Изучение влияния цитокинов на функции эндотелиальных клеток человека перевиваемой линии EA.Hy926

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность проблемы. Ангиогенез представляет собой многоступенчатый процесс, который включает взаимодействие нескольких типов клеток и медиаторов в соответствующем микроокружении, благоприятном для формирования новых сосудов из предсуществующих. Ангиогенез очень редко происходит при физиологических условиях (циклические процессы в репродуктивной системе, ранозаживление, обновление волосяного покрова), но может вносить существенный вклад в патогенез ряда патологических процессов (канцерогенез, гемобластозы, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, неспецифический язвенный колит, диабетическая ретинопатия). Клетки - участники воспалительного процесса (Т-лимфоциты, моноциты/макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы) участвуют в регуляции ангиогенеза за счет продукции про- и противовоспалительных цитокинов, ростовых факторов, которые влияют на функции эндотелиальных клеток (ЭК): их пролиферацию, миграцию и дифференцировку. В связи с тесной сопряженностью процессов воспаления и ангиогенеза весьма актуальным является изучение характера влияния цитокинов на свойства ЭК и на ангиогенез в целом.

В литературе отражены результаты отдельных исследований, свидетельствующие о возможности стимулирующих и ингибирующих эффектов цитокинов в отношении ангиогенеза. Однако результаты этих исследований чрезвычайно вариабельны. Это связано с многообразием используемых экспериментальных систем и с гетерогенностью ЭК. В частности, данные, полученные с использованием микрососудистого эндотелия, отличаются от наблюдений, сделанных на клетках макрососудов. Результаты, полученные на первичных культурах ЭК, отличаются от результатов, полученных на перевиваемых культурах. Эффекты разных цитокинов изучались в разных экспериментальных системах и полученные результаты не сопоставимы.

Цель работы. Провести изучение влияния ростовых факторов и цитокинов на функции ЭК человека с использованием в качестве экспериментальной модели перевиваемой линии клеток EA.Hy926.

Задачи исследования.

1. разработать оптимальные методы оценки пролиферативной, миграционной, адгезионной активности ЭК человека линии EA.Hy926, экспрессии ими интегринового комплекса бнв3 и продукции матриксной металлопротеиназы-9;

2. разработать метод количественной оценки способности ЭК человека линии EA.Hy926 формировать капилляроподобные структуры;

3. изучить влияние ростовых факторов и цитокинов на функции ЭК с использованием разработанной экспериментальной модели.

Научная новизна работы. В ходе работы была разработана новая экспериментальная модель, которая позволяет проводить изучение влияния биологически активных веществ на важнейшие функции ЭК человека линии EA.Hy926. Впервые проведено сопоставление влияния основных ростовых факторов и разных цитокинов на свойства ЭК, причастные к ангиогенезу, в рамках одной экспериментальной модели. С использованием такого подхода впервые было показано, что IL-8 может играть роль более мощного индуктора пролиферативного ответа ЭК, чем ангиогенные ростовые факторы VEGF и bFGF. Результаты работы позволили выявить новое свойства ростовых факторов VEGF и bFGF - усиливать адгезию ЭК. Впервые выявлены противоречивые характеристики IFNг и GM-CSF, которые способны избирательно повышать сродство ЭК к коллагену I типа при отсутствии влияния на другие свойства ЭК. Также впервые была показана экспрессия интегринового комплекса бнв3 на поверхности ЭК человека линии EA.Hy926.

В ходе работы были разработаны новые модификации методов оценки пролиферативной активности ЭК с использованием витального внутриклеточного флуоресцентного красителя белка CFSE и количественной оценки способности ЭК линии EA.Hy926 формировать капилляроподобные структуры на Матригеле.

Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований были получены новые данные о влиянии конкретных цитокинов на функции ЭК, причастные к ангиогенезу. Показано, что провоспалительные цитокины в основном обладают проангиогенной активностью, что вносит дополнительный вклад в понимание их патогенетической роли при патологических состояниях, ассоциированных с усиленным ангиогенезом. IFNб в той же экспериментальной системе проявил ингибирующую активность в отношении пролиферации и миграции ЭК - ключевых событий ангиогенеза, что дополнительно обосновывает его использование в комбинированной противоопухолевой терапии.

Разработанная экспериментальная модель может быть в дальнейшем использована для оценки влияния на свойства ЭК, актуальные для ангиогенеза, различных биологически активных веществ и фармакологических агентов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Разработанная экспериментальная модель позволяет проводить комплексное изучение про- и антиангиогенных эффектов биологически активных веществ;

2. Ростовые факторы VEGF, bFGF и провоспалительные цитокины TNFб, IL-1в, IL-8 оказывают однонаправленное стимулирующее действие на свойства ЭК человека линии EA.Hy926, актуальные для ангиогенеза;

3. IFNб зарекомендовал себя как ингибитор ангиогенного потенциала ЭК человека линии EA.Hy926.

Реализация работы. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них - 3 статьи.

Личный вклад в проведение исследования. Личным вкладом автора в выполненную работу является самостоятельное проведение всех описанных исследований и интерпретация полученных результатов. Вклад соавторов по публикациям ограничивался предоставлением в распоряжение автора ряда биологически активных пептидов, технической помощью в проведении анализа образцов на проточном цитофлуориметре, помощью при получении коллагена I типа.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на научной конференции с международным участием “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге” (Санкт-Петербург, 2002, 2003, 2004, 2005 и 2006 г.г.), на 6ой и 7ой международной школе иммунологов им. Дж. Хамфри (Пущино, 2003 и 2005г.г.), на 12ом международном конгрессе по иммунологии “Clinical and Investigative Medicine” (Канада, 2004), на 18ом Американском симпозиуме по пептидам (США, 2004).

1. Материалы и методы

ангиогенез клетка эндотелиальный

Работа проводилась с использованием ЭК человека линии EA.Hy926, которая была любезно предоставлена Dr. C. J. Edgel (Университет Северной Каролины, США). Культура была получена путем гибридизации первичной линии ЭК HUVEC с линией клеток аденокарциномы легкого A-549. Клетки линии EA.Hy926 воспроизводят основные морфологические, фенотипические и функциональные характеристики, присущие ЭК макрососудов. Использовали следующие условия культивирования: среда DMEM (Sigma, США); 10% от общего объема среды инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (ICN, США), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (АО Самсон, Санкт-Петербург), 2 ммоль L-глютамина (ICN, США) и HAT (ICN, США). Культивировали клетки при 37оС во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2. Пересев осуществляли 1 раз в 3-4 дня по общепринятой методике, вызывая дезинтеграцию монослоя 5-10-минутной экспозицией в растворе Версена (Биолот, Санкт-Петербург). В работе использовали пластиковые флаконы (Costar, США и Sarstedt, Австрия) и плоскодонные планшеты для культивирования клеток (Greiner, Германия; Costar, США и Sarstedt, Австрия). Отсутствие инфицированности (в том числе, микоплазмой) контролировалось.

В работе использовались рекомбинантные препараты человеческих цитокинов и ростовых факторов: bFGF - (Becton Dickinson, США), VEGF - (BioSource, США), GM-CSF - “Leucomax” (Schering-Plough) (специфическая активность препарата 1ЕД = 1 нг), TNFб - “Рефнолин” (специфическая активность препарата 1ЕД = 0,06 нг), IL-1в “Беталейкин” (специфическая активность препарата 1ЕД = 0,01 нг) (НИИ Особочистых биопрепаратов, Санкт-Петербург), IL-8 - (CytoLab/PeproTech, Израиль), IFNб - “Реаферон”, IFNг - “Гаммаферон” (НПО “Фермент”, “Sanitas”, Литва), IL-4 - (Becton Dickinson, США) (специфическая активность препарата 1ЕД = 0,2 нг). Синтетические тканеспецифические пептиды из группы геморфинов были любезно предоставлены с.н.с. Е.Ю.Блищенко и проф. А.А.Михайловой (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва).

Чувствительность ЭК человека линии EA.Hy926 к цитотоксическому действию различных биологически активных факторов оценивали в стандартном МТТ-тесте, определяя оптическую плотность (ОП) с помощью автоматического спектрофотометра (SLT-Spectra, Австрия) при длине волны 540 нм. Интенсивность цитотоксического действия выражали в единицах ОП. По степени снижения ОП в лунках с препаратом по сравнению с контрольными лунками судили о цитотоксическом действии препаратов.

Оценка пролиферативной активности ЭК человека линии EA.Hy926 с помощью окраски кристалл-виолетом проводили по общепринятой методике. Результаты оценивали, определяя ОП с помощью автоматического спектрофотометра (SLT-Spectra, Австрия) при длине волны 540 нм. Интенсивность пролиферации клеток выражали в единицах ОП. По степени изменения ОП в лунках с препаратом по сравнению с контрольными лунками судили о влиянии препаратов на интенсивность пролиферации.

Дополнительно для оценки пролиферативной активности ЭК человека линии EA.Hy926 был разработан метод с использованием витального внутриклеточного флуоресцентного красителя белка - CFSE. Клетки отмывали средой DMEM и окрашивали CFSE (Sigma, США) в концентрации 5 мкмоль в среде DMEM. Окрашенные красителем клетки культивировали в 48 луночных планшетах (15000 клеток в мл) 72 ч в среде без добавления ЭТС. По окончании инкубации дезинтеграцию монослоя вызывали 10-минутной экспозицией в растворе Версена, после чего проводили учет интенсивности флуоресценции с использованием проточной цитофлюориметрии (FACStrack, Becton Dickinson). Цитометрический анализ проводили на основе определения трех параметров: малого углового светорассеяния (FSC), бокового светорассеяния (SSC) и показателя зеленой флюоресценции CFSE (FL-1). Для обработки данных проводили гейтинг исследуемых клеток в координатах FSC (ось абсцисс) и SSC (ось ординат). Затем данную группу анализировали на наличие флюоресценции в координатах FL1 зеленое свечение (CFSE). Для оценки активности пролиферации клеток, необходимо было выделить пики (маркеры) интенсивности свечения, соответствующие распределению красителя в делящихся клетках. По степени изменения интенсивности флуоресценции клеток, культивировавшихся в присутствие исследуемых препаратов, по сравнению с контрольными, судили о влиянии препаратов на интенсивность пролиферации.

Кроме того, пролиферативную активность ЭК линии EA.Hy926 оценивали по интенсивности включения бромдезоксиуридина в ДНК делящихся клеток. Эксперименты проводили в соответствие с протоколом фирмы-производителя (Amersham Biosciences, Великобритания). Результаты оценивали, определяя ОП с помощью автоматического спектрофотометра (SLT-Spectra, Австрия) при длине волны 490 нм. Интенсивность пролиферации клеток выражали в единицах ОП. По степени изменения ОП в лунках с препаратом по сравнению с контрольными лунками судили о влиянии препаратов на интенсивность пролиферации.

Для получения коллагена I типа использовали вариант общепринятого метода, разработанный в лаборатории проф. И.Г. Козлова (ММА им. И.М. Сеченова). Стерилизацию полученного раствора коллагена с соблюдением всех правил стерильности проводили при помощи центрифугирования (40000 об/мин и 4оС 1 час). Полученный стерильный надосадок хранили при -20оС. Концентрацию полученного раствора коллагена оценивали на основании определения концентрации оксипролина, составляющего до 80% коллагена I типа.

Оценку миграции ЭК линии EA.Hy926 проводили с помощью модифицированного метода компании Becton Dickinson “BD BioCoat™ Angiogenesis System - Endothelial Cell Migration”. Использовали поликарбонатные трансвеллы (фильтры) 24-х луночного формата (Becton Dickinson) с диаметром пор 3 мкм, предварительно обработанные раствором коллагена I типа (100 мкг/мл). Клетки помещали в верхние камеры (250 мкл клеточной суспензии с концентрацией 200000 клеток/мл), а исследуемые и контрольные растворы - в нижние, в 750 мкл среды, содержащей 0,5% ЭТС. При этом обе камеры оказываются разделенными полупроницаемым фильтром, обработанным раствором коллагена I типа. После этого клетки инкубировали 20 ч при 37оС и 5% СО2. По окончанию срока инкубации извлекали фильтры, остатки среды отбирали дозатором и аккуратно удаляли ватным тампоном клетки с поверхности фильтра, обращенной в верхнюю камеру, чтобы избежать окраски немигрировавших клеток. После этого фильтры с клетками на нижней стороне фиксировали 30 минут в метаноле при 4оС, далее высушивали, и клетки окрашивали по Романовскому-Гимзе. Результаты оценивали по среднему значению количества мигрировавших клеток, которое подсчитывали при микроскопии по результатам 5 рандомизированных полей зрения в трех независимых экспериментах, при увеличении микроскопа Ч120. Активность миграции выражали средним количеством мигрировавших клеток. О влиянии препаратов судили по изменению среднего количества мигрировавших клеток в лунках с препаратами по сравнению с количеством клеток при спонтанной миграции.

Оценку образования ЭК линии EA.Hy926 капилляроподобных структур проводили с использованием Матригеля (продукт опухолевой линии клеток Engelberth-Holm-Swarm, представляющий собой композит из различных видов белков внеклеточного матрикса: ламинина, коллагена IV типа, энтактина и гепарансульфат протеогликанов) (Becton Dickinson, Великобритания). Нами разработана модификация данного метода, которая позволяет снизить расход Матригеля в 4 раза, сохраняя возможность количественного учета результатов. Сущность модификации заключается в использовании коллагеновой подложки. Для этого 400 мкл раствора коллагена I типа в концентрации 1 мг/мл, полученного из сухожильных тяжей хвостов лабораторных крыс, вносили в лунки 24-луночного планшета и 1-2 ч инкубировали при 37°С и 5% СО2 до полной полимеризации. Затем во все лунки планшета, содержащего коллаген, вносили неразведенный Матригель. Для этого весь расходный материал (наконечники для дозаторов, планшеты и пробирки для разведения Матригеля) предварительно охлаждали, для предотвращения преждевременной полимеризации матрикса. Матригель размораживали на льду, ресуспендировали, избегая образования пузырей, и вносили в объеме 100 мкл поверх коллагена. Далее планшет инкубировали в течение 30-60 мин при 37°С и 5% СО2 до образования геля. После полимеризации матрикса аккуратно вносили клетки (200000 кл.) в 500 мкл среды и исследуемые препараты в 10 мкл среды, содержащей 2% ЭТС. Через 24 часа проводили количественный учет результатов. За вышеуказанное время клетки на границе раздела двух видов матрикса формировали сеть из капилляроподобных структур. Документацию результатов проводили с помощью фотографирования цифровым фотоаппаратом Nikon Coolpix 4500 (Nikon, Япония) с окулярным адаптером к инвертированному микроскопу Биолам-П1 (ЛОМО, Санкт-Петербург). При этом суммарное увеличение составляло Ч120. Последующий анализ полученных фотографий проводили с использованием программы “ImagJ” (данная программа в свободном доступе размещена на веб-сайте National Institute of Health http://rsb.info.nih.gov/nih-image/download.html). При анализе полученных изображений мы расценивали клеточный тяж между двумя клеточными агрегатами как капилляроподобную структуру и учитывали среднюю длину этих капилляроподобных структур, которую выражали в пикселях, (Рис. 1). Результаты оценивали по средним значениям вышеназванных показателей, которые подсчитывали по результатам 5 рандомизированных полей зрения в трех независимых экспериментах (Рис. 1). О влиянии препаратов на способность ЭК человека линии EA.Hy926 к образованию капилляроподобных структур судили по изменению средней длины одной капилляроподобной структуры в лунках с препаратом по сравнению с контрольными.

Рисунок 1. Капилляроподобные структуры, образуемые ЭК человека линии EA.Hy926, на Матригеле. А - клеточные агрегаты; линия - клеточный тяж между двумя клеточными агрегатами (капилляроподобная структура)

Для оценки адгезии ЭК человека линии EA.Hy926 к коллагену I типа была разработана собственная модификация метода. Для этого, в лунки 96-луночного планшета вносили 100 мкл раствора коллагена в концентрации 100 мкг/мл, инкубировали сутки при 4оС, излишки раствора коллагена удаляли, планшет трижды отмывали раствором Хэнкса и просушивали 1 час при 37оС. В лунки вносили исследуемы и контрольные препараты в 50 мкл бессывороточной среды. Снятые раствором Версена клетки однократно отмывали бессывороточной культуральной средой и 50 мкл клеточной суспензии, содержащей 4-5Ч104 клеток, вносили в лунки и инкубировали в течении 105 мин при 37°С и 5% СО2. По истечении срока инкубации, супернатант аккуратно удаляли и клетки два раза отмывались фосфатно-солевым раствором, предварительно подогретым до 37°С. Отмытые клетки, фиксировали, окрашивали 0,2% раствором кристалл-виолета (60 мкл красителя, содержащего 2 % этанола, вносили в лунку на 15 мин и инкубировали при комнатной температуре). Несвязавшийся раствор кристалл-виолета трижды отмывали дистиллированной водой, планшет высушивали 24 ч, окрашенные клетки лизировали 1% раствором уксусной кислоты (100 мкл/лунку) и после 15-минутной инкубации при комнатной температуре (для полного растворения красителя), оценивали ОП с помощью многоканального спектрофотометра (Spectra SLT, Австрия) при длине волны 540 нм. Активность адгезии клеток к коллагену I типа выражали в единицах ОП. По степени изменения ОП в лунках с препаратом по сравнению с контрольными лунками судили о влиянии препаратов на уровень адгезии ЭК человека линии EA.Hy926.

Оценку продукции MMP-9 ЭК человека линии EA.Hy926 проводили в соответствие с протоколом фирмы-производителя (Amersham Biosciences, Великобритания). Уровень продукции MMP-9 выражали в нг/мл. По степени изменения среднего количества MMP-9 в лунках с препаратом по сравнению с контрольными лунками судили о влиянии препаратов на уровень продукции MMP-9 ЭК человека линии EA.Hy926.

Определение уровня экспрессии интегринового комплекса бvв3 на поверхности ЭК линии EA.Hy926 проводили в соответствии с протоколом фирмы-производителя (PharMingem, Великобритания). Учет интенсивности флуоресценции проводили с использованием проточного цитофлюориметра FACsCalibur (Becton Dickinson, Великобритания). Экспрессию интегринового комплекса бvв3 выражали средними значениями интенсивности флуоресценции (mean fluorescence intensity - MIF). О влиянии препаратов на экспрессию молекулы бvв3 судили по изменению MIF в опыте по сравнению со спонтанным уровнем MIF.

Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи методов параметрической статистики. При этом проводили вычисление средней, ошибки средней, критерия Стьюдента, используя компьютерную программу STATISTICA 5.0.

2. Результаты и их обсуждение

Для целей нашего исследования была выбрана перевиваемая линия ЭК человека EA.Hy926, которая всесторонне охарактеризована, широко используется для исследования свойств ЭК, а нами использована для оценки влияния ростовых факторов и цитокинов на функции ЭК, причастные к ангиогенезу. С использованием этой перевиваемой линии нами разработана экспериментальная модель, позволяющая изучать влияние биологически активных веществ на различные свойства ЭК, актуальные для ангиогенеза, и на ангиогенез в целом, судя по способности к формированию капилляроподобных структур. При разработке экспериментальной модели, мы исходили из того, что она должна воспроизводить ключевые этапы ангиогенеза: пролиферацию, миграцию и дифференцировку ЭК на внеклеточном матриксе Матригеле. Как показали наши исследования, клетки линии EA.Hy926 оказались чувствительны как к стимулирующим, так и к ингибирующим влияниям. В рамках данной модели мы оценивали адгезию ЭК к коллагену I типа, а для уточнения механизма адгезии - экспрессию интегринового комплекса aнb3. Впервые было установлено, что данный интегрин спонтанно экспрессируется на поверхности клеток линии EA.Hy926, чему соответствует среднее значение интенсивности флуоресценции 41,28 ± 4,6 (n=3). Кроме того, была изучена продукция клетками MMP-9. Клетки линии EA.Hy926 характеризовались постоянным уровнем спонтанной продукции ММP-9, который в среднем составлял 4,18 ± 0,14 нг/мл (n=15). Большинство экспериментов проводили в условиях низкого содержания ЭТС в культуральной среде, так как стимулирующее действие высоких концентраций ЭТС, содержащей ростовые факторы, могло экранировать действие исследуемых цитокинов и ростовых факторов. Вместе с тем, показана возможность использования более высоких концентраций ЭТС, оказывающих активирующее действие на ЭК, в качестве положительного контроля. Разработанная экспериментальная модель может быть использована для комплексного изучения влияния биологически активных веществ на свойства ЭК и ангиогенез. К достоинствам модели можно отнести достаточно высокую воспроизводимость результатов.

В задачи исследования входила проверка чувствительности ЭК человека линии EA.Hy926 к действию ростовых факторов VEGF и bFGF, заведомо проангиогенных агентов. VEGF считается специфическим митогеном для ЭК, так как избирательно стимулирует пролиферацию эндотелия при отсутствии влияния на пролиферацию других типов клеток, в то время как стимулирующее действие bFGF не ограничивается только ЭК. При этом bFGF может проявлять более выраженное митогенное действие, чем VEGF. Кроме того, bFGF может стимулировать аутокринную продукцию VEGF ЭК, и это вносит дополнительный вклад в стимуляцию пролиферации ЭК. В наших исследованиях оба ростовых фактора стимулировали пролиферацию ЭК линии EA.Hy926 в широком диапазоне концентраций, причем максимальную активность VEGF и bFGF, оказывали в концентрации 20 и 10 нг/мл соответственно (Рис. 2).

Рисунок 2. Влияние ростовых факторов VEGF и bFGF на пролиферацию ЭК человека линии EA.Hy926 (метод с включением бромдезоксиуридина)

По оси абсцисс - ростовые факторы и контроли; по оси ординат - значение ОП. Вертикальные отрезки - 95%-ные доверительные интервалы средних величин. Достоверность отличия от уровня контроля *(p<0,05), **(p<0,01), ***(p<0,001).

Литературные данные свидетельствуют о том, что оба ростовых фактора стимулируют миграцию ЭК in vitro. В нашем исследовании, VEGF проявлял слабую стимулирующую активность, а bFGF никак не влиял на миграцию ЭК линии EA.Hy926. Вероятно, клетки данной линии в бессывороточных условиях нуждаются в дополнительной стимуляции, например, фибронектином, который является мощным хемоаттрактантом для ЭК, вызывая реорганизацию цитоскелета и экспрессию интегриновых молекул.

Ранее было показано, что VEGF и bFGF индуцируют образование капилляроподобных структур ЭК на различных видах матрикса, в том числе на Матригеле. Нам удалось получить аналогичные результаты при изучении влияния данных ростовых факторов на ЭК линии EA.Hy926. Действие VEGF при этом было несколько более выраженным, чем у bFGF (Табл. 1).

Таблица 1.Влияние ростовых факторов VEGF, bFGF на формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками человека линии EA.Hy926

а Клетки, культивировавшиеся в среде без добавления ростовых факторов. Достоверность отличия от уровня контроля *(p<0,05), **(p<0,01), ***(p<0,001).

Наши данные говорят о том, что оба ростовых фактора VEGF и bFGF усиливают адгезию ЭК линии EA.Hy926 к коллагену I типа, причем VEGF несколько более эффективен, чем bFGF (Табл. 2).

Таблица 2. Влияние ростовых факторов VEGF и bFGF на адгезию ЭК EA.Hy926 к коллагену I типа

а Оптическая плотность, выраженная в усл. ед., за вычетом фона 0,064 усл. ед. Достоверность отличия от уровня контроля *(p<0,05), **(p<0,01), ***(p<0,001).

Нам не удалось найти в литературе аналогичных работ. Ранее было показано, что ростовые факторы VEGF и bFGF модулируют экспрессию целого ряда интегриновых молекул на поверхности ЭК, которые обеспечивают взаимодействие эндотелиальных клеток с белками внеклеточного матрикса, в том числе с коллагеном (б1, б2, б3, б4, б5, бн, в1, в3). Эти данные в известной степени перекликаются с нашими результатами. Нами была предпринята попытка выяснить, связано ли такое действие ростовых факторов на адгезию ЭК с влиянием на экспрессию интегринового комплекса v3. Однако ни один из ростовых факторов не влиял на уровень экспрессии данной молекулы.

В нашей модельной системе VEGF и bFGF не влияли на продукцию MMP-9 ЭК линии EA.Hy926, хотя некоторые авторы указывают на способность этих ростовых факторов контролировать систему протеолиза, в том числе благодаря стимуляции продукции MMP-2, -9.

Таким образом, несмотря на некоторые расхождения с литературными данными, результаты, полученные на данной экспериментальной модели, свидетельствуют о проангиогенном действии VEGF и bFGF. Выявленное нами стимулирующее действие обоих ростовых факторов на пролиферативную активность и образование капилляроподобных структур ЭК линии EA.Hy926 позволяет рассматривать эти ростовые факторы в качестве проангиогенных препаратов.

TNFб, IL-1в, IL-8, GM-CSF - относятся к группе цитокинов раннего воспалительного ответа. Из литературы известно, что эти цитокины способны стимулировать ангиогенез in vivo. Причем, эти цитокины играют в основном опосредованную роль в ангиогензе, индуцируя продукцию основного медиатора ангиогенеза - VEGF макрофагами, гладкомышечными клетками, самими ЭК. В группу провоспалительных цитокинов, как правило, включается и IFNб. Спектр действия IFNб не ограничивается противовирусной активностью. Этот цитокин обладает противоопухолевым действием и в последнее время широко используется при проведении комбинированной противоопухолевой терапии. В качестве одного из возможных механизмов противоопухолевого действия IFNб рассматривается угнетение формирования сосудистой сети опухоли.

По литературным данным, TNFб оказывает двойственное влияние на пролиферацию, что может быть связано с дозо- и времязависимым эффектом данного цитокина. Так, кратковременная инкубация при низкой концентрации оказывала проангиогенное действие, в то время как, длительная экспозиция при высоких концентрациях приводила к утрате проангиогенных эффектов TNFб. В нашей модели TNFб в высоких дозах 500 и 100 ЕД/мл TNFб ингибировал пролиферацию ЭК линии EA.Hy926 (Рис. 3). Отдельные литературные данные свидетельствуют о том, что IL-1в, может стимулировать пролиферацию ЭК, причем данный эффект, вероятнее всего, связан с его влиянием на синтез и секрецию ростовых факторов (PDGF, VEGF, TGFв, FGF, CSF). Кроме того, IL-1в может повышать экспрессию рецепторов к bFGF на эндотелии, что увеличивает чувствительность последнего к стимулирующему влиянию данного ростового фактора. Наши данные также свидетельствуют о стимулирующем действии IL-1в на пролиферацию клеток линии EA.Hy926 (Рис. 3). IFNб, в нашей экспериментальной системе, в концентрациях 10000 и 1000 ЕД/мл ингибировал пролиферацию клеток линии EA.Hy926 (Рис. 3).

Рисунок 3. Влияние TNFб, IL-1в и IFNб на пролиферацию ЭК человека линии EA.Hy926 (метод с включением бромдезоксиуридина)

По оси абсцисс - ростовые факторы и контроли; по оси ординат - значение ОП. Вертикальные отрезки - 95%-ные доверительные интервалы средних величин. Достоверность отличия от уровня контроля *(p<0,05), **(p<0,01), ***(p<0,001).

IL-8 и другие CXC-хемокины рассматриваются в литературе как потенциальные стимуляторы ангиогенеза. IL-8 может стимулировать пролиферацию ЭК, причем этот эффект носит не только опосредованный характер, через усиление продукции VEGF и bFGF, но может быть и прямым. В нашем исследовании IL-8 дозазависимо стимулировал пролиферацию ЭК линии EA.Hy926 (Рис. 4). Стимулирующий эффект IL-8 был самым выраженным из всех изученных цитокинов и ростовых факторов и превосходил результаты позитивного контроля (10% ЭТС). По литературным данным, GM-CSF может стимулировать пролиферацию эндотелия. Клетки линии EA.Hy926 оказались не чувствительны к действию GM-CSF в опыте по исследованию пролиферации (Рис. 4).

Рисунок 4. Влияние GM-CSF и IL-8 на пролиферацию ЭК человека линии EA.Hy926 (метод с включением бромдезоксиуридина). По оси абсцисс - ростовые факторы и контроли; по оси ординат - значение ОП. Вертикальные отрезки - 95%-ные доверительные интервалы средних величин. Достоверность отличия от уровня контроля *(p<0,05), **(p<0,01), ***(p<0,001)

Ранее было показано, что TNFб, наряду с IL-1в и IFNг, может ингибировать фибронектин-индуцированную миграцию микрососудистого эндотелия, никак не влияя на миграцию клеток крупных сосудов, например HUVEC. При исследовании влияния цитокинов на миграцию ЭК линии EA.Hy926, TNFб оказывал стимулирующее действие, даже в отсутствие дополнительной стимуляции фибронектином. IL-1в стимулировал миграцию ЭК линии EA.Hy926 в наибольшей из использованных концентраций и его эффект был сопоставим с действием TNFб. Характерным для IL-8 считается его стимулирующее влияние на миграцию ЭК, для которых он является хемотактическим фактором. В наших исследованиях стимулирующее действие IL-8 на миграцию ЭК линии EA.Hy926 проявилось при наибольшей из использованных концентраций 500 нг/мл. GM-CSF никак не влиял на миграцию клеток линии EA.Hy926. В отношении миграции ЭК INFб, также как и в отношении пролиферации эндотелия, проявлял ингибирующее действие в максимальной из использованных концентраций (Табл. 3).

Таблица 3. Влияние провоспалительных цитокинов на миграцию ЭК человека линии EA.Hy926

а Среднее значение количества мигрировавших клеток по результатам 5 рандомизированных полей зрения в трех независимых экспериментах. Достоверность отличия от уровня контроля *(p<0,05), **(p<0,01), ***(p<0,001).

Ранее была изучена способность TNFб индуцировать образование капилляроподобных структур ЭК различного происхождения на разных видах матрикса. В нашем исследовании TNFб также стимулировал образование капилляроподобных структур, что является дополнительным доказательством его проангиогенного действия. Описана способность IL-1в стимулировать формирование новых капилляров in vivo, причем использование рецепторного антагониста IL-1в позволяет ингибировать васкуляризацию опухоли. В опытах in vitro IL-1в как и TNFб потенцировал образование капилляроподобных структур на фибрине и Матригеле. В наших исследованиях IL-1в достоверно по сравнению со спонтанным уровнем, но слабее чем TNFб стимулировал образование капилляроподобных структур ЭК линии EA.Hy926. Хотя по литературным данным IL-8 является достаточно мощным индуктором ангиогенного ответа in vivo и in vitro, в нашей модели этот цитокин проявлял слабое стимулирующее действие в отношении образования капилляроподобных структур ЭК линии EA.Hy926. IFNб не стимулировал, но и не ингибировал образования капилляроподобных структур, в отличие от ингибирующих эффектов этого цитокина в отношении пролиферации и миграции ЭК человека линии EA.Hy926.

Рисунок 5. Влияние провоспалительных цитокинов на формирование капилляроподобных структур ЭК человека линии EA.Hy926

По оси абсцисс - цитокины и контроль; по оси ординат - длина капилляроподобных структур, выраженная в пикселях. Вертикальные отрезки - 95%-ные доверительные интервалы средних величин. Достоверность отличия от уровня контроля *(p<0,05), **(p<0,01), ***(p<0,001).

Будучи универсальным активатором функций ЭК, TNFб может индуцировать экспрессию ряда адгезионным молекул на поверхности эндотелия, в том числе, VCAM-1 и E-селектина, которые способствуют ангиогенезу. Наши данные также говорят об усилении адгезионного потенциала ЭК под действием TNFб, который повышал адгезию ЭК линии EA.Hy926 к коллагену I типа и экспрессию интегринового комплекса бvв3 (Табл. 4, Рис. 6). Как известно, с экспрессией данного комплекса связано повышение жизнеспособности эндотелия, обеспечивается адгезия к белкам внеклеточного матрикса, как следствие, усиливается чувствительность к митогенным и хемотактическим стимулам. Наряду, с другими провоспалительными цитокинами IL-1в закономерно стимулировал адгезию ЭК линии EA.Hy926 к коллагену I типа, но не влиял при этом на экспрессию интегринового комплекса бнв3. IL-8 в наших экспериментах слабо стимулировал адгезионную активность ЭК линии EA.Hy926. Стимулирующее действие GM-CSF на адгезию клеток линии EA.Hy926 к коллагену I типа носило выраженный характер и было сопоставимо с эффектами TNFб и ЭТС. IFNб, единственный из провоспалительных цитокинов, не оказывал влияния на адгезию ЭК линии EA.Hy926 к коллагену I типа (Табл. 4).

Таблица 4. Влияние провоспалительных цитокинов на адгезию ЭК человека линии EA.Hy926 к коллагену I типа

а Значения ОП за вычетом фона 0,064 усл. ед. Достоверность отличия от уровня контроля *(p<0,05), **(p<0,01), ***(p<0,001).

Рисунок 6. Оценка экспрессии интегринового комплекса бvв3 под влиянием TNFб в концентрации 100 ЕД/мл на поверхности ЭК человека линии EA.Hy926

По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции клеток; по оси ординат - количество, проанализированных клеток.

Ранее было показано, что TNFб стимулирует синтез и секрецию u-PA ЭК, повышает экспрессию рецепторов для u-PA на эндотелии, стимулирует продукцию и повышает активность MMP-2, -9. Это вносит существенный вклад в деградацию базальной мембраны и внеклеточного матрикса, необходимую для последующей миграции ЭК на начальных этапах ангиогенеза. Наши исследования показали, что TNFб существенно усиливал продукцию MMP-9 клетками линии EA.Hy926. IL-1в также вносит вклад в ремоделирование ВКМ: IL-1в непосредственно индуцирует синтез u-PA ЭК и его ингибитора, коллагеназы и эластазы. Кроме того, данный цитокин может стимулировать продукцию MMP-1,-2,-3,-9, как самими ЭК, так и клетками микроокружения. В нашей экспериментальной модели мы выявили способность IL-1в усиливать продукцию MMP-9 ЭК линии EA.Hy926. Мы также выявили стимулирующий эффект IL-8 на продукцию MMP-9, ранее описанный в литературе в отношении других ЭК. Отдельными исследователями было ранее показано, что IFNб может угнетать синтез матриксных металлопротеиназ (MMP-2, -9), необходимых на первых этапах ангиогенеза. В наших исследованиях IFNб также проявлял ингибиторную активность, снижая продукцию MMP-9 в 1,3 раза по сравнению со спонтанным уровнем продукции.

Таблица 5. Влияние провоспалительных цитокинов на продукцию MMP-9 ЭК человека линии EA.Hy926

а Клетки, культивировавшиеся 24 часа в среде без цитокинов. Достоверность отличия от уровня контроля *(p<0,05), **(p<0,01), ***(p<0,001).

Таким образом, TNFб в нашем исследовании зарекомендовал себя, как прооангиогенный агент, который существенно усиливал продукцию MMP-9, матриксной металлопротеиназы, необходимой для деградации внеклеточного матрикса и последующей миграции ЭК, стимулировал миграцию ЭК, повышал адгезию эндотелия к коллагену I типа, что необходимо, как для миграции и пролиферации, так и для повышения жизнеспособности клеток, усиливает экспрессию интегринового комплекса бнв3, что также увеличивает устойчивость ЭК к апоптозу, повышает их сродство к белкам внеклеточного матрикса, способствует миграции. Вместе с тем, TNFб, будучи мощным апоптогеном, в высокой концентрации подавлял пролиферацию клеток линии EA.Hy926, что подтверждает существующее представление о нем, как о полифункциональном цитокине. Провоспалительные цитокины IL-1в и IL-8 оказывали однонаправленное стимулирующее действий в отношении ангиогенных свойств клеток линии EA.Hy926. При этом IL-8 показал себя самым сильным индуктором пролиферативного ответа ЭК по сравнению со всеми провоспалительными цитокинами и ростовыми факторами. GM-CSF в данной модели, в отличие от литературных данных, не проявив никакого действия в отношении пролиферации и миграции клеток линии EA.Hy926, оказался достаточно сильным стимулятором адгезии клеток к коллагену I типа. В отличие от других провоспалительных цитокинов у IFNб явно преобладали антиангиогенные эффекты, хотя отсутствие влияния на конечный этап ангиогенеза (судя по формированию капилляроподобных структур клетками линии EA.Hy926) не позволяет рассматривать IFNб в качестве чисто антиангиогенного фактора.

Ангиогенез регулируется деликатным балансом различных негативных и позитивных эффекторных молекул. При этом в физиологических условиях преобладают сигналы, сдерживающие данный процесс, а при патологии (канцерогенез, хроническое воспаление, раневой процесс) значительно преобладают активирующие стимулы. Балансом различных цитокинов регулируется и иммунный ответ, протекающий с преобладанием либо Th1, либо Th2 субпопуляций Т-лимфоцитов. Th1 продуцируют преимущественно IFNг, IL-2 и TNFб/в, в то время как Th2 секретируют IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 и IL-13. Можно предположить, что дихотомия Т-хелперов играет роль и в контроле ангиогенеза. Цитокины, секретируемые Th1 и Th2, могут влиять на ангиогенез как напрямую, контролируя рост и дифференцировку ЭК, так и опосредованно, через продукцию других цитокинов и ростовых факторов. Мы остановили свой выбор на изучении с помощью разработанной нами экспериментальной модели эффектов двух альтернативных цитокинов: IFNг и IL-4.

Отдельные литературные данные свидетельствуют о том, что IFNг оказывает скорее ангиостатическое действие. В отношении пролиферации ЭК данный цитокин оказывает как прямое антимитогенное действие, так и опосредованное через угнетение bFGF- и PDGF-стимулированной пролиферации ЭК. Однако в нашем исследовании IFNг ни в одной из изученных концентраций не оказывал влияния на пролиферацию клеток линии EA.Hy926. В литературе описана способность IFNг ингибировать экспрессию MMP-2 и MMP-9, вмешиваясь в процесс ремоделирования внеклеточного матрикса и, как следствие, снижая возможности миграции ЭК и метастазирования опухолевых клеток. Было показано, что IFNг может ингибировать фибронектин-индуцированный хемотаксис клеток микрососудистого эндотелия, не влияя при этом на хемотаксис клеток крупных сосудов. В нашей модели IFNг не оказывал влияния на миграцию клеток линии EA.Hy926, которые относятся к клеткам макрососудов. В литературе высказывалось предположение о том, что IFNг снижает жизнеспособность ЭК через угнетение бvв3 пути трансдукции сигнала и ингибирует синтез коллагена вспомогательными клетками внеклеточного матрикса. Наши результаты показали, что IFNг усиливал адгезию ЭК линии EA.Hy926 к коллагену I типа, причем этот эффект имел прямой дозазависимый характер и был максимальным среди всех исследованных провоспалительных цитокинов. Эти данные противоречат литературным данным о том, что IFNг является более слабым индуктором экспрессии адгезионных молекул, чем, TNFб. Нам не удалось найти в литературе данных в отношении способности IFNг модулировать образование капилляроподобных структур ЭК. Однако, известно, что IFNг может потенцировать продукцию CXCL-хемокина IP-10, вызывающего ингибицию дифференцировки ЭК на стадии морфогенеза. Наши собственные эксперименты показали, что IFNг не влиял на образование капилляроподобных структур клетками линии EA.Hy926 на Матригеле. Суммируя полученные нами данные, можно говорить о том, что в отличие от существующего в литературе представления об INFг, как о ангиостатическом цитокине, нам не удалось получить подтверждающих данных. В нашей модели, IFNг не проявлял антиангиогенных свойств в отношении ЭК линии EA.Hy926. Более того, способность усиливать адгезию к коллагену I типа, можно расценивать как проангиогенное действие этого цитокина (Табл. 6).

По литературным данным, IL-4 является потенциальным митогеном для микрососудистого эндотелия. Наши собственные данные, полученные на линии клеток EA.Hy926, также говорят о митогенном эффекте IL-4. Причем, максимальный эффект был получен в концентрации - 1 нг/мл. В экспериментах in vivo IL-4 подавлял bFGF - индуцированный ангиогенез, ингибируя миграцию ЭК. В отличие от этого, в низкой концентрации (0,01 нг/мл) IL-4 стимулировал миграцию ЭК. Есть литературные данные о том, что IL-4 индуцирует экспрессию адгезионной молекулы VCAM-1 ЭК, растворимая форма которой является потенциальным хемоаттрактантом для ЭК. В нашей модели IL-4 не влиял на миграционную активность клеток линии EA.Hy926. В экспериментах in vito IL-4 рекомбинантный белок заметно стимулировал образование капилляроподобных структур, как микрососудистым, так и макрососудистым эндотелием. Однако на клетках линии EA.Hy926 не удалось воспроизвести этого эффекта IL-4. В наших исследованиях IL-4, в отличие от INFг, не влиял и на адгезионные свойства ЭК. В нашем исследовании IL-4 никак не влиял и на продукцию MMP-9 клетками линии EA.Hy926. В литературе имеются сообщения о том, что IL-4 может ингибировать продукцию MMP-9 активированными моноцитами/макрофагами, однако в отношении ЭК нам не удалось найти аналогичных работ.

Таким образом, результаты нашей работы выявили некоторые различия характера действия IFNг и IL-4 на ЭК линии EA.Hy926. IL-4 стимулировал пролиферацию этих клеток, не влияя при этом на основные характеристики ЭК, в то время как IFNг проявил наиболее выраженное из всех изученных факторов стимулирующее действие в отношении адгезии клеток линии EA.Hy926 к коллагену I типа, не влияя на их пролиферативную активность.

Таблица 6. Влияние ростовых факторов и цитокинов на свойства ЭК человека EA.Hy926, причастные к ангиогенезу

Обозначения: “^” - стимулирующий эффект, “v” - ингибирующий эффект, количество стрелок указывает на выраженность эффекта, “0” - отсутствие эффекта, “-“ - отсутствие данных.

Обобщая результаты работы, необходимо отметить, что наша работа выявила некоторые противоречия с существующими в литературе данными. VEGF и bFGF считаются наиболее эффективными проангиогенными молекулами in vitro и in vivo. В нашей системе эти факторы проявляли относительно слабую активность в отношении пролиферации и миграции ЭК линии EA.Hy926 и никак не влияли на продукцию MMP-9. Можно предположить, что сниженная чувствительность ЭК линии EA.Hy926 связана с постоянным стимулирующим действием ЭТС на клетки долгоживущих культур, к которым принадлежит и линия клеток EA.Hy926. Любая ЭТС содержит остатки ростовых факторов, которые поддерживают пролиферацию клеток в культуре. Следствием, по всей вероятности, является снижение чувствительности к стимулирующему действию ростовых факторов, возможно, за счет снижения уровня экспрессии рецепторов ростовых факторов. В литературе описано стимулирующее действие GM-CSF на ангиогенез и, в частности, на пролиферацию ЭК. Другие исследователи утверждают, что на клетках HUVEC отсутствуют рецепторы для GM-CSF и в отношении этих клеток GM-CSF не обладает митогенным действием. Наши данные также свидетельствуют об отсутствии эффекта GM-CSF на пролиферацию ЭК. Нам не удалось найти данных об экспрессии рецепторов к GM-CSF ЭК линии EA.Hy926. Однако среди изученных ростовых факторов и цитокинов GM-CSF показал себя, как один из наиболее эффективных стимуляторов адгезии клеток линии EA.Hy926 к коллагену I типа. Данному феномену пока не удалось найти объяснение. Интегриновый комплекс бнв3, по литературным данным, относительно слабо экспрессируется покоящимися ЭК, чему соответствует низкий уровень экспрессии, который мы выявили на клетках линии EA.Hy926. Только активированные, пролиферирующие ЭК обильно экспрессируют интегриновый комплекс бнв3. Из всех изученных факторов только TNFб повышал уровень экспрессии этого интегрина. Следует отметить, что все изученные цитокины и ростовые факторы, за исключением IL-4, усиливали адгезию клеток линии EA.Hy926 к коллагену I типа. По видимому это связано с тем, что адгезия к белкам внеклеточного матрикса, в том числе к коллагену, обеспечивается целым спектром адгезионным молекул из семейства интегринов. Для каждого вида субстрата (коллаген, фибрин, ламинин, витронектин и т.д.), существует свой набор ответственных за адгезию молекул. В частности, адгезию ЭК к коллагену I типа обеспечивают не только молекулы бнв3 и бнв5, но и б2в1 и б1в1. Этим можно объяснить отсутствие корреляции усиления адгезии ЭК к коллагену I типа с экспрессией интегринового комплекса бнв3. Тем не менее, выявленный нами факт экспрессии интегринового комплекса бнв3 на поверхности ЭК линии EA.Hy926 отличается новизной, так как нам не удалось найти в литературе аналогичных данных в отношении этой линии клеток.

В заключение необходимо отметить, что деление цитокинов на провоспалительные и противовоспалительные оказывается чисто условным с учетом их влияния на ангиогенез. Как показали наши данные и анализ литературы по данному вопросу, цитокины с преимущественно провоспалительным потенциалом могут оказывать как стимулирующее действие на ангиогенез, так и ингибирующее. Классические провоспалительные цитокины IL-1в и IL-8 обладают ярко выраженным проангиогенным действием, TNFб характеризуется двойственным влиянием, а IFNб и INFг ингибируют ангиогенез. Противовоспалительный цитокин IL-4 оказывает стимулирующее действие на ангиогенез in vitro и in vivo (в нашем исследовании этот цитокин стимулировал пролиферацию ЭК), а IL-10, также с противовоспалительными свойствами, по данным литературы, характеризуется антиангиогенными потенциалом. Говоря об ангиогенезе, предпочтительно говорить о позитивных и негативных регуляторах данного процесса. Причем, такое разделение отражает не только направленность действия цитокинов на свойства ЭК, но и учитывает их действие в динамике. Подобно воспалительному процессу, в ходе которого на ранних этапах секретируются цитокины с провоспалительным действием и далее по принципу обратной связи активируется продукция молекул, ограничивающих воспаление, так и при ангиогенезе за позитивной регуляцией следует негативная, что приводит к редукции пролиферативного ответа, миграционной активности, к инактивации протеолиза. При этом ангиогенез включается на стыке поздней фазы воспаления и начала репаративного процесса, когда снижается действие агрессивных факторов микроокружения и формируется благоприятный фон для индукции ангиогенеза. Но необходимо учитывать, что если репаративный ангиогенез при ранозаживлении обладает тенденцией к самоограничению, то ангиогенез в патологических условиях (опухоль или хроническое воспаление) характеризуется преобладанием позитивных регуляторов. В связи с этим опухоль часто сравнивают с хронически незаживающей раной.

Заключение

1. Разработана экспериментальная модель с использованием перевиваемой линии эндотелиальных клеток человека EA.Hy926, пригодная для изучения про- и антиангиогенных эффектов биологически активных веществ;

2. Ростовые факторы VEGF и bFGF стимулировали основные свойства эндотелиальных клеток человека линии EA.Hy926: VEGF более эффективно стимулировал образование капилляроподобных структур, а bFGF сильнее стимулировал пролиферацию клеток этой линии;

3. Провоспалительный цитокин TNFб, который в высокой концентрации ингибировал пролиферацию клеток линии EA.Hy926, стимулировал все остальные изученные функции эндотелиальных клеток человека линии EA.Hy926: повышал интенсивность адгезии, миграции эндотелиальных клеток, экспрессию интегринового комплекса бнв3, продукцию MMP-9 и формирование капилляроподобных структур in vitro;

4. Провоспалительные цитокины IL-1в и IL-8 однонаправлено влияли на свойства эндотелиальных клеток линии EA.Hy926, стимулируя пролиферацию, миграцию, продукцию MMP-9 и адгезию клеток к коллагену I типа, но IL-8 обладал наиболее выраженным стимулирующим действием на пролиферацию, а IL-1в сильнее стимулировал адгезию и продукцию MMP-9;