уровнем противолучевой резистентности и содержанием сывороточного ИФН в периферической крови организма. Показано, что темпы падения содержания лейкоцитов периферической крови у сублетально облученных собак ниже в группе с исходно высоким до облучения содержанием ИФН в сыворотке по сравнению с аналогичными показателями в группе с низким содержанием ИФН в сыворотке.

Разработаны критерии переноса данных о противолучевых свойствах Гриппола с животных на человека. Согласно нашим данным, повышенное содержание сывороточного ИФН в сыворотке крови перед облучением повышает выживаемость животных

Положения, выносимые на защиту

· Вакцина Гриппол обладает противолучевыми свойствами.

· Вакцина Гриппол активирует процессы интерфероногенеза в организме животных и человека.

· Периоды повышения радиорезистентности, формируемые после иммунизации вакциной Гриппол, совпадают со временем повышения интерферонсинтезирующей активности клеток крови.

Практическая значимость

Результаты данного исследования позволяют рекомендовать Гриппол как препарат двойного действия - антигриппозного и как средство повышения радиорезистентности. Вакцина может быть предназначена, в частности, для иммунизации работников атомной промышленности, личного состава Российской Армии, сотрудников МЧС и других групп риска радиационного воздействия. Основываясь на данных о повышении интерферонсинтезирующей способности лейкоцитов крови после иммунизации у человека (7-56 сутки) и у животных (7-21 сутки), а также на данных о том, что в период 7-21 суток у животных отмечено повышение радиорезистентности можно прогнозировать повышение радиорезистентности у человека в период 7-56 суток после иммунизации.

Экспериментальные данные, приведенные в диссертационной работе, включены в методические рекомендации по использованию показателей интерферонового статуса для прогнозирования радиорезистентности и методические рекомендации по применению вакцины "Гриппол" для повышения неспецифической противолучевой резистентности.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на ХIV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство",

VI Всероссийском конгрессе "Профессия и здоровье" и на научной конференции отдела №1 Федерального государственного учреждения Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 5 печатных работ (из них 2 статьи) в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура диссертационной работы:

Диссертация состоит из введения, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Работа изложена на 98 страницах, иллюстрирована 8 таблицами и 16 рисунками. Библиографический указатель включает в себя 123 наименования печатных источников, из них 31 на иностранных языках.

Материалы и методы

Экспериментальные животные

Исследования проводили на мышах CBA??С 57B1 (F1) самцах (масса тела 20-21г) и беспородных собаках обоего пола (масса тела 13-24 кг). Во время экспериментов животные содержались в условиях вивария, соответствующих санитарным нормам (рекомендованный рацион, свободный доступ к питьевой воде), при естественном фоне освещенности и температуре воздуха 20-22оС.

Все работы проведены в соответствии с "Общими положениями по соблюдению стандартных условий проведения опытов на животных в ИБФ" и "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (Приказ Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977).

Эксперименты выполнены на 346 мышах и 15 собаках.

Группа добровольцев

Исследование влияния вакцины Гриппол на интерфероновый статус проводилось на 12 добровольцах. Группа состояла из 2 мужчин и 10 женщин в возрасте 22-30 лет, иммунизированных вакциной Гриппол (серия С Н 2-0906, производитель ФГУП НПО "Микроген") в эпидемическом сезоне 2008 года. Одна иммунизирующая доза Гриппола (0,5 мл) содержит по 5 мкг гемагглютинина штаммов вирусов гриппа типов A (H1N1), A (H3N2), 11 мкг вируса гриппа типа В и 500 мкг полиоксидония. Вакцина является высокоочищенным препаратом, свободным от примесей невирионного происхождения. Консервант - мертиолят от 85 до 115 мкг/мл.

Оценка радиопротекторных свойств вакцины Гриппол.

Тотальное облучение мышей и собак проводили гамма-квантами 137Сs на установке ИГУР. Мощность дозы 1,2- 2,0 рад/сек. Контроль за мощностью дозы и ее пространственным распределением проводили с помощью термолюминисцентного дозиметра ИКС-А с использованием термолюминисцентного алюмофосфатного стекла ИС-7 с погрешностью ±10 %. В качестве модели использовали однократное равномерное радиационное воздействие, вызывающее костномозговую форму острой лучевой болезни различной степени тяжести. Использованы дозы облучения с различной биологической активностью: 6,0 (СД 10/30) и 7,5 (СД 70/30) Гр для мышей и 2,5 Гр - для собак (СД 30/45).

В качестве радиозащитного средства использовали Гриппол, оценивали влияние вакцины на выживаемость и динамику массы тела мышей на 30 сутки течения ОЛБ, а также выживаемость собак на 45 сутки после облучения. Состав периферической крови облученных животных определяли с использованием гематологического анализатора Alcon-6. Гриппол вводили мышам однократно подкожно в область задней лапы в дозе - 0,5; 0,2 и 0,05 мл за 7 или 14 суток до облучения. Собак иммунизировали подкожно в область предплечья за 16 суток до облучения, доза вакцины - 0,5 мл. Контрольным животным вводили официнальный 0,9% раствор хлорида натрия - мышам 0,2 мл, собакам -0,5 мл.

Специфический ответ на иммунизацию Грипполом необлученных мышей и собак.

Для изучения специфического иммунного ответа использовалась однократная иммунизация вакциной Гриппол, мышей в дозе 0,2 мл, собак - 0,5 мл. Сроки забора крови - до иммунизации на 1,7,14,28,35 сутки.

Оценка интерфероногенных свойств вакцины Гриппол.

В эксперименте по оценке интерфероногенных свойств Гриппола облучение животных не проводилось. Мышей вакцинировали однократно внутрибрюшинно в дозе 0,2 мл. Интерфероновый статус определяли через 4 часа спустя 1, 7, 14 и 28 суток после введения вакцины. Собак иммунизировали однократно в область предплечья в дозе 0,5 мл. Забор крови проводили через 7,14,21,28,35 суток. Добровольцев иммунизировали однократно в дельтовидную мышцу (доза вакцины - 0,5 мл). Обследование проводили через 1,7,14,28 и 60 суток.

Анализ взаимоотношений уровня радиорезистентности и интерферонового статуса.

Эксперимент проводили на 15 собаках обоего пола, массой тела 12-15 кг. Животных подвергали воздействию г-лучей 137Сs в дозе 2,5 Гр (СД 30/45). До облучения у животных определяли содержание ИФН в сыворотке крови и состав периферической крови. На 7-е, 14-е, 21-е, 28-у и 35-е сутки после облучения определяли клеточный состав периферической крови и скорость оседания эритроцитов. После облучения животных разделили на две группы - согласно исходным значениям сывороточного ИФН - титр ИФН ? 8 и титр

ИФН < 8. Затем провели сопоставление показателей выживаемости облученных собак и скорости восстановления гемопоэза с исходным уровнем сывороточного ИФН.

Схема исследования влияния вакцины Гриппол на интерферонсинтезирующую активность клеток периферической крови и специфический иммунный ответ.

Добровольцев и животных иммунизировали вакциной Гриппол за 7 и 14 суток до облучения. Мышам вводили подкожно по 0,2 мл, собакам - по 0,5 мл, добровольцам - по 0,5 мл вакцины. Обследование контрольных и опытных мышей проводили на каждом сроке опыта (динамический контроль), через 4 часа, 1, 7, 14 и 28 суток после иммунизации. Добровольцев и собак, предварительно обследовали до иммунизации, для определения титров сывороточного ИФН и интерферонсинтезирующей активности клеток крови, а затем в динамике исследования. Забор крови у собак проводили через 1,7,14,21,28,35 суток после введения вакцины и у добровольцев - через 1,7,14,28 и 56 суток. Одну часть полученных от экспериментальных животных проб использовали для определения в сыворотке крови уровня специфических антител методом РТГА (реакция торможения гемагглютинации), в другую часть добавляли гепарин (5 ед/мл) и определяли способность лейкоцитов крови продуцировать б - и г - ИФН после взаимодействия с индукторами.

Количественную оценку уровня специфических антигемагглютининовых антител проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в соответствии с МУ 3.3.2. 1758-03 "Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа"

Состояние системы синтеза б - и г - ИФН у животных определяли по уровню продукции этих цитокинов лейкоцитами, выделенными из периферической крови, после воздействия вирусным индуктором - вирус болезни Ньюкастла (ВБН) в дозе 1-10 цитопатических доз (ЦПД) на 1 лейкоцит для б - интерферона и митогеном - фитогемагглютинин (ФГА) в дозе 1-10 ед/мл для г - интерферона. Определение активности синтезируемого лейкоцитами ИФН у мышей и собак проводили путем титрования на культуре клеток костно-мышечной ткани эмбриона человека (диплоидный кариотип) против вируса энцефаломиокардита мышей (ЭМС). Активность ИФН у привитых добровольцев оценивали методом двухстадийного иммуноферментного анализа. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами. Имеющийся в образцах б -ИФН связывается с иммобилизованными антителами. Несвязавшийся материал удаляли отмывкой. Связавшийся б -ИФН взаимодействует при инкубации с конъюгатом антител к б -ИНФ человека с пероксидазой хрена. После второй отмывки количество связавшегося конъюгата определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена - перекиси водорода и хромогена - тетраметилбензидина. Реакцию останавливали добавлением раствора серной кислоты и измеряли оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству содержащегося в образце б -ИФН. Титр б - и г -ИФН определяли по калибровочной прямой.

Методы статистического анализа.

Полученный цифровой материал обработан с помощью общепринятых методов вариационной статистики, а также встроенного пакета статистического анализа MS Excel 2003. Достоверность различий сравниваемых средних величин оценивали по t-критерию Стьюдента. Для выявления корреляций вычислялся стандартный коэффициент корреляции. Достоверность данных, полученных по выживаемости животных, оценивали методами ч2 и критерием Фишера.

Расчет точности прогноза выживаемости облученных в летальной дозе животных в зависимости от исходного уровня сывороточного ИФН проводили по тесту Т. Шеллинга-Вольфеля (Малета Ю.С., Тарасов В.В., 1982).

Результаты и обсуждение

3.1 Противолучевое действие Гриппола

В экспериментах по исследованию влияния Гриппола на выживаемость мышей, облученных в дозе 7,5 Гр, были получены следующие данные. Введение Гриппола за 14 суток до облучения повышает выживаемость мышей в опытной группе на 60%, по сравнению с контрольной. Эффект статистически значим: ч2=5,2 p=0,02. Менее эффективно введение вакцины за 7 суток. Выживаемость защищенных мышей на 25% выше таковой в контроле. Эффект статистически не значим по сравнению с контрольной группой. Результаты проиллюстрированы в таблице 1.

Таблица 1 - Выживаемость мышей, защищенных Грипполом в дозе 0,2 мл до облучения гамма-квантами 137Сs в дозе 7,5 Гр.

Группа мышей	Срок введения вакцины до облучения, сут.	Число мышей	Из них	Выживаемость за 30 суток, (M±m, %)
			Пало	Выжило
Опыт	14	10	1	9	90±10
Контроль	-	10	7	3	30±15
Опыт	7	12	3	9	75±13
Контроль	-	10	5	5	50±16

Полученные результаты подтверждаются данными по динамике массы тела. Из таблицы 2 видно, что у мышей, облученных в дозе 7,5 Гр, отмечается четко выраженное падение массы тела, тогда как в опытной группе, защищенной Грипполом в дозе 0,2 мл, отмечается меньшая глубина снижения массы тела на 15-е сутки после облучения. Соответственно, масса мышей на 15 сутки ОЛБ в опытной группе составляла 22,4±0,4 г, в контрольной - 20,4±0,8 г. Как известно, наиболее важным показателем в проявлении радиобиологического эффекта является состояние периферической крови. Результаты оценки влияния вакцины Гриппол на состав периферической крови мышей представлены в таблице 3. Получены статистически достоверные данные: у мышей, защищенных вакциной Гриппол, введенной в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения, а так же - в дозе 6,0 Гр, на 8 сутки течения ОЛБ, содержание нейтрофилов, ретикулоцитов, эритроцитов и гемоглобина в периферической крови выше, по сравнению с мышами контрольной группы.

Таблица 2 - Динамика массы тела у мышей, защищенных вакциной Гриппол, вводимой за 7 суток до облучения гамма-квантами 137Сs в дозе 7,5 Гр (М±m, г)

Доза вакцины, мл	Время обследования после облучения, сут.
	0	7	10	15	20
0,5	23,6±0,3	20,5±0,9	20,8±0,9	21,5±0,7	22,5±0,5
0,2	23,8±0,1	22,0±0,3	22,0±0,3	22,4±0,4*	23,4±0,5
0,05	24,1±0,2	21,9±0,4	21,1±0,7	19,7±0,9	21,7±1,0
Контроль облучения	23,1±0,6	21,5±0,6	21,7±0,7	20,4±0,8	22,0±0,6

Примечание. * статистически значимая разница по сравнению с контролем, критерий Стьюдента, р<0,05.

Как известно, наиболее важным показателем в проявлении радиобиологического эффекта является состояние периферической крови. Результаты оценки влияния вакцины Гриппол на состав периферической крови мышей представлены в таблице 3. Получены статистически достоверные данные: у мышей, защищенных вакциной Гриппол, введенной в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения, а так же - в дозе 6,0 Гр, на 8 сутки течения ОЛБ, содержание нейтрофилов, ретикулоцитов, эритроцитов и гемоглобина в периферической крови выше, по сравнению с мышами контрольной группы.

Таблица 3 - Влияние вакцины Гриппол, введенной в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения мышей в дозе 6,0 Гр (СД 10/30), на показатели периферической крови.

Клетки крови	Группа животных	До Облучения	После облучения,8-е сутки
Нейтрофилы (х 109/л)	Контроль	0,9±0,1	0,1±0,02
	Опыт		0,3±0,04*
Ретикулоциты (х 109/л)	Контроль	201,2±19,7	18,1±3,8
	Опыт		114,8±16,8 *
Эритроциты (х 1012/л)	Контроль	9,9±0,3	8,3±0,1
	Опыт		9,3±0,2*
Гемоглобин (г/л)	Контроль	128,5±5,1	105,4±2,2
	Опыт		119.1±1,8*

Примечание. * статистически значимая разница по сравнению с контролем, критерий Стьюдента, р<0,05.

Суммируя вышеизложенное, следует отметить, что вакцина Гриппол, введенная в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения, оказывает благоприятное влияние на состояние периферической крови облученных мышей и способствует более интенсивному восстановлению массы тела в период ОЛБ. Полученные данные полностью согласуются с литературными сведениями по хроматографической вакцине (Иванов А.А. и соавт.,1995).

В экспериментах на 15 собаках, разделенных на опытную и контрольные группы - 7 и 8 животных соответственно, и облученных в дозе 2,5 Гр, статистически достоверных различий по тесту выживаемости не отмечено. Однако наблюдается положительное влияние Гриппола, введенного до облучения, на показатели периферической крови. Данные представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Влияние вакцины Гриппол на динамику показателей периферической крови у собак, облученных в дозе 2,5 Гр.

Показатель (М±m)	Наличие или отсутствие вакцинации, +/-	Время после облучения, сут
		Фон	7	14	21	35
Лейкоциты, x109л	+	11,9±1	4,3±0,4	1,9±0,5	4,4±0,9	7,9±2,5
	-	11,2±0,9	4,3±0,3	1,8±0,3	2,4±0,7	5,1±1,8
Тромбоциты, x109л	+	190,2±14,3	100,3±9,6	14,3±7,1	31,7±4,2	88±22,7
	-	180,1±9	100,8±6,2	12,4±2,4	21,3±6,7	108,3±41
Эритроциты x1012л	+	7±0,2	6±0,2	5,9±0,3	5,9±0,3	5,9±0,2
	-	6,8±0,2	6,1±0,2	5,7±0,2	5,6±0,6	5,1±0,6
СОЭ, мм/ч	+	5±1,4	14,9±5,3	30,5±8,4	12±9	5±2,5
	-	4,8±1,3	10,1±4	29,1±8,9	27,8±8,1	29,5±14

Как видно из таблицы, у облученных собак развивается существенное нарушение показателей периферической крови, отмечается выраженная лейкопения, тромбопения, увеличение СОЭ. Тогда как у собак в опытной группе, иммунизированных Грипполом за 16 суток до облучения в дозе 0,5 мл, наблюдается определенное восстановление числа форменных элементов периферической крови, что особенно четко прослеживается по определению увеличения содержания количества лейкоцитов в восстановительный период (рисунок 1,2).



Рисунок 1 - Динамика содержания лейкоцитов периферической крови у собак, облученных в дозе 2,5 Гр.

Рисунок 2 - Содержание лейкоцитов в периферической крови собак иммунизированных вакциной Гриппол и облученных (1) и только облученных гамма-квантами в дозе 2,5 Гр (2)

Представленные данные свидетельствуют о благоприятном влиянии вакцины Гриппол на динамику восстановления показателей периферической крови.

Подводя итог, следует отметить, что вакцина Гриппол, введенная в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения (6 Гр и 7,5 Гр), статистически достоверно повышает выживаемость облученных в летальной дозе мышей, положительно влияет на динамику массы тела и показатели периферической крови. Введение Гриппола собакам в дозе 0,5 мл за 16 суток до облучения в дозе 2,5 Гр, оказывает положительное влияние на скорость восстановления показателей периферической крови.

Специфический ответ на иммунизацию Грипполом необлученных мышей и собак.

При однократной иммунизации мышей вакциной Гриппол в дозах, применяемых в радиобиологических экспериментах, удалось зарегистрировать наличие иммунного ответа невысокой интенсивности. Результаты исследования проиллюстрированы на рисунке 3. Представлена динамика титров антител к трем штаммам, входящим в состав вакцины Гриппол в эпидемическом сезоне 2005-2006г.г: A/New Caledonia (H1N1), A/New York (H3N2) и B/Jiangsu.

Рисунок 3 - Среднее геометрическое титра АТ к гемагглютинину различных штаммов вируса гриппа у мышей, однократно иммунизированных вакциной Гриппол в дозе 0.2 мл.

Как видно на рисунке 3, для штаммов типа А титр антител растет, начиная с 7 дня, и достигает защитного титра (1:40) к 14 суткам (для H1N1) и 28 (H3N2) дням. Уровень антител к гемагглютинину штамма B/Jiangsu также возрастает, однако более плавно и не достигает уровня защитного титра в течение наблюдаемого периода. Известно, что по вирулентности, эпидемической значимости и иммуногенности вирусы гриппа типа В уступают вирусам гриппа типа А (Карпухин Г.И, 2001; Hu YM .,2005). Поэтому, по-видимому, однократной иммунизации в низкой дозе оказалось недостаточно для этого штамма.

При однократной иммунизации вакциной Гриппол собак в дозе 0,5 мл максимальные значения титров АТ к штаммам вируса грипп A/New Caledonia (H1N1) и A/New York (H3N2) регистрировались на 35 сутки после введения вакцины. Хотя защитных значений титры не достигали, можно с уверенностью говорить об активации специфического звена иммунитета. Результаты представлены на рисунке 4.

Рисунок 4 - Среднее геометрическое титра АТ к гемагглютинину различных штаммов вируса гриппа у собак, однократно иммунизированных вакциной Гриппол в дозе 0.5 мл.

Титры АТ к штамму A/New Caledonia (H1N1) начинают расти на 7 сутки, а к штамму A/New York (H3N2) к 14 суткам. Исходно высокие и колеблющиеся на протяжении всего исследования титры АТ к штамму B/Jiangsu можно объяснить таксономической близостью вируса гриппа типа В к вирусу парагриппа собак и отсутствием в этой связи выраженного ответа на иммунизацию.

Интерфероногенные свойства вакцины Гриппол

Результаты динамического наблюдения интерферонсинтезирующей активности лейкоцитов крови иммунизированных животных и добровольцев представлены на рис 5 (а, б,в) и рис 6 (а, б,в). Установлено, что титры б - ИФН у мышей достигают максимальных значений на 7 сутки (435,2 ед./мл) (рис 5а), а у собак на 14 сутки (480 ед./мл) (рис 5б) после введения вакцины. Максимальные титры г - ИФН у мышей определялись на 28 сутки (>40 ед./мл) (рис 6а) и у собак на 21 сутки (25,6 ед/мл) (рис 6б). Рассматривая динамику системы б - ИФН, полученную в группе обследованных добровольцев можно проследить общую направленность, как у животных так и у человека, в изменении системы ИФН после иммунизации вакциной Гриппол.

Согласно нашим данным, максимальные титры б - ИФН в группе добровольцев отмечаются на 7 сутки (732 пг/мл) и на второй месяц (886 пг/мл) после вакцинации (рис 5в). Титры г - ИФН у привитых добровольцев демонстрируют иную динамику. Постепенно снижаясь, титры г - ИФН достигают минимальных значений на 7 сутки (427 пг/мл), затем плавно нарастают до 783 пг/мл во втором месяце наблюдений (рис 6в).

Рисунок (а) - Эксперименты на мышах

* - 7 сутки, значение статистически достоверно, p=0,023,t=-2,739



Рисунок (б) - Эксперименты на собаках

* - 14 сутки, значение статистически достоверно p=0,047,t=-2,350

Рисунок (в) - Наблюдения за добровольцами

* - 7 сутки, значение статистически достоверно p=0,01,t=-2,817

** - 2-ой месяц, значение статистически достоверно p=0,00,t=-4,511

Рисунок 5 (а, б, в) - Интерферон-б синтезирующая активность клеток периферической крови после иммунизации вакциной Гриппол.

среднее значение титра ИФН; - - - - границы доверительного интервала значений у неиммунизированных животных и человека



Рисунок (а) - Эксперименты на мышах

* - 28 сутки, значение статистически достоверно p=0,03,t=-2,566

Рисунок (б) - Эксперименты на собаках

* - 14 сутки, значение статистически достоверно p=0,038,t=-2,475

** - 21 сутки, значение статистически достоверно p=0,011,t=-3,267



Рисунок (в) - Наблюдения за добровольцами

* - 7 сутки, значение статистически достоверно p=0,015,t=2,642

** - 14 сутки, значение статистически достоверно p=0,041,t=2,167

Рисунок 6(а, б, в) - Интерферон-г синтезирующая активность клеток периферической крови после иммунизации вакциной Гриппол

среднее значение титра ИФН; - - - - границы доверительного интервала значений у неиммунизированных животных и человека

Как следует из представленных данных, максимальные титры б- ИФН у мышей отмечаются на 7 сутки, у собак - на 14 сутки, что подтверждается литературными источниками (Иванов А.А. и соавт.,1995). Известно, что б- ИФН, усиливающий специфический иммунный ответ, относится к цитокинам, определяющим ранние цитокиновые реакции организма на введение антигенов, а г - ИФН, как один из регуляторных цитокинов иммунной системы, может служить показателем сдвига иммунных реакций в сторону Т-клеточного ответа, активации макрофагов и NK-клеток. Титры г - ИФН, по нашим данным, достигают максимальных значений у мышей на 28 сутки, у собак на 21 сутки. Отличие во времени обнаружения максимальных титров интерферона у мышей и собак наиболее вероятно объясняется видовыми физиологическими особенностями подопытных животных. В наблюдениях за динамикой титров б- ИФН у вакцинированных Грипполом добровольцев наибольшие значения титров отмечается на 7 и 60-е сутки, титры г - ИФН не повышены.

Таким образом, вакцина Гриппол помимо усиления выработки специфических противогриппозных антител обладает неспецифическим эффектом, а именно стимулирует процессы интерфероногенеза. Поскольку реакция системы ИФН опережает развитие специфического иммунного ответа, вероятно именно стимуляция интерфероногенеза обуславливает развитие первой ранней неспецифической фазы повышения резистентности, развивающейся до формирования иммунного ответа.

Учитывая литературные данные, описанное влияние вакцины Гриппол на продукцию б - и г - ИФН, можно объяснить двумя составляющими: непосредственно биологическими свойствами гриппозных антигенов и наличием в составе вакцины иммуномодулятора полиоксидония.

Как известно, моноциты/макрофаги, нейтрофилы и лимфоциты являются источниками цитокинов. Активация функциональной активности клеток моноцитарно-макрофагальной системы лежит в основе выраженного клинического эффекта полиоксидония при разных по этиологии патологических процессах. В частности, показано, что полиоксидоний обладает способностью активировать продукцию цитокинов лейкоцитами периферической крови (Петров Р.В. и соавт.,1999). Полиоксидоний усиливает продукцию ИЛ-1в, ИЛ-6, ФНО-б, т.е. цитокинов, продуцируемых преимущественно клетками моноцитарно-макрофагальной системы. Под влиянием полиоксидония активируются практически все звенья иммунной система организма.

Наблюдаемые в данном исследовании изменения интерферонового статуса на фоне нарастания титра специфических антител являются отражением целого ряда метаболических процессов в ходе ответа на вакцинацию. Полученные данные позволяют предполагать, что вакцина Гриппол, помимо усиления выработки специфических противогриппозных антител, обладает широким спектром неспецифических эффектов, обеспечивающих повышение резистентности при различных видах иммунозависимых патологий.

Экспериментальные данные, приведенные выше, позволяют перейти к оценке взаимосвязи между уровнем радиорезистентности и интерфероновым статусом организма.

Анализ взаимоотношений уровня радиорезистентности и интерферонового статуса животных.

После облучения животных разделили на две группы согласно исходным значениям сывороточного ИФН: титр ИФН ? 8 и титр ИФН < 8. Затем провели сопоставление показателей смертности облученных собак с исходным уровнем сывороточного ИФН. При оценке статистической значимости различий по выживаемости из выборки были исключены 2 животных с неопределяемыми титрами сывороточного ИФН (титр =0)

Таблица 5. Влияние исходного уровня сывороточного интерферона в сыворотке крови на выживаемость собак после облучения в дозе 2,5 Гр.

Группа	Число животных	Радиобиологический эффект
		Выжило, число животных (инд. значения ИФН, титр)	Пало, число животных (инд. значения ИФН, титр)
ИФН ? 8	10	7 (32,16,16,8,8,8,8)	3 (32,16,8)
ИФН < 8	3	__	3 (4,4,4)

Полученные и приведенные в таблице 5 данные свидетельствуют о том, что в группе собак с исходно высокими титрами сывороточного ИФН до облучения (ИФН ? 8 ед/мл) выжило 7 из 10 животных. В то же время в группе животных с исходно низкими титрами сывороточного ИФН до облучения (ИФН < 8 ед/мл) пали все 3 собаки.

Влияние исходного уровня ИФН сыворотки крови на смертность облученных в дозе 2,5 Гр собак представлена на рисунке 7.



Рисунок 7. Смертность собак, облученных в дозе 2,5 Гр с высоким и низким исходным (до облучения) содержанием интерферона в сыворотке крови.

Из рисунка 7 следует, что смертность собак с высоким исходным уровнем ИФН в сыворотке была равна 30%, с исходно низким ? 100%. Исходя из малого количества наблюдаемых животных (N=13), оценку статистической значимости проводили с использованием критерия Фишера (при 2-х стороннем распределении P = 0,07).

На основании этих данных можно построить прогноз выживаемости облученных собак в зависимости от исходного содержания сывороточного интерферона в периферической крови.

Расчет точности прогноза исхода ОЛБ по Т-тесту Шеллинга ? Вольфейля (Малета Ю.С., Тарасов В.В., 1982) показал, что с вероятностью 95,9% можно говорить о более высокой возможности выживания облученных собак с высоким исходным уровнем содержания ИФН в сыворотке (титр 1:8 и выше) и гибели животных с низким его содержанием (титр 0-1:4).

Результаты определения содержания лейкоцитов периферической крови облученных собак, разделенных на группы в зависимости от исходного уровня сывороточного ИФН, представлены на рисунке 8.



Рисунок 8. Количество лейкоцитов в периферической крови собак с высоким и низким содержанием ИФН в сыворотке перед облучением (2,5 Гр) в период разгара ОЛБ (7-14 сут).

Из представленных на рисунке данных видно, что темпы падения содержания лейкоцитов периферической крови собак в разгар ОЛБ в группе с высоким исходным до облучения содержанием ИФН в сыворотке ниже, по сравнению с аналогичными показателями в группе собак с исходно низким содержанием ИФН в сыворотке. Полученные данные статистически достоверны на 14 сутки наблюдения (уровень значимость по критерию Стьюдента p=0,028) Приведенные результаты исследования позволяют сделать вывод, что повышенное содержание сывороточного ИФН в сыворотке крови собак перед облучением способствует ослаблению скорости опустошения клеточного состава периферической крови в период разгара ОЛБ.

Основываясь на приведенных выше экспериментальных данных, можно предполагать, что наличие повышенного содержания ИФН в сыворотке крови перед облучением повышает выживаемость облученных собак и отражает состояние, обеспечивающее замедление темпов падения содержания лейкоцитов периферической крови, что, в свою очередь, способствует лучшему перенесению ОЛБ.

Таким образом, используя значения титров сывороточного ИФН в сыворотке крови перед облучением, можно прогнозировать выживаемость животных и человека. Так как ИФН, не зависимо от вида млекопитающих играют в организме животных и человека схожую физиологическую роль, то экстраполяция данных, полученных в экспериментах на животных, принципиально возможна и на человека.

Суммируя все вышеизложенное, следует отметить, что иммунизация вакциной Гриппол повышает радиорезистентность экспериментальных животных. Способность Гриппола активировать процессы интерфероногенеза в периферических клетках крови играет ключевую роль в повышении радиорезистентности организма.

Выводы

1. Вакцины Гриппол активирует процессы интерфероногенеза в организме животных и человека. Титры б - интерферона у мышей достигают максимальных значений на 7 сутки, а у собак - на 14 сутки после введения вакцины. У человека наибольшие титры б - интерферона отмечаются на 7 и 56 сутки после введения Гриппола.

2. Вакцина Гриппол, введенная в дозе 0,2 мл за 7 и 14 суток до облучения (7,5 Гр), статистически достоверно повышает выживаемость иммунизированных мышей по сравнению с неиммунизированными на 25% и 60% соответственно и положительно влияет на динамику массы тела и скорость восстановления показателей периферической крови.

3. Введение Гриппола собакам до облучения в количестве 0,5 мл за 16 суток в дозе 2,5 Гр оказывает положительное влияние на скорость восстановления показателей периферической крови.

4. У животных (собак) с исходно высокими титрами сывороточного ИФН перед облучением отмечено увеличение выживаемости и снижение темпов падения лейкоцитов периферической крови по сравнению с животными с исходно низкими титрами сывороточного ИФН перед облучением.

5. Основываясь на совпадении сроков повышения интерферонсинтезирующей способности лейкоцитов крови у животных (7-21 сутки) с периодами повышения радиорезистентности, можно прогнозировать повышение радиорезистентности у человека на 7-56 сутки, что соответствует периоду повышения б - интерферонсинтезирующей активности клеток периферической крови.

Практические рекомендации

1. Иванов А.А., Уланова А.М., Мальцев В.Н., Ставракова Н.М., Рогожин Д.В. Использованию показателей интерферонового статуса для прогнозирования радиорезистентности // Методические рекомендации ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России, 2008г.

2. Иванов А.А., Уланова А.М., Мальцев В.Н., Ставракова Н.М., Рогожин Д.В. Применение вакцины "Гриппол" для повышения неспецифической противолучевой резистентности //Методические рекомендации ФГУП ГНЦ Институт биофизики ФМБА России, 2008г.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Рогожин Д.В., Бабаянц А.А., Иванов А.А. Влияние вакцины Гриппол на интерфероновый статус организма // Тез.XIV Российского национального конгресса "Человек и лекарство", 16 - 20 апреля, 2007 года, Москва

2. Иванов А.А., Рогожин Д.В., Бабаянц А.А., Уланова А.М. Расширение показаний к применению вакцины "Гриппол" на основании новых данных ответа организма на иммунизацию. Тез. VI Всероссийского конгресса "Профессия и здоровье", 30 октября - 1 ноября 2007 г., Москва.

3. Рогожин Д.В., Бабаянц А.А., Пинегин Б.В., Иванов А.А. Влияние вакцины Гриппол на интерфероновый статус // Тез. Всероссийской научной конференции "Объединенный иммунологический форум", Санкт-Петербург, 30 июня - 5 июля 2008 г.

4. Иванов А.А., Бабаянц А.А., Дешевой Ю.Б., Ильина Н.И., Мальцев В.Н., Пинегин Б.В., Рогожин Д.В., Уланова А.М. Интерфероногенная активность вакцины Гриппол // Иммунология. - 2008. - Т. 29, № 5. - С. 278-280.

5. Иванов А.А., Иванова А.С., Уланова А.М., Ставракова Н.М., Дешевой Ю.Б., Рогожин Д.В., Андрианова И.Е., Мальцев В.Н. Противолучевое действие вакцины "Гриппол" // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2010. - Т. 50, № 1. - С. 52-57.

Размещено на Allbest.ru